柳勤海，楊 馨#，李曉靜，蘭平秀，李 凡，譚冠林

? 藥材與資源 ?

侵染三七的三七Y病毒和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒PCR同步檢測(cè)技術(shù)

柳勤海1，楊 馨1#，李曉靜1，蘭平秀1，李 凡1*，譚冠林2*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代教育技術(shù)中心，云南 昆明 650201

建立一種高效、快速、準(zhǔn)確地同步檢測(cè)侵染三七的2種病毒——三七Y病毒（virus Y，PnVY）和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的雙重PCR技術(shù)。分別以單一感染PnVY或TYLCCNV及復(fù)合侵染了這2種病毒的染病三七植株為樣品，CTAB法提取葉片總核酸作為模板，根據(jù)GenBank上已登錄的PnVY和TYLCCNV這2種病毒核酸序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物。通過單一PCR技術(shù)明確染病三七樣品PnVY和TYLCCNV的發(fā)生情況，篩選出可用于一步法雙重PCR檢測(cè)PnVY和TYLCCNV的引物組合及引物濃度，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，驗(yàn)證一步法雙重PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。建立的一步法雙重PCR檢測(cè)技術(shù)能同步有效地檢測(cè)三七病樣中的PnVY和TYLCCNV，檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限點(diǎn)為核酸原液的0.01稀釋倍數(shù)，特異性強(qiáng)。所建立的一步法雙重PCR檢測(cè)技術(shù)可以高效、快速、準(zhǔn)確、特異地同步檢測(cè)三七樣品中的PnVY、TYLCCNV 2種病毒。

三七；病毒檢測(cè)；三七Y病毒；中國(guó)番茄黃化曲葉病毒；雙重PCR技術(shù)

三七(Burk.) F. H. Chen是與人參C. A. Mey.、西洋參L.同屬于五加科（Araliaceae）人參屬L.的多年生藥用植物，在我國(guó)已有400多年的栽培歷史，是一種名貴中藥材，其主要成分有三七總皂苷、黃酮、三七素、揮發(fā)油、糖類、氨基酸及微量元素等[1]，對(duì)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等疾病具有顯著而獨(dú)特的療效，藥用和醫(yī)療保健價(jià)值高[2]。因三七的種植對(duì)氣候要求較高，長(zhǎng)期以來我國(guó)三七的主要產(chǎn)區(qū)為云南文山。近年來，由于三七需求量的擴(kuò)大，以及受三七連作障礙的影響，三七的栽培范圍逐漸擴(kuò)大，在云南的紅河、玉溪、昆明、曲靖，以及廣西等地都有一定規(guī)模的種植。隨著三七種植面積的不斷擴(kuò)大和種植年限的增加，三七病毒病的發(fā)生也日益嚴(yán)重[3]。云南主要三七種植區(qū)的病毒病發(fā)病率逐年增加，對(duì)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。1999年文山地區(qū)爆發(fā)的三七病毒病，導(dǎo)致當(dāng)?shù)囟鄶?shù)三七園發(fā)病率高達(dá)60%[4]，嚴(yán)重影響三七的產(chǎn)量與品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，侵染三七的病毒及衛(wèi)星病毒主要有8種，分別為馬鈴薯Y病毒屬的三七Y病毒（Y，PnVY）[5]，菜豆金色花葉病毒屬的中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）及其伴隨的β衛(wèi)星分子（tomato yellow leaf curl China betasatellite）[6]，煙草花葉病毒屬的番茄花葉病毒（tomato mosaic virus）[7]，黃瓜花葉病毒屬的黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus）[8]，正番茄斑萎病毒屬的番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt orthotospovirus）[9]，全病毒屬的三七A病毒（A）[10]，以及馬鈴薯卷葉病毒屬的煙草扭脈病毒（Tobacco vein distorting virus）[11]。在對(duì)云南省主要三七種植區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PnVY和TYLCCNV的檢出率最高，二者在田間大多以復(fù)合侵染形式出現(xiàn)[12]。

