周靖惟，張 星#，李 莎，朱 芮，吳秋紅，黃 友，楊莎莎，林 夏，郝怡雯，傅超美*，張 臻, 2*

基于“入血成分-復(fù)方功效-靶點通路”的四妙勇安湯潛在質(zhì)量標志物研究

周靖惟1，張 星1#，李 莎1，朱 芮1，吳秋紅1，黃 友1，楊莎莎1，林 夏1，郝怡雯1，傅超美1*，張 臻1, 2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評價重點研究室，四川 彭州 610031

結(jié)合血清藥物化學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測四妙勇安湯的潛在質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker），并在此結(jié)果基礎(chǔ)上開展動物實驗加以驗證。采用HPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析四妙勇安湯的入血成分，基于入血成分結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測主要作用靶點、通路，使用Cytoscape軟件，構(gòu)建“入血成分-復(fù)方功效-靶點通路”網(wǎng)絡(luò)，依據(jù)拓撲學(xué)分析結(jié)果與四妙勇安湯主治熱毒熾盛之脫疽的相關(guān)性，綜合確定四妙勇安湯的潛在Q-Marker。在此基礎(chǔ)上建立熱毒熾盛之脫疽模型大鼠，造模成功后連續(xù)ig四妙勇安湯（57 g/kg）2周，實驗結(jié)束后計算各組大鼠創(chuàng)面愈合率，檢測各組血清中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，并采用免疫組化法檢測創(chuàng)面組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白表達。鑒定四妙勇安湯20個入血成分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的42個關(guān)鍵功效靶點、62條相關(guān)通路，根據(jù)化合物、靶點以及信號通路之間的度值，初步預(yù)測木犀草素、異鼠李素、甘草素等9個功效相關(guān)的潛在入血成分并結(jié)合綠原酸等主要有效成分作為四妙勇安湯潛在的Q-Marker。動物實驗結(jié)果表明，給予四妙勇安湯后可明顯提高熱毒熾盛之脫疽大鼠的創(chuàng)面愈合率（＜0.05），顯著回調(diào)血清中關(guān)鍵功效靶點（VEGF、MAPK、IFN-γ）水平（＜0.05），明顯降低創(chuàng)面組織中TNF信號通路相關(guān)蛋白TNF-α、IL-1β的表達（＜0.05）。通過血清藥物化學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘預(yù)測四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的潛在Q-Marker，為整體控制和評價四妙勇安湯質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。動物實驗初步證實了四妙勇安湯可通過調(diào)控VEGF、MAPK和IFN-γ等關(guān)鍵功效靶點蛋白以及TNF信號通路相關(guān)蛋白，進而發(fā)揮治療熱毒熾盛之脫疽的作用。

四妙勇安湯；質(zhì)量標志物；血清藥物化學(xué)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；熱毒熾盛之脫疽；木犀草素；異鼠李素；甘草素；綠原酸

君臣佐使的遣方配伍是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，經(jīng)典名方是君臣佐使配伍的重要載體，也是歷代醫(yī)家從大量臨床實踐中形成的中醫(yī)藥精華[1]，國家相關(guān)主管部門先后出臺了一系列政策與技術(shù)指導(dǎo)原則鼓勵開展研制經(jīng)典名方，但其中仍有眾多關(guān)鍵問題亟待解決，以臨床功效為導(dǎo)向進行中藥的創(chuàng)新研發(fā)和質(zhì)量標準研究一直是業(yè)內(nèi)專家學(xué)者的共識[2-3]，特別是經(jīng)典名方源于臨床，用于臨床，其核心生命力在于臨床療效，如何在經(jīng)典名方的研發(fā)與質(zhì)量控制及評價過程體現(xiàn)經(jīng)方的臨床功效特色，是目前研究的重點與難點。質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）概念在研究中藥功效特色標示性物質(zhì)方面，以“特有性、有效性、傳遞與溯源、可測性、配伍環(huán)境”五原則為核心，將中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標志性成分進一步關(guān)聯(lián)[4-5]，為中藥新藥研發(fā)及質(zhì)量控制提供了指導(dǎo)方向[6-7]。同時，大多數(shù)中藥及復(fù)方采用傳統(tǒng)的口服給藥的方式，而其中的有效成分多經(jīng)吸收入血后發(fā)揮療效[8]，因此，有學(xué)者提出“中藥血清藥物化學(xué)”的概念，以經(jīng)典的藥物化學(xué)研究手段和方法為基礎(chǔ)，分析鑒定或表征口服中藥后人或動物血清中移行成分，目前已成為快速、準確研究中藥功效相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。與此同時，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種輔助分析方法，可從“藥物-疾病-靶點”全方位解析方劑成分-功效的關(guān)聯(lián)，也被逐步引入到中藥Q-Marker研究中。

