王念,王博,冷媛媛,祁軼斐,李兵,張瑩瑩,雷蕾,王忠,劉駿
1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所,北京 100700
冠心病是影響全球人口的主要心血管疾病之一[1],屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇,依據(jù)勞倦、寒邪、情志、飲食等致病因素,可以辨為寒凝、痰濁、陰虛、陽虛、血瘀等不同證候[2]。現(xiàn)代研究表明,血瘀證患者冠脈病變及血管內(nèi)皮損傷程度較其他證型重,不僅因?yàn)樵摬〉陌l(fā)病關(guān)鍵在于心血瘀阻,也因?yàn)槠渌C型的冠心病在病情進(jìn)展的過程中同樣會(huì)出現(xiàn)血瘀的病理特征,即血液凝滯等現(xiàn)象[2]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)包括信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(cirRNA)、假基因等[3],能夠通過應(yīng)答元件(MREs)相互作用,構(gòu)成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),如微小RNA(miRNA)能夠結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默,ceRNA可以通過MREs與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而解除其對(duì)基因的抑制作用,ceRNA調(diào)控機(jī)制存在于冠心病發(fā)生發(fā)展過程中。
中醫(yī)證候生物學(xué)機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn),但基于ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究仍然缺乏,網(wǎng)絡(luò)科學(xué)的進(jìn)步促進(jìn)了生物網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)重要生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)的過程,能夠幫助分析復(fù)雜的疾病過程,以功能模塊的信息流變化體現(xiàn)生物反應(yīng),更加全面理解多種生物分子之間的相互作用[4]。模塊藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)下,對(duì)復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化分析,能夠度量和整合模塊對(duì)網(wǎng)絡(luò)干預(yù)的特征[5]。從模塊藥理學(xué)角度分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)是研究證候生物學(xué)機(jī)制的新思路,從而揭示血瘀證的復(fù)雜性和系統(tǒng)性。本研究通過構(gòu)建lncRNA相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò),即lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),利用公共數(shù)據(jù)庫發(fā)表的冠心病血瘀證相關(guān)基因,以模塊藥理學(xué)方法尋找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),通過文獻(xiàn)預(yù)測(cè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之間的調(diào)控關(guān)系,形成調(diào)控軸,并進(jìn)行序列驗(yàn)證,從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平揭示冠心病血瘀證的潛在機(jī)制。
1.1.1 冠心病相關(guān)基因
以“coronary artery disease”為關(guān)鍵詞,分別通過HMDD3.2(http://www.cuilab.cn/hmdd/)[6-8]查找冠心病相關(guān)miRNA,通過DisGeNET7.0[9](https://www.disgenet.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)、GeneCards 5.1(https://www.genecards.org/)、TTD[10](http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫查找冠心病相關(guān)mRNA,通過lncRNADisease2.0(http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/)數(shù)據(jù)庫查找冠心病相關(guān)lncRNA。
1.1.2 血瘀證相關(guān)基因
以中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì)制定的《冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》[11]的主要指標(biāo)及次要指標(biāo)為依據(jù),選擇血瘀證檢索詞。以“chest pain”(胸痛)、“oppression in chest”(胸悶)、“ecchymosis on tongue”(舌生瘀斑)、“palpitation”(心悸)為關(guān)鍵詞[12],通過OMIM數(shù)據(jù)庫檢索血瘀證癥狀表型的相關(guān)mRNA。
比較上述方法獲取的冠心病相關(guān)mRNA與血瘀證相關(guān)mRNA,以二者相同基因作為冠心病血瘀證基因。
