葛 楠，李志能，閆廣利，孫 暉，張喜武，李 丹，王喜軍*

經(jīng)典名方固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜研究

葛 楠1，李志能1，閆廣利1，孫 暉1，張喜武1，李 丹2，王喜軍1*

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部經(jīng)典名方有效性評(píng)價(jià)及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 京津冀聯(lián)創(chuàng)藥物研究（北京）有限公司，北京 100025

建立經(jīng)典名方固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)15批固陰煎基準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為其基準(zhǔn)樣品質(zhì)量控制研究提供參考。采用Waters SymmetryRC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～10 min，0～5%乙腈；10～20 min，5%～10%乙腈；20～33 min，10%～11%乙腈；33～42 min，11%～18%乙腈；42～50 min，18%乙腈；50～80 min，18%～40%乙腈；80～100 min，40%～100%乙腈），體積流量1 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣體積5 μL，建立固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行方法學(xué)考察。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）對(duì)15批固陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，匹配共有峰，并對(duì)各共有峰進(jìn)行歸屬研究。結(jié)合聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對(duì)共有峰結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)不同批次固陰煎基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量差異，并找尋造成批間質(zhì)量差異的主要成分及藥味來(lái)源。固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證良好，15批固陰煎基準(zhǔn)樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9。共標(biāo)定了24個(gè)共有峰，經(jīng)與混合對(duì)照品比對(duì)，鑒定11個(gè)色譜峰，分別為1號(hào)峰沒(méi)食子酸、3號(hào)峰5-羥甲基糠醛、6號(hào)峰莫諾苷、7號(hào)峰綠原酸、9號(hào)峰馬錢(qián)苷、11號(hào)峰甘草苷、12號(hào)峰金絲桃苷、13號(hào)峰毛蕊花糖苷、14號(hào)峰3,6′-二芥子?；崽恰?2號(hào)峰甘草酸、23號(hào)峰五味子醇甲。聚類分析和PCA可將15批基準(zhǔn)樣品分為2類，分析結(jié)果可互相印證。OPLS-DA（VIP＞1）找到莫諾苷、5-羥甲基糠醛、綠原酸在內(nèi)的11個(gè)差異性色譜峰，分別歸屬于單味藥制遠(yuǎn)志、炒菟絲子、山茱萸、炙甘草和熟地黃。建立的固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分離度好、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，除人參和炒山藥以外均有表征，可為其后續(xù)制劑開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制研究提供參考。

經(jīng)典名方；固陰煎；基準(zhǔn)樣品；HPLC；指紋圖譜；質(zhì)量控制；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；沒(méi)食子酸；5-羥甲基糠醛；莫諾苷；綠原酸；馬錢(qián)苷；甘草苷；金絲桃苷；毛蕊花糖苷；3,6′-二芥子?；崽牵桓什菟?；五味子醇甲；遠(yuǎn)志；菟絲子；山茱萸；甘草；地黃；人參；山藥；五味子

經(jīng)典名方是指“至今仍廣泛應(yīng)用、療效確切、具有明顯特色與優(yōu)勢(shì)的古代中醫(yī)典籍所記載的方劑”。如何實(shí)現(xiàn)經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品質(zhì)量控制技術(shù)的突破，以建立起規(guī)范、完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，是經(jīng)典名方制劑研制面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。固陰煎（Guyin Decoction，GYJ）是國(guó)家中醫(yī)藥管理局頒布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》第64首方劑[1]。首載于張景岳《景岳全書(shū)》（公元1624年）卷之五十一德集?新方八陣之固陣篇中，原文記載：“固陰煎：治陰虛滑泄，帶濁淋遺，及經(jīng)水因虛不固等證，此方專主肝腎。人參隨宜，熟地三、五錢(qián)，山藥（炒）二錢(qián)，山茱萸一錢(qián)半，遠(yuǎn)志（炒）七分，炙甘草一、二錢(qián)，五味十四粒，菟絲子（炒香）二、三錢(qián)。水二盅，煎七分，食遠(yuǎn)溫服”[2]。