四妙勇安湯作為《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中公布的100首經(jīng)典名方之一，始載于漢代《華佗神醫(yī)秘傳》[9]，全方由金銀花、玄參、當歸、甘草4味藥物組成，具有清熱解毒、活血止痛之功效，主治熱毒熾盛之脫疽，現(xiàn)代臨床常用其治療糖尿病及其并發(fā)癥（糖尿病足潰瘍、糖尿病大血管病變）和血栓閉塞性脈管炎等疾病[10]。目前對四妙勇安湯研究多集中在藥效評價以及化學(xué)成分的鑒別分析[9,11-14]，缺乏與臨床功效關(guān)聯(lián)的Q-Marker相關(guān)研究，難以反映中藥治療疾病的本質(zhì)特征，不利于建立專屬性、針對性的質(zhì)量評價方法和質(zhì)量標準，一定程度上限制了其臨床療效的保障及產(chǎn)品質(zhì)量的提升。因此，本研究采用血清藥物化學(xué)的方法分析鑒定四妙勇安湯入血成分，篩選得到其潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，再利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[15]構(gòu)建“中藥入血成分-核心功效靶點-重要作用通路”網(wǎng)絡(luò)，分析經(jīng)典名方四妙勇安湯發(fā)揮臨床療效的Q-Marker，在此結(jié)果基礎(chǔ)上開展相應(yīng)的動物驗證實驗，中醫(yī)學(xué)認為糖尿病足潰瘍屬“脫疽”“壞疽”等范疇[16]，因此采用ip鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）和剪切創(chuàng)面的方法建立熱毒熾盛之脫疽模型，對前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果中得到的關(guān)鍵功效靶點及相關(guān)蛋白表達進行檢測，進一步驗證四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的對應(yīng)靶點及通路，為四妙勇安湯經(jīng)方研制、質(zhì)量控制和評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量（200±20）g，購自成都恩斯維爾生物科技有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物于成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物房內(nèi)飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度65%～69%。動物實驗遵循成都中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 藥材

甘草（批號2112087）、當歸（批號2112065）、玄參（批號2111040）、金銀花（批號2110098）均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定分別為豆科植物甘草Fisch.的干燥根及根莖、傘形科植物當歸(Oliv.) Diels的干燥根、玄參科植物玄參Hemsl.的干燥根、忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

1.3 藥品與試劑

對照品馬錢苷（批號RFS-M01001910018）、綠原酸（批號RFS-L00701908029）、木犀草素（批號RFS-M00702004028）、阿魏酸（批號RFS-A00211812016）、β-谷甾醇（批號RFS-G00202005008）、哈巴苷（批號RFS-H02101908013）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%；色譜純乙腈、甲醇購自美國Sigma-Aldrich公司；色譜純甲酸購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；超純水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）ELISA試劑盒（批號BM220602）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號BM220602）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA試劑盒（批號BM220602）均購自合肥博美生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號ab220210）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（批號GB11113）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器

Synapt XS高分辨質(zhì)譜儀、Acquity超高效液相色譜（美國Waters公司）；Spectra Max i3x酶標儀[美谷分子儀（上海）有限公司]；HTP-312型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆籋R/T20M型離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 四妙勇安湯血清藥物化學(xué)研究

2.1.1 四妙勇安湯的制備 按原方比例（3∶3∶2∶1）分別稱取金銀花、玄參、當歸、甘草飲片共270 g，加入20倍蒸餾水，于陶瓷鍋中浸泡60 min，武火加熱至沸騰，文火保持微沸繼續(xù)煎煮60 min，趁熱濾過，60 ℃減壓濃縮至200 mL，經(jīng)測定含綠原酸16.468 3 mg/g、阿魏酸1.112 4 mg/g、異綠原酸C 4.927 5 mg/g、安格洛苷C 3.235 5 mg/g、哈巴俄苷1.987 0 mg/g和甘草酸11.679 5 mg/g。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取馬錢苷、綠原酸、木犀草素、阿魏酸、β-谷甾醇、哈巴苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.11、0.12、0.11、0.13、0.11、0.12 mg/mL的對照品溶液。取上述6種對照品溶液各0.5 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.1.3 血清樣品制備 12只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和四妙勇安湯（32 g/kg）組。根據(jù)文獻報道[17]與預(yù)實驗結(jié)果，將“2.1.1”項下制備的四妙勇安湯濃縮為3.2 g/mL（以生藥量計）的ig溶液，大鼠連續(xù)3 d給藥，對照組ig等體積蒸餾水。末次給藥后60 min，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置1 h后，4 ℃、4000 r/min離心20 min，取上清液。分別取對照組和四妙勇安湯組血清2 mL，加入5倍量甲醇，渦旋振蕩10 min，20 000 r/min離心20 min，取上清液氮氣吹干，加入200 μL 50%甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，LC-MS/MS進樣分析。

