郭 芬， 孟小慶， 劉思媛， 張成彬， 李宗蕓， 朱明庫

(江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

植物在生長發(fā)育過程中，會遭受各種各樣的生物與非生物脅迫，其生長、發(fā)育以及產(chǎn)量會受到嚴(yán)重的影響[1].為適應(yīng)多變的環(huán)境，植物已進(jìn)化形成一系列復(fù)雜的抗性機(jī)制，這些機(jī)制通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)使植物可在惡劣的環(huán)境中生存下來[2].在此過程中，轉(zhuǎn)錄因子扮演著關(guān)鍵角色，它通過與靶基因啟動子中的順勢作用元件相結(jié)合，調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)；這些轉(zhuǎn)錄因子包括NAC、WRKY、MYB、BZIP、ERF等[3].另外，除了在植物應(yīng)答鹽、旱等非生物脅迫中發(fā)揮作用外，轉(zhuǎn)錄因子還參與對多種激素的調(diào)控過程[3].

WRKY蛋白因含有1個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一.WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以識別并結(jié)合目標(biāo)基因啟動子中的W-box (TGACC(A/T)序列[4].WRKY結(jié)構(gòu)域長度約為60個氨基酸，其N末端含有1個保守的7肽核心序列WRKYGQK，C端有1個C2H2型 (CX4-5CX22-23HXH)或C2HC型 (CX7CX23HXC)鋅指基序[5-6].同時，在WRKY轉(zhuǎn)錄因子中還發(fā)現(xiàn)了其他形式的7肽，包括WRKYGKK、WKKYGQK和WRKYGEK.由于WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指基序的氨基酸序列的不同，故將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ 3組[5].Group Ⅰ包含2個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；Group Ⅱ與Group Ⅲ都含有1個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，但Group Ⅱ的C端的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，而Group Ⅲ的為C2HC[6-7].同時，Group Ⅱ根據(jù)鋅指基序差異可進(jìn)一步分為5個亞組：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[5].

目前，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫應(yīng)答中的調(diào)控功能已被廣泛報(bào)道[8].如擬南芥WRKY46、WRKY54和WRKY70轉(zhuǎn)錄因子參與了由油菜素內(nèi)酯調(diào)控的植物生長和干旱響應(yīng)[9]，WRKY25、WRKY26與WRKY33則協(xié)同增強(qiáng)了擬南芥植株對熱脅迫的耐受性[10].在作物中研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OsWRKY11的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗耐熱和抗旱性明顯增強(qiáng)[11]，在擬南芥中過表達(dá)OsWRKY45則增強(qiáng)了其抗病性和耐旱性[12].最近的研究表明，棠梨PbWRKY40轉(zhuǎn)錄因子通過直接調(diào)控PbVHA-B1的表達(dá)來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[13].

甘薯屬于旋花科番薯屬，具有產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)和適應(yīng)性廣等特性，是主要的糧食作物與生物能源作物.世界各地廣泛種植甘薯，其中我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國及消費(fèi)國.2018年我國甘薯種植面積占世界的29.0%，產(chǎn)量占世界的57.0%，總產(chǎn)量僅次于水稻、小麥和玉米[14-15].然而，鹽、旱等脅迫仍顯著制約甘薯的產(chǎn)量及品質(zhì)，因此，培育高抗甘薯新品種具有重要意義.目前，對甘薯中WRKY基因的研究十分有限.Qin等[16]通過對鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序，從濟(jì)薯26號和農(nóng)林54號中鑒定到79個甘薯WRKY基因.研究發(fā)現(xiàn)，甘薯IbWRKY2的過表達(dá)明顯增強(qiáng)了擬南芥的耐鹽抗旱性[17].本研究以抗性較強(qiáng)的徐薯22為研究材料，通過轉(zhuǎn)錄組分析，從甘薯中篩選出1個受鹽脅迫誘導(dǎo)的IbWRKY53L基因，對其進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，同時利用qRT-PCR檢測其對多種非生物脅迫，如鹽、PEG6000、冷和熱以及不同激素(ACC、ABA、SA和JA)處理的響應(yīng)特性，旨在為進(jìn)一步研究甘薯IbWRKY53L基因在非生物脅迫響應(yīng)中的潛在功能奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 植物材料

徐薯22由江蘇徐州甘薯研究中心提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RNA提取使用來自天根生物科技有限公司的RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄使用的PrimeScript酶、基因克隆使用的PrimeSTARRHS DNA聚合酶、pMD19-T載體以及qRT-PCR所需要的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ均購自大連寶生物(TakaRa)公司.