三七病毒病病原鑒定的方法主要有常規(guī)生物學(xué)技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)、電鏡技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)[13]。常規(guī)生物學(xué)檢測(cè)主要包括寄主范圍測(cè)定、傳播途徑測(cè)定、鑒別寄主反應(yīng)等，需要耗費(fèi)大量時(shí)間，還受到季節(jié)、環(huán)境等限制，而三七的生長(zhǎng)對(duì)氣候要求較高，種植難度較大。電鏡技術(shù)常被運(yùn)用到植物病毒的鑒定中，但對(duì)制備病毒樣品材料要求較高且設(shè)備昂貴，限制了電鏡技術(shù)的廣泛應(yīng)用。血清學(xué)技術(shù)對(duì)病毒的檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，但操作較復(fù)雜，還需制備相應(yīng)的抗體，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。常規(guī)PCR檢測(cè)方法靈敏度高，整個(gè)檢測(cè)過程所需時(shí)間短，但常規(guī)PCR技術(shù)每次只能檢測(cè)一種病毒，對(duì)于多種病毒復(fù)合侵染的檢測(cè)需要重復(fù)操作，整體耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。多重PCR技術(shù)通過在一次擴(kuò)增反應(yīng)中加入多對(duì)病毒的特異性檢測(cè)引物，實(shí)現(xiàn)了多種病毒的同時(shí)檢測(cè)，在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，減少了試劑耗材的損耗，極大地節(jié)約了檢測(cè)成本。因此，目前多重PCR檢測(cè)技術(shù)在作物多種病毒的同步檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，董代幸等[14]建立了能夠同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leafroll virus，PLRV）的一步法多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)；曾靜等[15]建立了煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、CMV、PVY和PVX4種病毒的多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)；薛楊等[16]建立了葡萄2種檢疫性病毒番茄環(huán)斑病毒（tomato ringspot virus，ToRSV）和煙草環(huán)斑病毒（tobacco ringspot virus，TRSV）的多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種病毒的快速同步檢測(cè)。

三七作為一種名貴中藥材，在云南、廣西等地種植規(guī)模較大，病毒病的發(fā)生嚴(yán)重影響了三七的產(chǎn)量與品質(zhì)。目前，侵染三七的病毒種類較多，且DNA病毒和RNA病毒都有報(bào)道，病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象普遍。三七病毒病的病原鑒定目前多采用常規(guī)PCR技術(shù)，尚未見三七病毒多重PCR檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。課題組前期調(diào)查了云南主要三七種植區(qū)病毒病的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)三七病毒病的病原中PnVY為優(yōu)勢(shì)病毒，在各種植區(qū)均有發(fā)生。三七病毒病的發(fā)生率隨著種植年限的增加相應(yīng)的增高，且復(fù)合侵染現(xiàn)象較為普遍，其中PnVY＋TYLCCNV 2種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象最為普遍，在文山市、昆明市、紅河州、曲靖市的平均檢出率超過20%，在一些種植區(qū)PnVY＋TYLCCNV的復(fù)合侵染檢出率甚至高達(dá)50%[11]。為此，本研究建立了PnVY（RNA病毒）和TYLCCNV（DNA病毒）的同步檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PnVY和TYLCCNV這2種核酸性質(zhì)完全不一樣的病毒的同步檢測(cè)。該技術(shù)的建立與應(yīng)用為三七生產(chǎn)中監(jiān)測(cè)PnVY和TYLCCNV的發(fā)生提供了技術(shù)支撐，也將為其他構(gòu)建同步檢測(cè)DNA病毒和RNA病毒技術(shù)體系提供參考。

1 材料

1.1 三七病毒病樣品

采自云南昆明、文山、玉溪等地單獨(dú)感染PnVY、單獨(dú)感染TYLCCNV以及復(fù)合感染PnVY、TYLCCNV的田間染病三七(Burk.) F. H. Chen葉片樣品，保存于實(shí)驗(yàn)室?80 ℃超低溫冰箱。