2.1.4 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～11 min，2%～25% B；11～18 min，25%～60% B；18～23 min，60%～90% B；23～26 min，90% B；26～27 min，90%～2% B；27～30 min，2% B。體積流量0.1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.1.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，分別在正、負離子條件下掃描，掃描范圍/0～1200，掃描時間0.3 s，檢測時間30 min。低能量碰撞電壓15 eV，高能量碰撞電壓為35 eV；正、負離子模式的毛細管電壓分別為2.0 kV、?2.5 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度150 ℃；輔助噴霧電離與去溶劑氣體為高純度N2；去溶劑化溫度450 ℃；錐孔氣體積流量50 L/h；去溶劑化氣體積流量800 L/h。

2.1.6 數(shù)據(jù)分析方法 采用MassLynx 4.1軟件提取質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過ChemSpider在線數(shù)據(jù)庫對四妙勇安湯中的化合物進行檢索，建立包括中英文名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量以及特征碎片等信息的四妙勇安湯潛在化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫；采用UNIFITM數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對四妙勇安湯入血成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理，依據(jù)相對分子質(zhì)量偏差以及二級質(zhì)譜裂解規(guī)律，確定各色譜峰對應(yīng)化合物的分子式，在已建立的四妙勇安湯化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫中檢索確證匹配的化合物；進一步綜合對照品信息及相關(guān)文獻報道，對化合物進行分析鑒定。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 成分靶點預(yù)測 將分析得到的四妙勇安湯入血成分通過PubChem數(shù)據(jù)庫及Chem Bio Draw軟件獲得入血成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，之后通過SwissTargetPrediction平臺及TCMSP數(shù)據(jù)進行入血成分靶點蛋白預(yù)測，再通過UniProt數(shù)據(jù)庫將得到的靶點蛋白進行名稱規(guī)范。

2.2.2 潛在靶點獲取 在Gene Cards和OMIM數(shù)據(jù)庫搜尋熱毒熾盛之脫疽相關(guān)靶點（如血栓閉塞性脈管炎：thromboangitis obliterans、buerger disease、buerger’s disease；肢體動脈硬化閉塞癥：arteriosclerosis obliterans；壞疽：gangrene；糖尿?。篸iabetes、diabetes mellitus等），獲得疾病相關(guān)靶點[18]；之后與四妙勇安湯的入血成分藥物靶點進行交集，獲得四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的潛在靶點。

2.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將潛在靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，為確保數(shù)據(jù)的可靠性，選擇0.9的高置信度，保存結(jié)果。將結(jié)果中的節(jié)點1、節(jié)點2和combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，對其網(wǎng)絡(luò)進行分析，篩選關(guān)鍵功效靶點，并將節(jié)點大小和顏色設(shè)置用于反映度值的大小。

2.2.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將關(guān)鍵功效靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf. gov/），identifier設(shè)置為official gene symbol，list type設(shè)置為gene list，物種設(shè)置為人，進行GO功能和KEGG通路分析，富集分析均以FDR＜0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義，并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫和Reactome數(shù)據(jù)庫進行通路注釋分析。

2.2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述四妙勇安湯的入血成分、關(guān)鍵靶點、作用通路在Excel表中分別建立入血成分-關(guān)鍵靶點、關(guān)鍵靶點-作用通路之間的對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“入血成分-關(guān)鍵靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.2.6 分子對接 采用AutoDock vina軟件對關(guān)鍵功效靶點與潛在Q-Marker進行分子對接驗證。從RCSB PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲得靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)，采用AutoDock Tools對上述蛋白受體和配體進行常規(guī)處理，再用其插件Autogrid得到對接活性位點，進行分子對接，得到結(jié)合能。本研究以結(jié)合能≤?5.0 kJ/mol為分子與靶點結(jié)合性較好。