1.3 RNA的提取和IbWRKY53L基因的PCR擴(kuò)增、克隆及測序

按照總RNA提取試劑盒說明書提取徐薯22混合組織(根、葉等)的RNA，隨后合成cDNA.在Primer Premier 5.0軟件中設(shè)計(jì)IbWRKY53L基因的克隆引物(表1)，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成.PCR反應(yīng)過程為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次.隨后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步判斷，若條帶正確，則純化目的片段并連接到pMD19-T載體，隨后轉(zhuǎn)化于DH5α，篩選陽性菌落，送南京擎科生物科技有限公司測序.

表1 基因克隆及qRT-PCR表達(dá)分析引物Tab.1 Primers used in cloning and qRT-PCR analysis

1.4 IbWRKY53L基因生物信息學(xué)分析

利用一系列在線軟件包對IbWRKY53L基因及編碼蛋白進(jìn)行綜合生物信息學(xué)分析.所用網(wǎng)址見表2.

表2 IbWRKY53L序列生物信息學(xué)分析所用在線工具Tab.2 Websites used for bioinformatics analysis of IbWRKY53L sequence

1.5 IbWRKY53L序列的多重比對及進(jìn)化樹分析

結(jié)合NCBI中的BlastP在線程序及已有文獻(xiàn)報(bào)道，首先查找與IbWRKY53L同源的WRKY序列，并通過DNAMAN 5.0進(jìn)行序列多重比對.隨后，對IbWRKY53L蛋白與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、三裂葉薯(Ipomoeatriloba)、玉米(Zeamays)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等物種中不同家族的WRKY蛋白序列，使用最大似然法通過MEGA X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000.

1.6 植株的不同非生物脅迫及激素處理

參考孟小慶等的方法[18]，選取生長狀況一致的徐薯22幼苗在霍格蘭培養(yǎng)液中水培生根，選擇長勢基本一致的植株進(jìn)行處理.鹽處理：用100 mmol/L NaCl溶液處理植株,收集根樣品.干旱處理：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEG6000處理植株,收集根樣品.冷處理：將植株放在4 ℃環(huán)境,收集葉樣品.熱處理：將植株放在40 ℃環(huán)境,收集葉樣品.激素處理:分別用100 μmol/L的脫落酸(ABA)、氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC，乙烯前體)、茉莉酸(JA)及2 mmol/L的水楊酸(SA)噴施植株，收集葉樣品.以上分別在處理0、1、12、24、48 h后收集所需組織的樣品.

1.7 甘薯IbWRKY53L基因表達(dá)模式分析

按照RNA提取試劑盒說明書提取徐薯22植株在不同脅迫和激素處理下根及葉組織樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.隨后，在Primer Premier 5.0軟件中設(shè)計(jì)IbWRKY53L基因的qRT-PCR檢測引物，引物序列見表1.以對照、各非生物脅迫及激素處理下的植物cDNA為模版，以甘薯的ARF基因?yàn)閮?nèi)參基因[19]，在伯樂CFX96 Real-Time系統(tǒng)(美國)進(jìn)行qRT-PCR分析.qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min,40個循環(huán).隨后，用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量.最后,將結(jié)果用Origin 8.0軟件作柱狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 IbWRKY53L基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1IbWRKY53L基因及所編碼蛋白的分子特性分析我們從徐薯22鹽處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到1個WRKY基因，分析發(fā)現(xiàn),它與課題組從泰中6號中鑒定到的84個IbWRKY蛋白(未發(fā)表)中的IbWRKY53蛋白序列相似度最高,為90.1%，這可能是因不同甘薯品種間的序列差異引起的，故將該基因命名為IbWRKY53-like(簡寫為IbWRKY53L).序列分析表明,IbWRKY53L基因開放閱讀框的長度為1 092 bp，編碼363個氨基酸殘基.