1.2 試劑

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB，分析純）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H?）、一步法RT-PCR試劑盒PrimeScript?（One Step RT-PCR Kit Ver.2）、克隆載體pMD19-T Vector等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；大腸桿菌DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中PnVY（GQ916624）和TYLCCNV（KJ477327）的基因組全序列，選取保守區(qū)域每一種病毒各設(shè)計(jì)3對(duì)特異性檢測(cè)引物，盡量使2種病毒的引物退火溫度相近。以單獨(dú)侵染PnVY或TYLCCNV的三七樣品總核酸為模板對(duì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR驗(yàn)證，選取可高效、特異檢測(cè)PnVY和TYLCCNV的引物各1對(duì)，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選出PnVYdF4/PnVYcRa2T、YLCCNVF1/TYLCCNVR1用于雙重PCR檢測(cè)技術(shù)體系的構(gòu)建和優(yōu)化。引物由深圳華大基因科技公司合成，引物序列見表1。

表1 PnVY和TYLCCNV雙重PCR檢測(cè)引物序列

2.2 總核酸提取

采用CTAB法[17]提取染病三七植株葉片總核酸，提取的總核酸保存于?20 ℃冰箱。

2.3 一步法雙重PCR檢測(cè)體系初步建立

利用田間采集到并經(jīng)過常規(guī)PCR/RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，確定同時(shí)感染了PnVY、TYLCCNV的樣品作為核酸模板。由于PnVY為RNA病毒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增前需要先將病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而TYLCCNV為DNA病毒，其核酸模板可以直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了減少操作步驟和縮短檢測(cè)時(shí)間，且兼顧PnVY為RNA病毒的特性，本雙重PCR檢測(cè)技術(shù)采用一步法RT-PCR，反應(yīng)進(jìn)行時(shí)將所有檢測(cè)引物、試劑、核酸模板等一次性全部加入，一步完成。根據(jù)PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書設(shè)計(jì)一步法多重檢測(cè)的反應(yīng)體系：5.0 μL 2×1 step Buffer，2.8 μL RNase Free water，0.4 μL PrimeScript?One Step Enzyme Mix，10 μmol/L的PnVY、TYLCCNV上、下游引物各0.2 μL，RNA模板1.0 μL，共10 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃、2 min，然后94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min，4 ℃冷卻保存。

2.4 一步法雙重PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

初步建立的PnVY、TYLCCNV一步法雙重PCR檢測(cè)體系雖可以實(shí)現(xiàn)對(duì)2種病毒的同步檢測(cè)，但檢測(cè)效果不穩(wěn)定，為此，進(jìn)一步對(duì)該檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化，主要對(duì)反應(yīng)體系中引物的濃度（體積）進(jìn)行了調(diào)整優(yōu)化，設(shè)置4組引物濃度梯度組合（表2）用于復(fù)合感染PnVY、TYLCCNV三七樣品的擴(kuò)增，以此獲得最佳引物濃度組合。

引物原始濃度均為10 μmol/L

The original concentration of primers was 10 μmol/L

2.5 一步法雙重PCR檢測(cè)體系的特異性分析

根據(jù)優(yōu)化的一步法雙重PCR檢測(cè)體系，選取部分經(jīng)常規(guī)PCR驗(yàn)證的田間復(fù)合感染PnVY、TYLCCNV的三七樣品進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取7.5 μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠于0.5×TBE緩沖液中100 V電壓下電泳45 min，觀察結(jié)果。利用生工生物工程（上海）股份有限公司的SanPerp柱式DNA膠回收試劑盒，將目標(biāo)擴(kuò)增條帶進(jìn)行割膠回收，然后將割膠回收產(chǎn)物與pMD 19-T Vector連接進(jìn)行克隆，經(jīng)PCR驗(yàn)證后，每個(gè)擴(kuò)增片段選3個(gè)陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所獲序列在NCBI的BLAST上進(jìn)行比對(duì)分析。