2.3 動物實驗驗證

2.3.1 熱毒熾盛之脫疽模型制備 STZ以0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.2）配制成0.2% STZ溶液，SD大鼠空腹18 h后ip 2% STZ（60 mg/kg），72 h后取尾靜脈血檢測空腹血糖≥16.7 mmol/L，則糖尿病模型大鼠建立成功；成模后ip 3%戊巴比妥鈉麻醉，用圖章在大鼠背部印出圓形標記（直徑約2.0 cm），用剪刀剪除其全層皮膚，深至筋膜，建立熱毒熾盛之脫疽大鼠模型[19-20]。

2.3.2 分組及給藥 熱毒熾盛之脫疽模型大鼠隨機分為模型組、四妙勇安湯（57 g/kg，相當于臨床劑量的2倍）[20]組和二甲雙胍（135 mg/kg）組，每組5只，另取5只SD大鼠作為對照組。將“2.1.1”項下制備的四妙勇安湯濃縮為5.7 g/mL（以生藥量計）的溶液。稱取適量鹽酸二甲雙胍，以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制質(zhì)量濃度為13.5 mg/mL的混懸液。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)2周。

2.3.3 創(chuàng)面愈合率測定 分別于第0、4、9、14天，使用標尺定位對各組大鼠創(chuàng)面進行數(shù)碼拍照，利用Image J軟件測定創(chuàng)面面積，并計算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率＝(造模時創(chuàng)面面積－治療后創(chuàng)面面積)/造模時創(chuàng)面面積

2.3.4 血清中MAPK、IFN-γ和VEGF水平的測定 給藥結(jié)束后，眼眶采血分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測定血清中MAPK、IFN-γ、VEGF水平。

2.3.5 免疫組化法檢測創(chuàng)面組織TNF-α和IL-1β蛋白表達 取各組大鼠創(chuàng)面組織，經(jīng)固定、脫水等制成切片，經(jīng)脫蠟、水化、修復(fù)后，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜；洗滌后加二抗，37 ℃孵育50 min，添加DAB工作液，濕盒孵育40 s，蘇木素復(fù)染，無水酒精分化、脫水、透明化，封片。于顯微鏡下觀察并拍照，利用Image pro plus 6.0圖像分析軟件進行測量分析，計算TNF-α、IL-1β陽性表達區(qū)域的平均吸光度（）值。

3 結(jié)果

3.1 四妙勇安湯入血原型成分分析

共鑒定20個四妙勇安湯的入血成分（表1），正、負離子模式下的總離子流圖見圖1。正離子模式下有17個成分，負離子模式下有3個成分。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.2.1 潛在靶點的預(yù)測 通過SwissTargetPrediction平臺得到四妙勇安湯20個入血成分作用靶點共544個。將GeneCards和OMIM 數(shù)據(jù)庫得到的所有靶點，刪除重復(fù)后得到與“四妙勇安湯主治病癥”相關(guān)基因1717個。利用Venn作圖工具對其進行交集，得到128個治療熱毒熾盛之脫疽的潛在靶點（圖2）。

表1 四妙勇安湯入血原型成分鑒定

圖1 正 (A)、負(B)離子模式下四妙勇安湯血清樣品的UPLC-Q-TOF-MSe總離子流圖

3.2.2 關(guān)鍵功效靶點的分析 將String平臺中獲取的潛在靶點蛋白相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有100個節(jié)點（靶點蛋白）、1352條邊（蛋白相互作用）。節(jié)點大小和顏色表示該節(jié)點度值，度值越大則說明其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大，其中大于平均度值（13.52）的靶點共42個，為關(guān)鍵功效靶點，見表2。

圖2 四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的潛在靶點

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析 利用DAVID平臺對42個關(guān)鍵靶點進行GO功能富集分析，根據(jù)＜0.01、基因數(shù)＞平均值（4.09）得到GO條目93條。生物過程（biological process，BP）相關(guān)的條目最多，有73條，主要涉及細胞因子的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)控、細胞凋亡的調(diào)節(jié)、生物節(jié)律等；細胞組分（cellular component，CC）相關(guān)的條目有6條，主要涉及細胞質(zhì)與細胞核質(zhì)等；分子功能（molecular function，MF）相關(guān)的條目有14條，主要涉及蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。將GO條目按值進行排序，分別選取BP、CC和MF的前5名繪制氣泡圖（圖4-A）。

