尤校雷，劉 煒，南力賓，黃少鵬

(邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科，河北邯鄲 056001)

腎透明細胞癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第2位[1]。據(jù)報道，在中國腎透明細胞癌每年新增病例可達30.4萬，死亡病例可達3.1萬[2]。腎透明細胞癌的發(fā)生是一個緩慢的過程，涉及多種基因表達及多種信號通路，但具體發(fā)生的分子遺傳機制尚不清楚[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是PGC-1家族的第一個成員，它最初被鑒定為一個能與核受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ共同作用的含798個氨基酸的蛋白[4]。PGC-1α是線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在多種代謝性疾病中扮演著重要的角色，是氧化代謝和合成代謝的關(guān)鍵節(jié)點，參與了腫瘤代謝的調(diào)節(jié)，可以從氧化代謝和合成代謝2個方面調(diào)控腫瘤細胞的存活、增殖和遷移[5]。但PGC-1α的表達是否可參與腎透明細胞癌發(fā)病及患者預(yù)后尚不明確。因此，本文通過檢測腎透明細胞癌組織中PGC-1α的表達水平，并分析其與預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床上評估腎透明細胞癌患者預(yù)后奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續(xù)性選取2014年2月—2016年12月于邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療的90例腎透明細胞癌患者，取其腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織。手術(shù)標本切除后立即凍入液氮中，再置于-80 ℃冰箱中保存?；颊咧心行?9例，女性31例；年齡38～75(56.16±9.37)歲，<56歲54例，≥56歲36例；腫瘤直徑<5 cm 48例，≥5 cm 42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例；TNM分期[6]：Ⅰ期27例、Ⅱ期19例、Ⅲ期30例、Ⅳ期14例；Fuhrman分級[6]：Ⅰ～Ⅱ級50例、Ⅲ～Ⅳ級40例。納入標準：①符合《中國腎癌診治指南2013版》[6]中的腎透明細胞癌診斷標準，術(shù)后癌組織經(jīng)病理檢查證實為腎透明細胞癌組織；②均接受根治性腎切除術(shù)，術(shù)前未接受放、化療及其他治療；③患者臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②有嚴重感染者；③肝、腎功能嚴重異常者。本研究通過邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR，qRT-PCR)法檢測腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α信使RNA(messengerRNA，mRNA)的表達水平 參照Trizol試劑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號960189)說明書提取腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司，批號SJ-50791H)合成cDNA，然后采用qRT-PCR試劑盒(SYBR Green qPCR Mix，浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號50172)進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系共20 μL：SYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，去離子水7 μL。PGC-1α以GAPDH為內(nèi)參，引物均由天津鼎賽生物基因科技有限公司合成，引物序列見表1。擴增條件：95 ℃，2 min；95 ℃，20 s、60 ℃，20 s、72 ℃，40 s，循環(huán)40次。PGC-1α mRNA的表達水平以2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2免疫組織化學法檢測腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α蛋白的表達水平 制作腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織石蠟切片，脫蠟，再修復抗原，然后用體積分數(shù)為3%的H2O2浸泡10 min，阻斷切片中H2O2酶活性，加入兔抗人PGC-1α單克隆抗體，室溫下孵育1 h，再置于4 ℃過夜，然后用磷酸鹽緩沖液清洗1次，然后加入二抗孵育20 min，最后用蘇木素復染，脫水、封片，顯微鏡觀察。結(jié)果判定[7]：隨機選取5個視野(×400)，由2位專業(yè)人員完成評定。染色強度：無(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)；陽性細胞占比：<5%(0分)、5%～25%(1分)、26～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。以染色強度評分×陽性細胞占比評分值作為判斷PGC-1α蛋白陽性的依據(jù)，兩者乘積≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.3 預(yù)后指標及隨訪方法所有患者均于手術(shù)后采用電話或患者入院復查等方式進行5年隨訪，隨訪起始日期為術(shù)后第1天，隨訪終止日期為5年隨訪期滿或者隨訪期內(nèi)患者死亡時。記錄隨訪5年內(nèi)腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者死亡情況，統(tǒng)計無進展生存率和總生存率。無進展生存期：腎透明細胞癌患者術(shù)后第1天至隨訪到腫瘤進展(復發(fā)或轉(zhuǎn)移)、因任何原因死亡或隨訪期滿的時間；總生存期：腎透明細胞癌患者術(shù)后第1天至因任何原因死亡或隨訪期滿的時間。

2 結(jié) 果

2.1 腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α mRNA和蛋白表達水平比較PGC-1α蛋白陽性主要表達于細胞核，呈棕黃色或棕褐色(圖1)。與癌旁正常腎組織比較，腎透明細胞癌組織中PGC-1α mRNA表達水平和PGC-1α蛋白陽性表達率較低(P<0.05，表2)。

2.2 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系PGC-1α蛋白表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05，表3)。

A：腎透明細胞癌；B：癌旁正常腎組織。圖1 腎透明細胞癌及癌旁正常腎組織中PGC-1α蛋白表達(免疫組織化學染色，×400)