2.6 一步法雙重PCR檢測(cè)體系的靈敏度分析

選取經(jīng)常規(guī)PCR驗(yàn)證的田間復(fù)合侵染了PnVY和TYLCCNV的三七樣品總核酸作為模板，樣品總核酸質(zhì)量濃度為1.0～1.3 μg/μL，進(jìn)行模板核酸10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為1～1×10?4倍，在經(jīng)過優(yōu)化后的一步法雙重PCR反應(yīng)體系下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，分析其檢測(cè)靈敏度。

2.7 一步法雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)田間三七樣品檢測(cè)

運(yùn)用優(yōu)化的PnVY、TYLCCNV一步法雙重PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)采自田間的109個(gè)三七病毒病樣品進(jìn)行PnVY、TYLCCNV檢測(cè)，任意選取其中的3個(gè)同時(shí)擴(kuò)增出2條目標(biāo)條帶的樣品，對(duì)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)連接、克隆后測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)一步驗(yàn)證一步法雙重PCR檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3 結(jié)果與分析

3.1 一步法雙重PCR檢測(cè)體系的建立

根據(jù)GenBank中登錄的PnVY、TYLCCNV基因組全序列設(shè)計(jì)并篩選出可用于一步法雙重檢測(cè)PnVY、TYLCCNV的特異性檢測(cè)引物，根據(jù)PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書設(shè)計(jì)一步法多重檢測(cè)的初始體系，利用該體系對(duì)復(fù)合侵染PnVY、TYLCCNV的三七樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，存在部分樣品只能擴(kuò)增出1種病毒對(duì)應(yīng)的目標(biāo)條帶或其中1條目標(biāo)條帶較弱、非特異性條帶較多等現(xiàn)象。針對(duì)這些情況，對(duì)該一步法雙重檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，主要對(duì)反應(yīng)體系中特異檢測(cè)引物的濃度進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，當(dāng)引物體積為：PnVYdF4/PnVYcRa2（10 μmol/L）各0.35 μL，TYLCCNVF1/TYLCCNVR1（10 μmol/L）各0.25 μL時(shí)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果顯示該體系能同時(shí)且穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出與預(yù)期大小一致的2條特異性條帶，大小分別為650 bp（TYLCCNV）、1032 bp（PnVY，圖1）。最終確定的一步法雙重PCR反應(yīng)體系為：5.0 μL 2×1 step Buffer，2.4 μL RNase Free water，0.4 μL PrimeScript?One Step Enzyme Mix，引物濃度為：PnVYdF4/PnVYcRa2（10 μmol/L）各0.35 μL，TYLCCNVF1/TYLCCNVR1（10 μmol/L）各0.25 μL，RNA模板1.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃、2 min然后94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min，4 ℃冷卻保存。

3.2 一步法雙重PCR檢測(cè)技術(shù)的特異性

以確定復(fù)合侵染PnVY、TYLCCNV的三七樣品、田間健康的三七樣品核酸作為模板，利用優(yōu)化后的檢測(cè)體系對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在復(fù)合侵染的三七樣品中能擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目標(biāo)條帶，且條帶單一；健康的三七樣品未擴(kuò)增到目標(biāo)條帶（圖2）。對(duì)獲得的1032 bp（PnVY）、650 bp（TYLCCNV）擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行割膠純化、克隆測(cè)序，經(jīng)NCBI序列比對(duì)，1032 bp的擴(kuò)增片段與GenBank中登錄的PnVY核苷酸序列一致性最高，達(dá)97%。650 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank中登錄的TYLCCNV核苷酸序列一致性最高，達(dá)94%，表明所建立的一步法雙重PCR技術(shù)從染病的三七葉片中得到的1032、650 bp條帶是PnVY、TYLCCNV相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，所建立的一步法雙重檢測(cè)技術(shù)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物真實(shí)可信，證明該體系對(duì)PnVY、TYLCCNV具有良好的檢測(cè)特異性，能夠?qū)ν瑫r(shí)感染PnVY和TYLCCNV的三七樣品開展快速檢測(cè)。