表2 42個關(guān)鍵功效靶點

利用DAVID平臺對關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，根據(jù)＜0.01、基因數(shù)＞平均值（8.88）獲得62條通路，按值選取前20個通路，繪制氣泡圖。如圖4-B所示，這些通路主要涉及炎癥相關(guān)通路和疾病相關(guān)通路等，炎癥相關(guān)通路主要包括IL-17、Th17、MAPK、TNF等通路；疾病相關(guān)通路主要包括癌癥、乙型肝炎、EB病毒感染、非小細胞癌等通路。IL-17家族通過其相應(yīng)的受體發(fā)出信號，并激活MAPK等下游途徑，從而誘導(dǎo)抗菌肽、細胞因子和趨化因子等的表達，在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[21]；產(chǎn)生IL-17A的Th17細胞是CD4+T細胞的子集，參與上皮細胞和嗜中性粒細胞介導(dǎo)的針對細胞外微生物的免疫應(yīng)答以及自身免疫疾病的發(fā)病機制[18]；TNF信號通路可通過激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路和MAPK級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控細胞凋亡、炎癥和免疫[22]。疾病相關(guān)通路主要涉及癌癥相關(guān)通路，提示其在癌癥的治療具有潛在作用，與臨床研究一致[23-24]。以上結(jié)果說明四妙勇安湯在調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥中起著非常重要的作用，可能是其治療熱毒熾盛之脫疽的原因。

同時通過Reactome數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點，進行通路富集分析。如圖5所示，關(guān)鍵靶點主要涉及免疫系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達、細胞凋亡和疾病等多個生物過程，其中免疫系統(tǒng)涉及最多，表明四妙勇安湯是通過調(diào)控以免疫系統(tǒng)為主的多個復(fù)雜的生物過程來治療熱毒熾盛之脫疽。

圖4 四妙勇安湯關(guān)鍵靶點的GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析

圖5 四妙勇安湯潛在靶點生物功能分析

3.2.4 “入血成分-關(guān)鍵靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape軟件構(gòu)建“入血成分-關(guān)鍵靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)（圖6），并用其插件Network Analyzer進行分析。該網(wǎng)絡(luò)有128個節(jié)點（包括20個入血成分、42個關(guān)鍵靶點、62條通路）和1906條邊。網(wǎng)絡(luò)圖中成分連接度越大，表明該成分通過關(guān)鍵靶點治療熱毒熾盛之脫疽的可能性越大。其中有9個度值大于平均度值的與藥效相關(guān)的入血成分，分別為5-羥基吲哚、粗毛甘草素A、甘草素、粗毛甘草素C、木犀草素、異鼠李素、甘草次酸、甘烏內(nèi)酯和licoagrocarpin，這些成分是四妙勇安湯臨床發(fā)揮藥效的潛在重要成分，可作為四妙勇安湯潛在Q-Marker。

3.2.5 分子對接驗證 將PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前42的關(guān)鍵靶點蛋白與9個藥效相關(guān)重要入血成分進行分子對接驗證，結(jié)果見圖7。若結(jié)合能＜0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合；結(jié)合能＜?5.0 kJ/mol，表明其結(jié)合性好；結(jié)合能越小對接越好，圖中9個藥效相關(guān)重要入血成分都能與靶點蛋白較好地結(jié)合，其中對接結(jié)果較好的有粗毛甘草素A、甘草素、木犀草素等成分。選取排名前9的對接結(jié)果，并利用Discovery Studio Visualizer進行分析，其靶蛋白與成分的3D和2D相互作用模式，見圖8。

圖6 “入血成分-關(guān)鍵靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)

圖7 四妙勇安湯9個藥效相關(guān)重要入血成分的分子對接結(jié)果熱圖

3.3 動物實驗驗證

3.3.1 大鼠一般情況及創(chuàng)面愈合情況 對照組大鼠毛發(fā)細密、光亮，皮下脂肪豐滿，體質(zhì)量逐漸增加，創(chuàng)面明顯減小，局部無紅腫，瘡面有明顯肉芽組織和上皮生長（圖9）。模型組大鼠毛色逐漸灰暗、枯黃、雜亂，皮膚及皮下脂肪變薄，多飲、多食、多尿明顯，創(chuàng)面有出血現(xiàn)象，愈合較緩慢，可見明顯分泌物，肉芽新生較少，有紅腫現(xiàn)象；給予四妙勇安湯或二甲雙胍干預(yù)后，大鼠一般情況顯著改善，創(chuàng)面有肉芽組織生長，幾乎無滲出液，紅腫減少，創(chuàng)面逐漸修復(fù)，有黃褐色的痂覆蓋。給藥第14天，與對照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（＜0.05）。