固陰煎在《景岳全書(shū)》中出現(xiàn)11處，主要用于治療遺精、小便淋濁、崩淋經(jīng)漏、腎虛經(jīng)亂；思慮過(guò)度，以致遺精滑泄及經(jīng)脈錯(cuò)亂，病在肝腎不固；有傷沖任之絡(luò)而惡露不止；元?dú)馓撊醵鴰拢幪摶撍玛幫?；婦人交接，陰戶即出血者；若肝腎陰虛不守，脾腎氣虛下陷而多帶[3]。后世古籍中均采用固陰煎治療上述病證。現(xiàn)代臨床研究表明，固陰煎治療多囊卵巢綜合征[4-5]、更年期綜合征[6]、腎虛型月經(jīng)過(guò)少[7]、月經(jīng)間期出血[8]、功能性子宮出血[9-10]等婦科疾病具有顯著療效。

中藥指紋圖譜可以科學(xué)、系統(tǒng)、全面地反映中藥及中藥復(fù)方的復(fù)雜化學(xué)成分體系[11]，聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）技術(shù)可以將多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分類、整合、降維處理，可應(yīng)用于對(duì)指紋圖譜共有峰結(jié)果的初步探索[12]，二者結(jié)合可以更加系統(tǒng)、全面地評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量，有助于尋找造成中藥復(fù)方批間質(zhì)量差異的主要成分（色譜峰），已被廣泛用于經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)研究。目前，經(jīng)典名方固陰煎的相關(guān)研究主要集中于臨床應(yīng)用方面，對(duì)其質(zhì)量控制方面的研究相對(duì)較少。因此，本課題對(duì)經(jīng)典名方固陰煎進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，期望為全面控制和評(píng)價(jià)固陰煎基準(zhǔn)樣品提供研究依據(jù)，為其經(jīng)典名方復(fù)方制劑開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀，2996光電二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；Unique-R202型多功能超純水系統(tǒng)，廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司；XSE105型Dual Range電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ-250DB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Modulyod型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Thermo公司。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)111730-201916，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.20%）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)111626-201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.20%）、莫諾苷（批號(hào)111998-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、綠原酸（批號(hào)110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）、馬錢(qián)苷（批號(hào)111640-201707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、金絲桃苷（批號(hào)111521-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530- 201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%）、3,6′-二芥子?；崽牵ㄅ?hào)111848-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、五味子醇甲（批號(hào)110857-201714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.4%），均購(gòu)置于中國(guó)食品藥品檢定研究院。色譜級(jí)甲醇、乙腈，Dikma科技有限公司；色譜級(jí)磷酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分析級(jí)甲醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

制備15批固陰煎基準(zhǔn)樣品所用的藥材均源自道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)，由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，產(chǎn)地及批號(hào)信息詳見(jiàn)表1。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)方向吳修紅教授鑒定，地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根，菟絲子為旋花科菟絲子屬植物菟絲子Lam.的干燥成熟種子，人參為五加科人參屬植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖，山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷Thunb.的干燥根莖，山茱萸為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.的干燥根，五味子為木蘭科五味子屬植物五味子(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)。依照《中國(guó)藥典》2020年版地黃和甘草藥材項(xiàng)下飲片炮制規(guī)范，分別炮制為熟地黃和炙甘草。遠(yuǎn)志依照《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》（2008年）炮制為制遠(yuǎn)志，菟絲子依照《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》（2012年）炮制為炒菟絲子，山藥依照《天津市中藥飲片炮制規(guī)范》（2018年）炮制為炒山藥。