表2 腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α mRNA和蛋白表達水平的比較

表3 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

2.3 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系90例腎透明細胞癌患者經(jīng)過5年隨訪，無進展生存39例，總生存57例，死亡33例(因其他原因死亡4例，因腫瘤進展死亡29例)；隨訪期間復發(fā)21例，轉(zhuǎn)移26例，其中41例患者行術(shù)后輔助治療(35例行靶向治療)，局部復發(fā)灶切除術(shù)12例。PGC-1α蛋白陰性患者5年無進展生存率為36.11%(26/72)低于PGC-1α蛋白陽性患者72.22%(13/18)(χ2=7.217，P=0.007，圖2A)；PGC-1α蛋白陰性患者5年總生存率為56.94%(41/72)低于PGC-1α蛋白陽性患者88.89%(16/18)(χ2=5.278，P=0.022，圖2B)。

A：5年內(nèi)無進展生存率；B：5年內(nèi)總生存率。圖2 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 影響腎透明細胞癌患者預(yù)后的危險因素分析logistic單因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級、PGC-1α蛋白均是影響腎透明細胞癌患者預(yù)后不良的危險因素(P<0.05，表4)；logistic多因素分析顯示，TNM Ⅲ～Ⅳ期、Fuhrman Ⅲ～Ⅳ級、PGC-1α蛋白陰性是影響腎透明細胞癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05，表5)。

表4 影響腎透明細胞癌患者預(yù)后的單因素分析

表5 影響腎透明細胞癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

腎細胞癌約占原發(fā)腎腫瘤的85%，而腎透明細胞癌約占腎細胞癌的67.4%～83.2%，臨床上癥狀少，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，其惡性程度較高，且轉(zhuǎn)移早、預(yù)后較差，其發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多過程、多基因、多原因累加的繁瑣過程[8]。

PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，其充當轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但沒有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；PGC-1α可與識別其靶基因中特定序列的各種轉(zhuǎn)錄因子和核受體結(jié)合，雖然其他轉(zhuǎn)錄共激活因子具有促進染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄的內(nèi)在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但缺乏酶活性；因此，PGC-1α通過充當其他具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)的錨平臺，并通過促進轉(zhuǎn)錄機制的組裝以觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能[9-10]。PGC-1α主要存在于高能量需求且富含線粒體的組織中，如心臟、骨骼肌、褐色脂肪組織、腦、肝、腎等，其他組織則表達較少或幾乎無表達[11-12]。在氧化代謝活躍的器官和組織中PGC-1α的表達量比較高，說明PGC-1α與機體的能量代謝有著密不可分的聯(lián)系[13-14]。CHANG等[15]研究顯示，PGC-1α在肝細胞癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。YIN等[16]研究顯示，PGC-1α在胰腺癌細胞中呈低表達，抑制PGC-1α水平可抑制胰腺癌細胞增殖，誘導其凋亡。本研究結(jié)果顯示，腎透明細胞癌組織中PGC-1α mRNA表達水平和PGC-1α蛋白陽性表達率低于癌旁正常腎組織，與上述研究結(jié)果[15-16]相似，提示PGC-1α異常低表達可能與腎透明細胞癌的發(fā)病有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級相關(guān)，表明PGC-1α可能影響腎透明細胞癌的發(fā)展。

PGC-1α是氧化代謝的主要調(diào)節(jié)劑，癌癥治療(如放射和化學療法)已被證明會在腫瘤中誘導氧化應(yīng)激，而氧自由基的產(chǎn)生可以通過涉及抗氧化酶的機制誘導細胞死亡或?qū)χ委煹牡挚?，因此PGC-1α的調(diào)節(jié)可能會干擾對治療的反應(yīng)[17]。PAKU等[18]研究報道，sirtuins家族去乙酰化酶3可通過調(diào)控超氧化物歧化酶2和PGC-1α影響結(jié)直腸癌細胞的化療耐藥，是結(jié)直腸癌患者的獨立預(yù)后因素。另有研究顯示，結(jié)直腸癌組織中PGC-1α mRNA低表達，PGC-1α mRNA高表達患者具有更高的3年生存率[19]。本研究顯示，PGC-1α蛋白陰性患者5年無進展生存率及總生存率均低于PGC-1α蛋白陽性患者，與王婷婷等[19]研究類似；同時研究發(fā)現(xiàn)，TNM Ⅲ～Ⅳ期、Fuhrman Ⅲ～Ⅳ級、PGC-1α蛋白陰性是影響腎透明細胞癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素，表明PGC-1α在腎透明細胞癌進程中發(fā)揮作用，可作為腎透明細胞癌患者預(yù)后不良的一個參考指標，臨床在關(guān)注腎透明細胞癌TNM分期及Fuhrman分級的同時，還需關(guān)注PGC-1α異常表達對患者預(yù)后的影響。

綜上所述，腎透明細胞癌組織中PGC-1α呈低表達，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級以及患者預(yù)后密切相關(guān)。但本研究尚未深入探討PGC-1α與腎透明細胞癌預(yù)后不良病理機制的關(guān)系，仍需進一步研究。