圖8 四妙勇安湯9個藥效相關(guān)重要入血成分的分子對接模式圖

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，下圖同

3.3.2 四妙勇安湯對熱毒熾盛之脫疽模型大鼠血清中INF-γ、VEGF和MAPK水平的影響 采用ELISA法對四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的關(guān)鍵功效靶點INF-γ、VEGF、MAPK進行驗證，結(jié)果見圖10。與對照組比較，模型組大鼠血清中VEGF、MAPK和IFN-γ水平均顯著上升（＜0.05）；與模型組比較，四妙勇安湯組大鼠血清中VEGF、MAPK和IFN-γ水平均顯著降低（＜0.05），二甲雙胍組VEGF和IFN-γ水平顯著降低（＜0.05）。表明四妙勇安湯對熱毒熾盛之脫疽關(guān)鍵靶點蛋白INF-γ、VEGF、MAPK具有調(diào)控作用。

3.3.3 四妙勇安湯對熱毒熾盛之脫疽模型大鼠創(chuàng)面組織TNF-α和IL-1β蛋白表達的影響 采用免疫組化法對四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的TNF信號通路相關(guān)蛋白TNF-α、IL-1β進行實驗驗證，結(jié)果見圖11。與對照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α和IL-1β表達明顯增加（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β表達均明顯下降（＜0.05）。表明四妙勇安湯可以通過調(diào)控TNF信號通路相關(guān)蛋白TNF-α、IL-1β，進而治療熱毒熾盛之脫疽。

圖10 四妙勇安湯對熱毒熾盛之脫疽模型大鼠血清中INF-γ、VEGF和MAPK水平的影響(, n = 5)

4 討論

中藥經(jīng)典名方的質(zhì)量控制及評價如何體現(xiàn)其臨床功效與特色，是目前研究的關(guān)鍵科學(xué)問題之一[25]。中藥Q-Marker的提出，為中藥質(zhì)量控制緊密聯(lián)系臨床功效與特色提供了新思路。血清藥物化學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為經(jīng)典分析方法，基于中藥成分“有效性”的角度出發(fā)，對于挖掘和研究中藥Q-Marker有重要作用。由于目前《中國藥典》暫未收錄四妙勇安湯，故無法獲得來源于藥典的質(zhì)量標準，因此，基于質(zhì)量標志成分需反映原方功能主治原則，本研究以“有效性”為主，通過血清藥物化學(xué)研究得到經(jīng)典名方四妙勇安湯20個入血成分，作為四妙勇安湯的潛在Q-Marker；隨后通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“中藥入血成分-核心功效靶點-重要作用通路”網(wǎng)絡(luò)，篩選出木犀草素、異鼠李素、甘草素、甘草次酸、粗毛甘草素C、甘烏內(nèi)酯、licoagrocarpin、粗毛甘草素A、5-羥基吲哚9個與臨床功效密切相關(guān)的潛在重要成分，再結(jié)合《中國藥典》對四妙勇安湯中4味藥材含量測定規(guī)定的指標成分、特征性成分，綜合考慮將綠原酸、木犀草苷、阿魏酸、哈巴苷、哈巴俄苷、甘草酸、甘草苷等已確定的重要指標成分，作為可以衡量四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的潛在Q-Marker。篩選得到的四妙勇安湯9個藥效相關(guān)重要入血成分主要為黃酮類和三萜類成分，其中黃酮類成分占比最高?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物在四妙勇安湯的藥物組成中廣泛存在，是其發(fā)揮治療作用的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[18]。如金銀花中的木犀草素可通過降低炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性、減少促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[26]；還可通過抑制過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷，減少膽固醇在外周組織細胞中聚集，從而防止動脈粥樣硬化的形成[27]。甘草中異鼠李素可通過保護血管內(nèi)皮細胞、抗氧化、抗炎等方面發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用；此外，已有研究表明異鼠李素能較好地改善血液流變學(xué)，減少紅細胞聚集與血小板黏附，進而抑制血栓形成[28]。甘草中甘草素[29]與甘草次酸[30]也具有抗炎作用，另有研究表明甘草次酸還具有抗凝血作用，可用于治療血栓癥[31]。本研究選取的四妙勇安湯主治疾病為血栓閉塞性脈管炎、肢體動脈硬化閉塞癥及壞疽等，諸多研究表明這幾類疾病都與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[32-33]，其中肢體動脈硬化閉塞癥是動脈粥樣硬化發(fā)生于周圍血管時引起遠端肢體缺血的相關(guān)病癥[34]，二者病因有著緊密聯(lián)系，發(fā)病機制主要與血栓形成以及血管內(nèi)皮細胞受損有關(guān)；壞疽的形成也與高血糖通過促進動脈粥樣硬化、血液的高凝狀態(tài)、廣泛的微血栓形成等病理過程使周圍血管發(fā)生閉塞樣改變有關(guān)[35]。綜上所述，從四妙勇安湯中篩選得到的9個入血關(guān)鍵成分可能主要通過抗炎、保護血管內(nèi)皮細胞、抗血栓等作用治療疾病。在基于“有效性”篩選得到的9個重要入血成分的基礎(chǔ)上，綜合考慮《中國藥典》中對于四妙勇安湯中4味藥材含量測定規(guī)定的指標成分、特征性成分，預(yù)測四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的潛在Q-Marker，為四妙勇安湯的質(zhì)量評價與制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