2 方法與結(jié)果

2.1 基準(zhǔn)樣品的制備

參考國(guó)家中醫(yī)藥管理局、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局制定公布的《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（7首方劑）》中序號(hào)6枇杷清肺飲（《醫(yī)宗金鑒》清?吳謙）處方、制法及用法的現(xiàn)代對(duì)應(yīng)情況，由于清朝沿襲明朝度量衡，固陰煎出自明朝，所以本研究中1錢(qián)暫定為3.73 g，水1盅為現(xiàn)代200 mL，煎7分為煎至1盅的7分，為現(xiàn)代140 mL[13]。固陰煎原文中人參（隨宜），參考清代《竹林女科證治》卷二，安胎上記載固陰煎“人參一二錢(qián)”[14]，韓百靈《百靈婦科》記載固陰煎“人參三錢(qián)”[15]，故本研究中人參用量為2錢(qián)7.46 g；熟地3、5錢(qián)，按4錢(qián)計(jì)算為14.92 g；山藥（炒）2錢(qián)，為7.46 g；山茱萸1錢(qián)半，為5.60 g；遠(yuǎn)志（炒）7分，1錢(qián)的7分為2.61 g；炙甘草1、2錢(qián)，按1.5錢(qián)計(jì)算為5.60 g；五味（14粒），參照《經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)指引》，五味子14粒約為2 g[16]，故本研究中暫定五味子用量為2.00 g；菟絲子（炒香）2、3錢(qián)，按2.5錢(qián)計(jì)算為9.33 g；水2盅，煎7分，即固陰煎現(xiàn)代用水量為400 mL，煎至140 mL。根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》【2009】3號(hào)文件第十二條要求“煎藥應(yīng)該使用符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飲用水”，確定固陰煎煎煮用水為符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的飲用水[17]。