通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示，IbWRKY53L蛋白包含1個290—347位的WRKY保守結(jié)構(gòu)域(圖1a)，因此,確定該蛋白屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員.ProtParam對IbWRKY53L基因序列編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測分析表明，該蛋白的理論分子量是39 032.97 Da，為堿性不穩(wěn)定蛋白(表3).蛋白理化性質(zhì)中平均疏水系數(shù)分析以及ProtScale分析顯示,其蛋白疏水區(qū)域的面積小于親水區(qū)域面積，說明IbWRKY53L蛋白為親水性蛋白(表3，圖1b).磷酸化位點(diǎn)分析顯示,IbWRKY53L蛋白含有潛在的46個絲氨酸(Ser)、7個蘇氨酸(Thr)和2個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(圖1c)，這些位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化，進(jìn)而對此蛋白的活性與功能產(chǎn)生一定的調(diào)控作用.亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于細(xì)胞核.另外，預(yù)測還發(fā)現(xiàn)IbWRKY53L不具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域(結(jié)果未展示).

表3 IbWRKY53L蛋白理化性質(zhì)預(yù)測Tab.3 Predicted physical and chemical properties ofIbWRKY53L protein

2.1.2 IbWRKY53L蛋白二級及三級結(jié)構(gòu)分析二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,IbWRKY53L蛋白主要由無規(guī)則卷曲(67.22%)、α螺旋(19.83%)、延伸鏈(9.92%)和β轉(zhuǎn)角(3.03%)結(jié)構(gòu)組成(圖1d).通過三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的典型三級結(jié)構(gòu)(圖1e).

圖1 IbWRKY53L的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of IbWRKY53L

2.1.3 IbWRKY53L蛋白的多重序列比對及進(jìn)化樹分析用DNAMAN軟件對IbWRKY53L與來自多個物種的WRKY蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，這些蛋白均含有1個高度保守的7肽序列WRKYGQK及1個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，二者共同構(gòu)成WRKY結(jié)構(gòu)域.其中，IbWRKY53L與甘薯近緣野生種三裂葉薯ItbWRKY7的序列相似性最高，達(dá)到96.2% (圖2)，三裂葉薯可能是甘薯近緣野生種支撐了該結(jié)果.

保守的7肽序列WRKYGQK及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)分別用紅色和藍(lán)色方框標(biāo)識圖2 IbWRKY53L蛋白的多重序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of IbWRKY53L protein

將IbWRKY53L蛋白序列與擬南芥、玉米等不同物種的不同家族的WRKY蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明,IbWRKY53L與Ⅱd亞組的擬南芥AtWRKY11及AtWRKY17聚在同一分支[5]，因此，其屬于WRKY家族中的Ⅱd亞組(圖3).另外，除了三裂葉薯ItbWRKY7之外，與IbWRKY53L同源關(guān)系較近的為牽?；↖nWRKY7蛋白，二者蛋白序列相似性為93.5%.

IbWRKY53L用紅色方框標(biāo)識.圖3 IbWRKY53L蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of IbWRKY53L protein

2.2 IbWRKY53L基因在多種非生物脅迫處理下的表達(dá)特性分析

采用qRT-PCR技術(shù)分析IbWRKY53L基因在鹽、PEG6000、冷及熱脅迫處理下的相對表達(dá)量,結(jié)果顯示，在鹽與熱脅迫處理下，IbWRKY53L基因的表達(dá)量與對照組相比都在1 h達(dá)到高峰，分別為對照的1.5倍和2.6倍.冷脅迫下，基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，在1 h時最低，而后開始上調(diào)，在24 h及48 h時,相對表達(dá)量約為對照的1.6倍.相反，PEG6000處理下，基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢(圖4).