利用starBase3.0[13](http://starbase.sysu.edu.cn/)平臺(tái)的miRNA-target interactions模塊、miRNAlncRNA interactions模塊、lncRNA-ceRNA interactions模塊預(yù)測(cè)lncRNA-miRNA-mRNA之間的靶標(biāo)關(guān)系,建立相互作用網(wǎng)絡(luò)。
使用Cytoscape3.7.0軟件clusterMaker插件中的3種算法MCODE(molecular complex detection)、馬爾可夫聚類(Markov cluster,MCL)及GLay算法(均以默認(rèn)參數(shù))對(duì)上述整合的冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊識(shí)別。為得到相對(duì)穩(wěn)定可靠的結(jié)果,采用課題組前期提出的最小網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵的方法[14]對(duì)以上3種模塊劃分方式進(jìn)行比較,從而確定本研究所使用的模塊識(shí)別方法。計(jì)算公式:。式中,N為網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)目,Ii為第i個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要度(節(jié)點(diǎn)的重要度定義為每個(gè)節(jié)點(diǎn)連接度占所有節(jié)點(diǎn)連接度總和的比例)[14]。
利用WebGestalt[15](http://www.webgestalt.org/)分析平臺(tái)對(duì)冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析。
ceRNA調(diào)控軸預(yù)測(cè)條件:①miRNA、mRNA、lncRNA存在于同一模塊中;②檢索中文數(shù)據(jù)庫中國知識(shí)資源總庫(CNKI)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(維普網(wǎng))、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái),以及英文數(shù)據(jù)庫PubMed、Web of Science,檢索時(shí)間范圍為建庫至2021年4月,中文檢索詞為miRNA、mRNA、lncRNA的基因symbol(如“UCA1”)與“冠心病”,英文檢索詞為基因symbol與“Coronary Artery Disease”“Coronary Heart Disease”。③篩選條件為單個(gè)節(jié)點(diǎn)冠心病生理病理相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量≥5篇,報(bào)道lncRNA-miRNAmRNA三者之間關(guān)系(檢索詞為lncRNA and miRNA and mRNA,如“UCA1 and miR-1 and G6PD”)的文獻(xiàn)數(shù)量≥5篇;如果沒有直接闡述三者之間調(diào)控關(guān)系的文章,則選擇分別報(bào)道lncRNA-miRNA、miRNAmRNA調(diào)控關(guān)系的文獻(xiàn)(檢索詞為lncRNA and miRNA,miRNA and mRNA,如“UCA1 and miR-1”“miR-1 and G6PD”),納入文獻(xiàn)數(shù)量≥5篇的靶標(biāo)關(guān)系對(duì)。④閱讀文獻(xiàn)全文,篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的節(jié)點(diǎn)及調(diào)控關(guān)系,納入進(jìn)行組學(xué)檢測(cè)并驗(yàn)證的臨床研究性文獻(xiàn),記錄文獻(xiàn)中驗(yàn)證的靶標(biāo)關(guān)系。
MRE是ceRNA網(wǎng)絡(luò)發(fā)生相互作用的關(guān)鍵因素,是構(gòu)成調(diào)控作用的基礎(chǔ)[16]。starBase平臺(tái)中的miRNATarget版塊及l(fā)ncRNA-ceRNA版塊能夠分別基于CLIPsep對(duì)miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA互作關(guān)系進(jìn)行挖掘,并提供PITA、RNA22、miRmap、DIANAmicroT、miRanda、PicTar和TargetScan等數(shù)據(jù)庫中的MRE序列比對(duì)。在miRNA-Target版塊輸入miRNA與mRNA的名稱,以默認(rèn)參數(shù)檢索兩者相互作用的MRE,在lncRNA-ceRNA版 塊 中 輸 入miRNA與lncRNA的名稱,以默認(rèn)參數(shù)檢索相互作用的MRE,驗(yàn)證miRNA-lncRNA與miRNA-mRNA兩者的MRE是否相同,從而確定調(diào)控軸能否存在。
以“coronary artery disease”為關(guān)鍵詞在HMDD數(shù)據(jù)庫檢索得到73個(gè)冠心病相關(guān)miRNA;在DisGeNET、GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫分別檢索得到1 709、6 998、1 038、21個(gè)mRNA,去除重復(fù)后共得到8 158個(gè)mRNA;在lncRNADisease數(shù)據(jù)庫檢索得到冠心病相關(guān)lncRNA 130個(gè)。通過OMIM數(shù)據(jù)庫分別檢索得到16(chest pain)、2 713(oppression in chest)、521(ecchymosis on tongue)、2 343(palpitation)個(gè)血瘀證相關(guān)mRNA,去除重復(fù)后共得到5 197個(gè)mRNA。
冠心病相關(guān)基因及血瘀證相關(guān)基因共有1 211個(gè)相同的mRNA,作為冠心病血瘀證相關(guān)基因。