表1 15批固陰煎基準(zhǔn)樣品(S1～S15)組方藥材產(chǎn)地及批號(hào)信息

綜上所述，固陰煎基準(zhǔn)樣品制備工藝為取固陰煎日劑量飲片（人參7.46 g、熟地黃14.92 g、炒山藥7.46 g、山茱萸5.60 g、制遠(yuǎn)志2.61 g、炙甘草5.60 g、五味子2.00 g、炒菟絲子9.33 g），置于蘇泊爾煎藥砂鍋中，加水400 mL，浸泡60 min，使用九陽(yáng)電陶爐武火10 min（1800 W）煮沸后改用文火（400 W）煎煮75 min，藥液趁熱濾過(guò)（120目濾布），約得到140 mL煎液。然后將煎液在低溫?zé)o水乙醇?。?60 ℃）中冷凍旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻布滿凍干瓶?jī)?nèi)壁直至完全成固態(tài)后，在?80 ℃保存24 h，采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥18 h后得到固陰煎基準(zhǔn)樣品（凍干粉呈黃褐色疏松粉末，氣香，味先微甜后轉(zhuǎn)苦）。將固陰煎基準(zhǔn)樣品使用密封機(jī)密封，并置于干燥器中保存待用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取固陰煎基準(zhǔn)樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 陰性對(duì)照液及各單味藥對(duì)照液 按照“2.1”項(xiàng)下固陰煎基準(zhǔn)樣品的制備方法，分別制備缺人參、缺熟地黃、缺炒山藥、缺山茱萸、缺制遠(yuǎn)志、缺炙甘草、缺五味子、缺炒菟絲子陰性凍干粉以及各單味藥凍干粉。按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備缺人參、缺熟地黃、缺炒山藥、缺山茱萸、缺制遠(yuǎn)志、缺炙甘草、缺五味子、缺炒菟絲子陰性對(duì)照液及各單味藥對(duì)照液。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液 精密稱取沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、綠原酸、馬錢(qián)苷、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、3,6′-二芥子酰基蔗糖、甘草酸銨、五味子醇甲，置于11個(gè)20 mL量瓶中，分別加甲醇配制成精確質(zhì)量濃度依次為0.695 2、1.096 4、0.984 5、1.064 6、1.059 5、0.962 5、1.195 5、0.957 0、0.671 5、0.746 0、0.896 0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液的稀釋液適量，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，制得沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、綠原酸、馬錢(qián)苷、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、3,6′-二芥子酰基蔗糖、甘草酸、五味子醇甲各成分質(zhì)量濃度分別為6.952、21.928、19.690、21.292、10.595、4.813、5.978、0.957、6.715、7.460、1.792 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；洗脫方式為線性梯度洗脫：0～10 min，0～5%乙腈；10～20 min，5%～10%乙腈；20～33 min，10%～11%乙腈；33～42 min，11%～18%乙腈；42～50 min，18%乙腈；50～80 min，18%～40%乙腈；80～100 min，40%～100%乙腈；體積流量為1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣體積5 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取固陰煎基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物1份（S1），按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別在制備后0、3、6、9、12、18、24 h按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別采集HPLC指紋色譜圖，以12號(hào)峰金絲桃苷為參照峰（s），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果為各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.07%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4.03%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取固陰煎基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物1份（S1），按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以12號(hào)峰金絲桃苷為參照峰（s），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果為各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.07%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.21%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取固陰煎基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物適量，按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以12號(hào)峰金絲桃苷峰為參照峰（s），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果為各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.05%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4.52%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 固陰煎指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取15批固陰煎基準(zhǔn)樣品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。將上述色譜數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012版），以S1為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行峰多點(diǎn)校正和全峰自動(dòng)匹配，得到15批樣品疊加圖及共有模式（對(duì)照指紋圖譜，R）圖（圖1-A），共標(biāo)定了24個(gè)共有峰，經(jīng)與混合對(duì)照品（圖1-B）的色譜采集結(jié)果進(jìn)行比較分析，同時(shí)結(jié)合紫外光譜圖，可鑒定出其中11個(gè)色譜峰，分別為1號(hào)峰沒(méi)食子酸、3號(hào)峰5-羥甲基糠醛、6號(hào)峰莫諾苷、7號(hào)峰綠原酸、9號(hào)峰馬錢(qián)苷、11號(hào)峰甘草苷、12號(hào)峰金絲桃苷、13號(hào)峰毛蕊花糖苷、14號(hào)峰3,6′-二芥子?；崽恰?2號(hào)峰甘草酸、23號(hào)峰五味子醇甲。15批基準(zhǔn)樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果分別為0.954、0.900、0.904、0.921、0.925、0.986、0.941、0.939、0.986、0.950、0.990、0.953、0.979、0.957、0.953，平均值為0.949，詳見(jiàn)表2，說(shuō)明15批固陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度良好。表明各不同產(chǎn)地、不同批次供試品之間的主要物質(zhì)群差異較小，制備工藝穩(wěn)定。

1-沒(méi)食子酸 3-5-羥甲基糠醛 6-莫諾苷 7-綠原酸 9-馬錢(qián)苷 11-甘草苷 12-金絲桃苷 13-毛蕊花糖苷 14-3,6′-二芥子?；崽?22-甘草酸 23-五味子醇甲，圖2同