M-Marker 1～4-復(fù)合感染PnVY和TYLCCNV的三七樣品 5-健康三七樣品

3.3 一步法雙重PCR檢測(cè)體系的靈敏度分析

對(duì)經(jīng)驗(yàn)證田間復(fù)合感染了PnVY、TYLCCNV的三七樣品模板核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為1～1×10?4倍，共5個(gè)濃度梯度。將上述5個(gè)不同濃度梯度的核酸作為模板，利用優(yōu)化后的一步法雙重PCR檢測(cè)體系同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，核酸濃度為1、0.1倍時(shí)，2種病毒的擴(kuò)增目標(biāo)條帶較清晰，易于辨識(shí)；當(dāng)核酸濃度為0.01倍時(shí)，PnVY、TYLCCNV 2種病毒依然能檢測(cè)到，但目標(biāo)條帶相對(duì)較弱（圖3）。當(dāng)核酸濃度為1×10?3倍時(shí)，依然可以檢測(cè)到PnVY，但TYLCCNV的擴(kuò)增條帶很弱；核酸濃度為1×10?4倍時(shí)，均無法檢測(cè)到PnVY和TYLCCNV。因此，所建立的一步法雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)三七樣品中PnVY和TYLCCNV的有效檢測(cè)最低模板核酸稀釋度為0.01倍。

3.4 一步法雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)田間三七樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采自云南文山、昆明、紅河地區(qū)三七種植園的109個(gè)疑似病毒病樣品進(jìn)行PnVY、TYLCCNV 檢測(cè)。結(jié)果顯示，利用優(yōu)化后的一步法雙重PCR檢測(cè)技術(shù)能夠快速、高效、準(zhǔn)確地對(duì)疑似三七病毒病樣品中的PnVY、TYLCCNV進(jìn)行檢測(cè)鑒定。從2種病毒的檢測(cè)結(jié)果可看出，當(dāng)前云南主要三七種植區(qū)田間PnVY和TYLCCNV復(fù)合侵染的現(xiàn)象依然比較普遍，復(fù)合侵染率在28.6%～36.2%，其中文山地區(qū)2種病毒的復(fù)合侵染率最高，為36.2%，昆明的最低，但復(fù)合侵染率也在28%以上（表3）。另外，從整體來講，2種病毒中，PnVY的檢出率最高，不同地區(qū)三七的PnVY侵染率都在60%以上，其中紅河地區(qū)的檢出率最高，達(dá)79.4%；TYLCCNV的平均檢出率為49.3%，其中文山地區(qū)的檢出率最高，為57.4%。