四妙勇安湯主治熱毒熾盛之脫疽，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的糖尿病足潰瘍、血栓閉塞性脈管炎、糖尿病大血管病變等均屬該范疇[16,36]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分以上述疾病為研究對象，篩選出四妙勇安湯治療熱毒熾盛之脫疽的42個關(guān)鍵功效靶點，主要涉及炎癥因子、MAPK、VEGFA等其他靶點3大類。這些靶點通過發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抗炎、保護血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血管新生等作用，從而治療熱毒熾盛之脫疽。

IL-1β、IL-6、TNF等促炎介質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[37-38]?，F(xiàn)代研究表明血栓閉塞性脈管炎、肢體動脈硬化閉塞癥與炎癥密切相關(guān)，四妙勇安湯可降低血栓閉塞性脈管炎模型大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6等炎癥因子的含量，減少它們對血管內(nèi)皮細胞的損傷，從而對血栓閉塞性脈管炎發(fā)揮一定的保護作用[39-40]；加味四妙勇安湯可能通過降低超敏C反應(yīng)蛋白、IL-6等炎癥因子的含量，進而對下肢動脈硬化閉塞癥急性期起到治療作用[41]。在本研究的驗證實驗中，模型組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達較對照組顯著增加，四妙勇安湯和二甲雙胍組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達均明顯下降。表明四妙勇安湯可以通過調(diào)節(jié)熱毒熾盛之脫疽大鼠TNF信號通路蛋白TNF-α、IL-1β的表達治療糖尿病潰瘍。

MAPK主要包括MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14等，廣泛參與細胞增殖、分化、遷移、轉(zhuǎn)化、程序性細胞死亡和炎性反應(yīng)[42]。研究表明，MAPK可能是四妙勇安湯“異病同治”脫疽、糖尿病和冠心病的關(guān)鍵靶點[18]。VEGFA是促進血管新生的主要生長因子之一，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化，促進內(nèi)皮細胞的擴張、增殖和遷移[43-44]。四妙勇安湯可以通過上調(diào)的基因表達，從而促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化[45]。VEFG水平較高時為創(chuàng)面肉芽增生、表皮的生長提供條件，對潰瘍愈合有促進作用[46]。IFN-γ能激活巨噬細胞，促進B細胞活化產(chǎn)生抗體，激活中性粒細胞功能和NK細胞殺傷活性，在抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中MAPK、VEGF、IFN-γ水平較對照組顯著上升，給予四妙勇安湯后，大鼠血清中MAPK、VEGF和IFN-γ水平均顯著降低，表明四妙勇安湯可以調(diào)節(jié)熱毒熾盛之脫疽大鼠血清中MAPK、VEGF、IFN-γ水平從而發(fā)揮治療作用。

另外，篩選得到的9個重要入血成分中，并未包含四妙勇安湯中4味藥材在《中國藥典》2020年版所規(guī)定的綠原酸、木犀草苷、阿魏酸、哈巴苷、哈巴俄苷、甘草酸、甘草苷等指標成分，上述成分可能由于溶解度小[47]、口服吸收差[48-50]、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、易水解[51]、被分解為其他成分[52]等原因，未在此次研究中檢出。由于本次研究重點關(guān)注內(nèi)容為入血原型成分，暫未涉及對代謝產(chǎn)物以及腸道菌群對原型成分的影響，課題組后續(xù)也將在本研究的基礎(chǔ)上圍繞此類成分進行深入研究，同時對于以上已被研究證實的重要有效成分，也應(yīng)辨識為四妙勇安湯的潛在Q-Marker。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Potential Q-Markers of Simiao Yong’an Decoction based on “component absorbed into blood-efficacy of compound prescription-target pathway”