表2 15批GYJ基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 共有峰歸屬

制備缺人參、缺熟地黃、缺炒山藥、缺山茱萸、缺制遠(yuǎn)志、缺炙甘草、缺五味子、缺炒菟絲子陰性對(duì)照液及各單味藥對(duì)照液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)合各色譜峰的保留時(shí)間及紫外吸收?qǐng)D，通過(guò)對(duì)比分析，對(duì)24個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬研究，色譜圖對(duì)比結(jié)果如圖2所示：3號(hào)峰（5-羥甲基糠醛）、13號(hào)峰（毛蕊花糖苷）來(lái)自熟地黃；1號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、2號(hào)峰、3號(hào)峰（5-羥甲基糠醛）、4號(hào)峰、6號(hào)峰（莫諾苷）、8號(hào)峰、9號(hào)峰（馬錢(qián)苷）來(lái)自山茱萸；5號(hào)峰、8號(hào)峰、10號(hào)峰、11號(hào)峰（甘草苷）、14號(hào)峰（3,6′-二芥子?；崽牵?、18號(hào)峰、19號(hào)峰、20號(hào)峰、21號(hào)峰來(lái)自制遠(yuǎn)志；7號(hào)峰（綠原酸）、10號(hào)峰、12號(hào)峰（金絲桃苷）、16號(hào)峰、17號(hào)峰來(lái)自炒菟絲子；5號(hào)峰、10號(hào)峰、11號(hào)峰（甘草苷）、15號(hào)峰、22號(hào)峰（甘草酸）、24號(hào)峰來(lái)自炙甘草；23號(hào)峰（五味子醇甲）來(lái)自五味子。其中3號(hào)峰（5-羥甲基糠醛）在熟地黃和山茱萸單味藥中均存在，所以固陰煎基準(zhǔn)樣品中5-羥甲基糠醛有以上2個(gè)藥味來(lái)源。11號(hào)峰甘草苷除了在炙甘草單味藥中具有明顯色譜峰，在制遠(yuǎn)志單味藥中也有響應(yīng)，是因?yàn)橹七h(yuǎn)志炮制過(guò)程中以甘草水煎液為輔料。由于炒山藥中主要含有多糖類、核苷類、氨基酸類、環(huán)肽類、脂肪酸類化合物[18]，同時(shí)人參中主要皂苷類成分為紫外末端吸收，所以在本實(shí)驗(yàn)條件下，無(wú)共有峰歸屬于炒山藥和人參。后續(xù)計(jì)劃進(jìn)一步開(kāi)發(fā)關(guān)于固陰煎基準(zhǔn)樣品中人參皂苷類成分和山藥中特有成分的特征指紋圖譜，以便建立更完善的固陰煎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系。

2.7 聚類熱圖分析

以15批固陰煎物質(zhì)基準(zhǔn)的24個(gè)共有峰的峰面積為變量，將數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入Metware Cloud在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https://cloud.metware.cn/#/tools/tool-list）進(jìn)行高級(jí)聚類分析，結(jié)果如圖3所示。從縱向分析，各批次聚類結(jié)果為S1～S5被歸為一類，S6～S15被歸為一類。分析原因可能由于藥材產(chǎn)地不同導(dǎo)致固陰煎樣品中各成分的含量具有一定的差異（S1～S5、S6～S10、S11～S15，每5批藥材來(lái)自同一產(chǎn)地）。從橫向聚類結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)11、21、13、22、7、10、12號(hào)峰被歸為一類（1類）；2、9、8、14、17號(hào)峰被歸為一類（2類）；1、5、6、15、19、3、18、16、20、4、23、24號(hào)峰被分為一類（3類）。與峰歸屬結(jié)果對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)歸屬菟絲子的7、10、12號(hào)色譜峰被歸為一類（1類）；歸屬山茱萸的2、8、9號(hào)色譜峰被歸為一類（2類）；歸屬山茱萸的1、3、4、6號(hào)色譜峰被歸為一類（3類）；歸屬炙甘草的5、15、24號(hào)色譜峰被歸為一類（3類）；歸屬制遠(yuǎn)志的5、18～20號(hào)色譜峰被歸為一類（3類）；歸屬炙甘草的11、22號(hào)峰和歸屬制遠(yuǎn)志的11、21號(hào)峰歸為一類（1類），可以發(fā)現(xiàn)聚類分析結(jié)果與峰歸屬結(jié)果具有一定的相關(guān)性，可以互相印證。從整體熱圖角度分析，將不同批次的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并以熱圖的形式展示，顏色越深代表相對(duì)含量越高，可以發(fā)現(xiàn)1類色譜峰（11、21、13、22、7、10、12號(hào)峰）在S6～S10批次中含量較高，2類色譜峰（2、9、8、14、17號(hào)峰）在S1～S5和S6～S10批次中含量相對(duì)較高，3類色譜峰（1、5、6、15、19、3、18、16、20、4、23、24號(hào)峰）在S1～S5批次中含量較高。綜合分析，說(shuō)明各產(chǎn)地藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣順序?yàn)镾1～S5＞S6～S10＞S11～S15。