圖4 qRT-PCR檢測不同非生物脅迫處理下IbWRKY53L基因的表達(dá)水平Fig.4 Identification of the expression of IbWRKY53Lgene under different abiotic stresses by qRT-PCR

2.3 IbWRKY53L基因在不同激素處理下的表達(dá)特性分析

qRT-PCR技術(shù)分析表明,ABA處理后12 h可上調(diào)IbWRKY53L基因的表達(dá)，誘導(dǎo)水平約為對照的1.75倍.JA與SA處理以呈現(xiàn)上升的趨勢誘導(dǎo)IbWRKY53L基因的表達(dá)，48 h時的表達(dá)量分別為對照組的2.5倍和2倍.但ACC處理下的表達(dá)量隨著時間的延長，呈現(xiàn)下降趨勢(圖5).

圖5 qRT-PCR檢測不同激素處理下IbWRKY53L基因的表達(dá)水平Fig.5 Identification of the expression of IbWRKY53Lgene under various hormones by qRT-PCR

總的來說，IbWRKY53L基因?qū)?種激素及鹽、旱、冷、熱這些脅迫都有一定程度的應(yīng)答.

3 討論與結(jié)論

非生物脅迫是影響甘薯產(chǎn)量的重要因素之一，在長期進(jìn)化過程中,甘薯已形成復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，能夠在各種脅迫下生存，但產(chǎn)量和品質(zhì)依然受到多種非生物脅迫的制約[20].研究表明，WRKY可以通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)或者通過ABA、ROS等相關(guān)的信號通路調(diào)節(jié)植物的脅迫耐受性[21].首個WRKY編碼基因SPF1于1994年在甘薯中被發(fā)現(xiàn)后[22]，大量不同物種的WRKY家族的基因被廣泛鑒定，如已分別在擬南芥、水稻和小麥中鑒定到74、102和124個WRKY基因[23-24].目前，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，但在重要的糧食作物甘薯中研究不足.因此，在抗性強(qiáng)的非模式作物甘薯中進(jìn)行深入的探究是必要的，這將為抗逆遺傳改良提供理論依據(jù).

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，我們篩選到的IbWRKY53L蛋白定位于細(xì)胞核，這與它作為轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)期結(jié)果一致.另外，IbWRKY53L為親水性蛋白，無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)域，故排除它為分泌蛋白，這與許多WRKY蛋白的結(jié)論一致.另外，通過表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，IbWRKY53L基因受到鹽、冷和熱脅迫的誘導(dǎo).之前的許多報(bào)道表明，脅迫響應(yīng)的WRKY基因廣泛參與對多種植物非生物脅迫耐受性的調(diào)節(jié)[6,8].例如，小麥TaWRKY75-A基因受鹽、旱等多種非生物脅迫的誘導(dǎo)[24]，類似的情況在擬南芥WRKY25/26/33及水稻OsWRKY45/72基因中也被發(fā)現(xiàn)[6,10,12].此外，研究結(jié)果表明，來自同一亞組的WRKY成員可能具有相似的功能，例如Ⅱd亞組的AtWRKY39與熱耐受性密切相關(guān)[6,25].這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，同為Ⅱd亞組的IbWRKY53L可能參與非生物脅迫耐受性.

另外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被證實(shí)是連接植物激素信號(ABA、JA和SA等)以響應(yīng)環(huán)境壓力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6,25],如擬南芥WRKY57被證實(shí)通過直接調(diào)控ABA信號相關(guān)的RD29A和NCED3基因來提高擬南芥的耐旱性[26].脅迫激素ABA能夠上調(diào)IbWRKY53L的表達(dá)，推測它可能通過依賴于ABA的信號途徑參與脅迫響應(yīng).激素JA和SA在植物應(yīng)答病原體和非生物脅迫的防御反應(yīng)中均起著關(guān)鍵作用[27]，比如OsWRKY45在SA介導(dǎo)的防御反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色，其過表達(dá)顯著增強(qiáng)了水稻的稻瘟病抗性[28].IbWRKY53L基因的表達(dá)受JA和SA的誘導(dǎo)，暗示它可能也參與甘薯病原體感染等生物脅迫應(yīng)答，但這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí).這些研究結(jié)果為繼續(xù)探究IbWRKY53L基因在甘薯脅迫應(yīng)答中的潛在功能奠定了基礎(chǔ).