M-Marker 1～5-依次為稀釋1、0.1、0.01、1×10?3、1×10?4的三七樣品核酸稀釋液

表3 不同地區(qū)三七樣品上PnVY和TYLCCNV的檢測(cè)情況

4 討論

三七是我國(guó)名貴的中藥材，具有較高的藥用保健價(jià)值，近年來，隨著其在社會(huì)上的認(rèn)可度提高，三七的需求量呈上升趨勢(shì)[18]。三七的生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)，在生長(zhǎng)過程中易受到病毒的侵染，且由于介體昆蟲的傳播，病毒病極容易大范圍常年發(fā)生，嚴(yán)重影響三七的產(chǎn)量與品質(zhì)。據(jù)本課題組多年來對(duì)云南文山、昆明、紅河、曲靖等地的三七病毒病調(diào)查及相關(guān)病毒檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)病毒病在云南三七種植區(qū)普遍發(fā)生，年平均發(fā)病率均在5%以上，且種植年限越長(zhǎng)發(fā)病率越高，病毒病已成為三七上僅次于根腐病的主要病害[11]。三七病毒病的癥狀表現(xiàn)有多種類型，主要有皺縮、褪綠、缺刻、白化、黃化、卷葉、壞死等，同一植株上往往表現(xiàn)出多種癥狀類型。目前已在三七上發(fā)現(xiàn)ToMV[7]、CMV[8]、TYLCCNV和TYLCCNB[6]、PnVY[5,19]以及TVDV[11]等多種病毒，其中，PnVY已成為侵染云南三七病毒病的主要致病病毒[11]，而TYLCCNV在田間三七病毒病樣品中檢出率也較高，而且2者存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。為了能夠?qū)μ镩g三七樣品及病毒的傳毒媒介昆蟲進(jìn)行高效、快速和準(zhǔn)確的病毒檢測(cè)，為病害發(fā)生的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供技術(shù)支撐，有必要建立能同時(shí)對(duì)田間發(fā)生和危害較為普遍的PnVY和TYLCCNV開展快速、靈敏及準(zhǔn)確檢測(cè)的技術(shù)體系。

目前報(bào)道的植物病毒多重PCR/RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，所檢測(cè)病毒的核酸性質(zhì)大多是一致的，DNA病毒與RNA病毒混合侵染植株的多重PCR/RT-PCR檢測(cè)技術(shù)報(bào)道較少，唐瑤等[20]建立了同步檢測(cè)甘蔗上3種RNA病毒——高粱花葉病毒（sorghum mosaic virus，SrMV）、甘蔗花葉病毒（sugarcane mosaic virus，SCMV）、甘蔗黃葉病毒（sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）以及1種DNA病毒——甘蔗桿狀病毒（sugarcane bacilliform virus，SCBV）的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，適用于目前甘蔗病毒病中常發(fā)的復(fù)合類型的檢測(cè)。涉及2種核酸性質(zhì)病毒的多種PCR檢測(cè)技術(shù)與核酸性質(zhì)一致的病毒多重PCR檢測(cè)技術(shù)相比，要考慮到DNA組分病毒無需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而RNA病毒則需基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA才可進(jìn)行PCR檢測(cè)。本研究所涉及到的2種病毒，PnVY為RNA病毒，TYLCCNV為DNA病毒，這是2種核酸性質(zhì)不同的病毒，因此，為了兼顧PnVY的RNA特性及TYLCCNV的DNA特性，且減少操作步驟、縮短檢測(cè)時(shí)間和節(jié)約檢測(cè)成本，本研究在核酸提取時(shí)采用了能同時(shí)將RNA和DNA都提取出來的CTAB法，只提一次核酸，就能同時(shí)將染病植物里復(fù)合感染的RNA病毒和DNA病毒的核酸都提取出來，且核酸的完整性較好，不影響后續(xù)的PCR檢測(cè)[17]。另外，設(shè)計(jì)的雙重檢測(cè)技術(shù)采用一步法RT-PCR，兼顧了RNA病毒檢測(cè)時(shí)需要先進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄然后才能以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過對(duì)反應(yīng)條件與反應(yīng)體系的反復(fù)摸索優(yōu)化，最終建立起可同時(shí)檢測(cè)三七上的PnVY和TYLCCNV的一步法多重PCR檢測(cè)體系，極大地提高了病毒的檢測(cè)效率。所建立的檢測(cè)技術(shù)體系對(duì)PnVY和TYLCCNV同步檢測(cè)的模板核酸稀釋梯度僅達(dá)到0.01，檢測(cè)靈敏度與其他核酸性質(zhì)相同的植物病毒多重檢測(cè)技術(shù)相比要低[21-22]。該技術(shù)對(duì)PnVY的檢測(cè)靈敏度要比TYLCCNV高10倍，目前尚不清楚這種差異是否與檢測(cè)體系中針對(duì)PnVY的反轉(zhuǎn)錄過程有關(guān)。但該技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)對(duì)PnVY和TYLCCNV的同步檢測(cè)，為田間三七上發(fā)生的PnVY、TYLCCNV的檢測(cè)鑒定提供了便利，有利于及時(shí)、快速開展相關(guān)病毒病的防治工作。此外，楊馨[12]從表現(xiàn)皺縮癥狀的三七果皮上檢測(cè)到PnVY，推測(cè)PnVY具有種子傳播的特性。因此，該技術(shù)除了運(yùn)用于田間三七葉片等組織PnVY、TYLCCNV的檢測(cè)鑒定外，還可應(yīng)用于三七果實(shí)甚至傳播介體昆蟲的PnVY和TYLCCNV鑒定，通過該技術(shù)將有助于加強(qiáng)三七育種育苗環(huán)節(jié)的病毒病預(yù)防工作。