圖2 固陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜共有峰歸屬色譜圖

圖3 15批固陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜共有峰聚類熱圖分析

2.8 PCA

以15批固陰煎物質(zhì)基準(zhǔn)的24個(gè)共有峰的峰面積為變量，將數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入Metware Cloud在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https://cloud.metware.cn/#/tools/tool-list）進(jìn)行高級(jí)PCA，結(jié)果如圖4-A所示，S1～S5聚集在一起，S6～S15聚集在一起，發(fā)現(xiàn)PCA結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

2.9 OPLS-DA

以15批固陰煎物質(zhì)基準(zhǔn)的24個(gè)共有峰的峰面積為變量，將數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入Metware Cloud在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https://cloud.metware.cn/#/tools/tool-list）進(jìn)行高級(jí)OPLS-DA，結(jié)果如圖4-B、C所示，以變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）值＞1為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異組分色譜峰包括峰20、16、18、19、2、15、3（5-羥甲基糠醛）、6（莫諾苷）、7（綠原酸）、5、17。

與峰歸屬結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，峰20、18、19來(lái)源于制遠(yuǎn)志；峰16、7（綠原酸）、17來(lái)源于炒菟絲子；峰2、6（莫諾苷）來(lái)源于山茱萸；峰15、5來(lái)源于炙甘草；峰3（5-羥甲基糠醛）來(lái)源于熟地黃。說(shuō)明以上5味藥材是影響不同批次、組別樣品質(zhì)量差異性的重要來(lái)源，所以如果想更好的控制固陰煎基準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性，應(yīng)在藥材源頭進(jìn)行質(zhì)量穩(wěn)定性控制并重點(diǎn)關(guān)注上述藥材。

A-PCA得分圖 B-OPLS-DA得分矩陣 C-VIP值

3 討論

固陰煎由人參、熟地黃、炒山藥、山茱萸、制遠(yuǎn)志、炙甘草、五味子、炒菟絲子8味中藥組成，基準(zhǔn)樣品成分復(fù)雜，為了盡可能全面地分析其所含的化學(xué)成分，本研究對(duì)供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行了考察。

供試品溶液的制備，首先考差了提取方法及提取時(shí)間，包括超聲15、30、45、60 min和回流30、60、90 min，比較各共有峰在不同提取條件下的峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min即可達(dá)到有效成分的充分提取，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便。同時(shí)進(jìn)行了提取溶劑考察，包括25%、50%、75%、100%甲醇，比較各色譜圖結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用100%甲醇提取時(shí)，色譜圖基線更平穩(wěn)。

固定提取溶劑體積（20 mL），考察不同取樣量0.50、1.00、2.00 g，確定最佳供試品溶液濃度，比較各共有峰單位濃度峰面積及峰強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最適取樣量為1.00 g。色譜條件考察，首先將供試品溶液經(jīng)紫外全波長(zhǎng)（200～400 nm）掃描，比較發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm時(shí)，能獲得較多的指紋峰且各峰強(qiáng)度適中，基線也相對(duì)穩(wěn)定，所以選擇230 nm作為固陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相組成分別考察了乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.10%磷酸水溶液、乙腈-0.15%磷酸水溶液，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.10%磷酸水溶液色譜圖分離度更好，基線更平穩(wěn)。色譜柱考察分別對(duì)比了3個(gè)不同生產(chǎn)廠家的色譜柱Symmetry?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；Waters）、Capcell Pak C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；Shiseido）、Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm；Dikma），發(fā)現(xiàn)Waters Symmetry?C18色譜柱分離效果最好。并重點(diǎn)考察了梯度洗脫程序，盡可能使色譜峰分離度更好，分布更均勻，色譜峰數(shù)量更多，采集時(shí)間更短。

同時(shí)對(duì)柱溫（30、35、40 ℃）和進(jìn)樣量（2.5、5、10 μL）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)柱溫為40 ℃各峰分離情況更好，進(jìn)樣體積為5 μL時(shí)，色譜圖基線更平穩(wěn)。通過(guò)以上研究，確立了固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜的分析方法。