ZHOU Jing-wei1, ZHANG Xing1, LI Sha1, ZHU Rui1, WU Qiu-hong1, HUANG You1, YANG Sha-sha1, LIN Xia1, HAO Yi-wen1, FU Chao-mei1, ZHANG Zhen1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Key Laboratory of Quality Control and Efficacy Evaluation of Traditional Chinese Medicine Formula Granules, Sichuan New Green Pharmaceutical Technology Development Co., Ltd., Pengzhou 610031, China

To predict the potential quality marker (Q-Marker) of Simiao Yong’an Decoction (四妙勇安湯) by combining serum medicinal chemistry and network pharmacology, and based on these results, animal experiments were carried out to verify it.HPLC-Q-TOF/MS was used to analyze the blood components of Simiao Yong’an Decoction. Based on the combination of components absorbed into blood and network pharmacology, main targets and pathways were predicted. Cytoscape software was used to construct “component absorbed into blood-efficacy of compound prescription-target pathway” network. Based on the correlation between the topological analysis results and traditional efficacy of Simiao Yong’an Decoction, potential Q-Markers of Simiao Yong’an Decoction were comprehensively determined. On this basis, rats model of gangrene due to excessive noxious heat was established. After successful modeling, rats were continuously ig Simiao Yong’an Decoction (57 g/kg) for 2 weeks. After the experiment, wound healing rate of rats in each group was calculated, levels of mitogen-activated protein kinase (MAPK), interferon-γ (IFN-γ) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in serum of each group were detected, protein expressions of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in wound tissue were detected by immunohistochemistry.Twenty components absorbed into blood of Simiao Yong’an Decoction were identified. Combined with network pharmacology, 42 key efficacy targets and 62 related pathways of Simiao Yong’an Decoction in treatment of gangrene due to excessive noxious heat were screened out. According to degree value between compounds, targets and signaling pathways, nine potential blood components related to efficacy such as luteolin, isorhamnetin, and liquiritigenin were preliminarily predicted, and combined with the main active components such as chlorogenic acid as Simiao Yong’an Decoction potential Q-Markers. The results of animal experiments showed that Simiao Yong’an Decoction significantly increased the wound healing rate of gangrene due to excessive noxious heat rats (< 0.05), significantly modulated the levels of key efficacy targets (VEGF, MAPK, IFN-γ) in serum (< 0.05), and significantly reduced TNF signaling pathway related protein (TNF-α, IL-1β) expressions in wounded tissues (< 0.05).The potential Q-Marker of Simiao Yong’an Decoction in treating gangrene due to excessive noxious heat was predicted by combining serum pharmacochemistry with network pharmacology, which provided scientific basis for overall control and evaluation of Simiao Yong’an Decoction quality. Animal experiments preliminarily confirmed that Simiao Yong’an Decoction can regulate key functional target proteins such as VEGF, MAPK and IFN-γ, as well as proteins related to TNF signaling pathway, thereby play a role in treating gangrene due to excessive noxious heat.

Simiao Yong’an Decoction; quality marker; serum pharmacochemistry; network pharmacology; gangrene due to excessive noxious heat; luteolin; isorhamnetin; liquiritigenin; chlorogenic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2022)24 - 7795 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.017

2022-08-06

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（81803742）；四川省科技計劃重點研發(fā)項目（2020YFS0567）；四川省科技廳四川省科技計劃項目（2021YJ0251）；四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研專項（2021MS109）；四川省教育廳自然科學(xué)重點項目（18ZA0187）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者青年學(xué)者專項（QNXZ2019031）；四川新綠色藥業(yè)博士后科研專項（301022019）

周靖惟，男，研究方向為中藥新制劑和新劑型。E-mail: 1026990524@qq.com

傅超美，男，教授，主要從事中藥新制劑和新劑型研究。E-mail: chaomeifu@126.com

張 臻，女，副教授，主要從事中藥制劑新技術(shù)新劑型、中藥復(fù)方功效與作用機制研究。E-mail: zhangzhendr@126.com

#共同第一作者：張 星，女，碩士研究生，研究方向為中藥新制劑和新劑型。E-mail: 2381225006@qq.com

[責任編輯 李亞楠]