PnVY的寄主范圍除三七外還有茄科的黃煙、辣椒，豆科的豇豆和菜豆等[12]，隨著介體昆蟲的傳播，不排除PnVY在上述作物發(fā)生流行的可能性。本研究所建立的同步檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PnVY、TYLCCNV的快速檢測(cè)，也將為其它作物上此2種病毒的鑒定與防治工作提供技術(shù)支撐。目前，該技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)PnVY、TYLCCNV 2種病毒的同步檢測(cè)，為了進(jìn)一步提高三七病毒病病原鑒定的檢測(cè)效率，后期將進(jìn)一步研究更多病毒種類數(shù)量及病毒組合類型的多重檢測(cè)技術(shù)，如在實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)PnVY、TYLCCNV的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)與TYLCCNB、PnVA、TVDV、CMV、ToMV等的同步檢測(cè)，進(jìn)一步提高三七病毒病病原鑒定的全面性、高效性、準(zhǔn)確性，為三七病毒病的預(yù)防和控制提供技術(shù)支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Simultaneous detection technology of PnVY and TYLCCNV inby PCR

LIU Qin-hai1, YANG Xin1, LI Xiao-jing1, LAN Ping-xiu1, LI Fan1, TAN Guan-lin2

1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 2. Modern Education Technology Center, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

To establish an efficient, rapid and accurate method for the simultaneous detection of panax virus Y (PnVY) and tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV) inby dual PCR.Diseasedleaves of single infection of PnVY, or TYLCCNV, and co-infection of PnVY and TYLCCNV were selected as test samples. Total RNAs were extracted using CTAB method. Specific detection primers were designed according to the nucleic acid sequences of the two viruses registered on GenBank. The occurrence of PnVY and TYLCCNV insamples were confirmed by conventional PCR, then the appropriate primer combination and concentration were screened for the dual detection assay about PnVY and TYLCCNV by one-step PCR, and the amplification conditions were also optimized. The accuracy and specificity of the PCR assay were tested by cloning and sequencing the amplified DNA fragments.The established one-step dual PCR detection technology could simultaneously and effectively detect PnVY and TYLCCNV in the diseasedsamples with higher detection sensitivity and specificity. The detection limits of the dual PCR method were 10-2dilution for both PnVY and TYLCCNV.The established one-step dual PCR detection technique can detect PnVY and TYLCCNV viruses simultaneously in the diseasedsamples efficiently, quickly, accurately and specifically.

(Burk.) F. H. Chen; virus detection; panax virus Y; tomato yellow leaf curl China virus; dual PCR

R286.2

A

0253 - 2670(2022)24 - 7864 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.023

2022-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31660039）；云南省專家工作站（202005AF150040）

柳勤海（1999—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊《緦W(xué)。E-mail: hzliuqinhai@outlook.com

李 凡（1970—），男，教授，研究方向?yàn)橹参锊《緦W(xué)。E-mail: fanli@ynau.edu.cn

譚冠林（1973—），女，副研究員，研究方向?yàn)橹参锊《緦W(xué)。E-mail: gltan@126.com

#共同第一作者：楊 馨（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)橹参锊《緦W(xué)。E-mail: yangxin8046@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]