固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證良好，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值均小于4.52%。15批固陰煎基準(zhǔn)樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9，說(shuō)明各不同產(chǎn)地、不同批次供試品之間的主要物質(zhì)群差異較小，制備工藝穩(wěn)定?；凇爸兴幧V指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）生成對(duì)照指紋圖譜，共標(biāo)定了24個(gè)共有峰，經(jīng)與混合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，鑒定了其中11個(gè)色譜峰。

共有峰歸屬研究發(fā)現(xiàn)，基準(zhǔn)樣品中5-羥甲基糠醛有2個(gè)藥味來(lái)源，分別為熟地黃和山茱萸。由于炒山藥和人參中所含成分的特殊性，在本實(shí)驗(yàn)條件下，未檢測(cè)到明顯的特征峰。后續(xù)計(jì)劃進(jìn)一步開(kāi)發(fā)關(guān)于固陰煎基準(zhǔn)樣品中人參皂苷類成分和山藥中特有成分的特征指紋圖譜，以便建立更完善的固陰煎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系。聚類分析和PCA可將15批基準(zhǔn)樣品分為2類，兩者可互相印證。分析原因可能由于藥材產(chǎn)地不同導(dǎo)致固陰煎樣品中各成分的含量具有一定的差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)各色譜峰的聚類分析結(jié)果與峰歸屬結(jié)果具有一定的相關(guān)性。

從整體熱圖角度分析，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣順序?yàn)镾1～S5＞S6～S10＞S11～S15。但由于指紋圖譜中未能體現(xiàn)人參和炒山藥相關(guān)色譜峰，所以該質(zhì)量分析結(jié)果不適用于評(píng)價(jià)人參和山藥的藥材質(zhì)量。OPLS-DA（VIP＞1）找到莫諾苷、5-羥甲基糠醛、綠原酸在內(nèi)的11個(gè)差異性色譜峰，分別歸屬于單味藥制遠(yuǎn)志、炒菟絲子、山茱萸、炙甘草和熟地黃。顧和亞等[19]在芪葵緩釋片中活性成分在兔血漿中的藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)莫諾苷、馬錢(qián)苷、金絲桃苷的相對(duì)生物利用度相對(duì)于芪葵顆粒分別為169.1%、213.3%、169.3%，均大于100%，李嫻[20]在六味地黃丸中成分在健康大鼠和腎陰虛大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究中同樣監(jiān)測(cè)了血漿中馬錢(qián)苷、莫諾苷的濃度變化，鄭東昆等[21]基于UHPLC-MS/MS測(cè)定了大鼠血漿中毛蕊花糖苷的藥動(dòng)學(xué)特征，張磊等[22]在基于臨床療效的注射用益氣復(fù)脈（凍干）質(zhì)量標(biāo)志物確證中將五味子醇甲做為益氣復(fù)脈可能的質(zhì)量標(biāo)志物，以上均說(shuō)明上述成分在體內(nèi)具有較好的吸收與代謝，且可能與療效相關(guān)。

固陰煎功效為補(bǔ)肝腎，滋陰血，主治肝腎兩虧證，上述成分在本研究中也得到了表征，提示上述成分可能是固陰煎發(fā)揮臨床療效相關(guān)的藥效成分，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同樣，如果想更好地控制基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量，在重點(diǎn)關(guān)注藥材源頭外，還應(yīng)尋找方劑發(fā)揮臨床療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有針對(duì)性的對(duì)方劑的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行控制，才能更好地保證制劑的穩(wěn)定可靠。

綜上，本研究建立的固陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分離度好、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，為固陰煎基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量控制提供了新的借鑒，對(duì)固陰煎的進(jìn)一步利用和開(kāi)發(fā)提供了數(shù)據(jù)參考，也為其后續(xù)制劑開(kāi)發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。但由于在本實(shí)驗(yàn)條件下，來(lái)源于人參和炒山藥中的化學(xué)成分未能充分表征，后續(xù)會(huì)繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，嘗試建立人參和山藥的特征指紋圖譜，以期為固陰煎建立全面可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，進(jìn)一步促進(jìn)其經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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HPLC fingerprinting study of classical formula Guyin Decoction

GE Nan1, LI Zhi-neng1, YAN Guang-li1, SUN Hui1, ZHANG Xi-wu1, LI Dan2, WANG Xi-jun1

1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Engineering Research Center for Effectiveness Evaluation and Industrialization Development of Classic Prescription, Harbin 150040, China 2. Beijing-Tianjin-Hebei Lianchuang Drug Research (Beijing) Co., Ltd., Beijing 100025, China

To establish HPLC fingerprints of the benchmark samples of the classical formula Guyin Decoction (GYJ) and to analyze and evaluate 15 batches of the benchmark samples by combining multivariate statistical analysis, so as to provide reference for the development of its benchmark samples.A Waters SymmetryRC18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column was used with acetonitrile (A) and 0.1% phosphoric acid aqueous solution (B) as the mobile phase and gradient elution (0—10 min, 0—5% A; 10—20 min, 5%—10% A; 20—33 min, 10%—11% A; 33—42 min, 11%—18% A; 42—50 min, 18% A; 50—80 min, 18%—40% A; 80—100 min, 40%—100% A) at a flow rate of 1 mL/min, column temperature of 40 ℃, detection wavelength of 230 nm, injection volume of 5 μL, to establish the HPLC fingerprints of the GYJ benchmark samples and conduct methodological investigation. The fingerprints of the 15 batches of GYJ samples were evaluated by using the “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine” (2012 version) to match the shared peaks, and the attribution of the shared peaks was studied. The results were combined with cluster analysis, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) to evaluate the quality differences among the batches of GYJ benchmark samples and to find the main components and source flavors that caused the quality differences between batches.The methodological validation of the HPLC fingerprints of the benchmark samples of GYJ was good, and the similarity between the fingerprints of the 15 batches of the benchmark samples and the control was greater than 0.9. A total of 24 shared peaks were found, and 11 peaks were identified by comparison with the mixed standards, namely, gallic acid (peak 1), 5-hydroxymethylfurfural (peak 3), morroniside (peak 6), chlorogenic acid (peak 7), loganin (peak 9), liquiritin (peak 11), hyperoside (peak 12), verascoside (peak 13), 3,6′-disinapoylsucrose (peak 14), glycyrrhizic acid (peak 22), schisandrin (peak 23). Cluster analysis and PCA analysis could classify the 15 batches of benchmark samples into two categories, and the results could be corroborated with each other. OPLS-DA (VIP > 1) excavated 11 differential peaks including morroniside, 5-hydroxymethylfurfural, and chlorogenic acid, which were derived from Yuanzhi (etdecoction processed), fried Tusizi (), Shanzhuyu (), Zhigancao (etcum) and Shudihuang (), respectively.The established HPLC fingerprints of the benchmark samples of GYJ are highly specific, sensitive, well separated, reproducible and stable, and were characterized except foretand fried, which can provide reference for its subsequent formulation development and quality control studies.

classical formula; Guyin Decoction; benchmark sample; fingerprinting; quality control; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; gallic acid; 5-hydroxymethylfurfural; morroniside; chlorogenic acid; loganin; liquiritin; hyperoside; verascoside; 3',6-Disinapoylsucrose; glycyrrhizic acid; schisandrin;;;;et;;et;

R283.6

A

0253 - 2670(2022)24 - 7730 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.011

2022-07-07

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2022106061）；黑龍江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃指導(dǎo)類（GZ20210125）；經(jīng)典名方《固陰煎》顆粒劑的開(kāi)發(fā)研究（2017SW-KF058）

葛 楠，博士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究。E-mail: 976077771@qq.com

王喜軍，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。E-mail: xijunw@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]