通過starBase篩選由HMDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出的73個(gè)miRNA相關(guān)的mRNA及l(fā)ncRNA,即冠心病相關(guān)基因之間所有的靶標(biāo)關(guān)系對(duì)(miRNA-lncRNA,miRNAmRNA,lncRNA-mRNA)。HMDD數(shù) 據(jù) 庫 未 對(duì)miRNA的“-3p”“-5p”端臂加以區(qū)分,starBase數(shù)據(jù)庫對(duì)此加以區(qū)分,最終73個(gè)miRNA(不區(qū)分“-3p”“-5p”端臂)在starBase數(shù)據(jù)庫中共有72個(gè)miRNA(區(qū)分“-3p”“-5p”端臂)實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)。此外,在ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程中,補(bǔ)充了lncRNA-mRNA之間的靶標(biāo)關(guān)系,使網(wǎng)絡(luò)更加全面、穩(wěn)定。
由72個(gè)miRNA預(yù)測(cè)共得到miRNA-mRNA靶標(biāo)關(guān)系271 817對(duì),miRNA-lncRNA靶標(biāo)關(guān)系82 616對(duì),lncRNA-mRNA靶標(biāo)關(guān)系58 761對(duì)。篩選同時(shí)存在于冠心病血瘀證中的mRNA及miRNA-mRNA、lncRNAmRNA靶標(biāo)關(guān)系中的mRNA,交集結(jié)果見圖1。共有182個(gè)mRNA同時(shí)存在于以上三者之中,以此作為構(gòu)建冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)的mRNA,并在預(yù)測(cè)的靶標(biāo)關(guān)系對(duì)中篩選與之有靶標(biāo)關(guān)系的lncRNA、miRNA,得到72個(gè)miRNA、29個(gè)lncRNA。以上述步驟篩選出的182個(gè)mRNA、72個(gè)miRNA、29個(gè)lncRNA構(gòu) 建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape3.7.0對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理(見圖2),并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析,包括節(jié)點(diǎn)、度、緊密度中心性、介數(shù)中心性以及平均最短路徑長度等。該網(wǎng)絡(luò)共有283個(gè)節(jié)點(diǎn)、4 990條邊,網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)最大度值為154,其中有26個(gè)節(jié)點(diǎn)度值≥80。節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)見表1。
圖2 冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)
通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹梢钥闯觯琹ncRNANEAT1(核旁斑點(diǎn)組裝轉(zhuǎn)錄本1)在網(wǎng)絡(luò)中度值最大,表明與之相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)最多,NEAT1在乳腺癌等婦科癌癥中大量表達(dá),其可通過抑制相應(yīng)的miRNA或與調(diào)節(jié)蛋白相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,是一種重要的生物標(biāo)志物,亦是有前景的治療靶點(diǎn)[17]。在冠心病患者中,NEAT1通過激活miR-140-3p/MAPK1通路增加細(xì)胞活力并抑制冠心病細(xì)胞凋亡,能夠作為冠心病的潛在治療靶點(diǎn)[18]。度值≥80的節(jié)點(diǎn)中有23個(gè)節(jié)點(diǎn)是miRNA,這不僅反映miRNA與冠心病的關(guān)系密切,同時(shí)也在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中起到重要的連接作用。如hsa-miR-340-5p在冠心病患者的血小板中表達(dá)上調(diào)[19],hsa-miR-106-5p可作為炎癥標(biāo)志物、hsa-miR-137可作為細(xì)胞損傷標(biāo)志物,幫助診斷不穩(wěn)定型心絞痛患者心肌缺血并對(duì)缺血的嚴(yán)重程度進(jìn)行分層[20]。
網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵值能夠有效刻畫無尺度網(wǎng)絡(luò)的無序性。從大網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別出功能模塊的過程是系統(tǒng)從無序到有序的變化,是系統(tǒng)能量分布從均勻到不均勻的變化,是一個(gè)熵減的過程,且熵越小,系統(tǒng)越穩(wěn)定。模塊識(shí)別的最終目的是要找到一種穩(wěn)定的模塊化狀態(tài),這種狀態(tài)具有最小的不確定性[21]。
分別計(jì)算MCODE、MCL、GLay模塊劃分的熵值,結(jié)果見表2。
表2 冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)3種模塊劃分方法比較
根據(jù)熵值最低原則,選擇MCODE作為模塊劃分方式。MCODE算法共識(shí)別出11個(gè)模塊(節(jié)點(diǎn)數(shù)≥3),見圖3。根據(jù)MCODE評(píng)分排序,最大模塊有31個(gè)節(jié)點(diǎn)和107條邊,評(píng)分7.133分;最小模塊有4個(gè)節(jié)點(diǎn)和4條邊,評(píng)分2.667分。
圖3 MCODE劃分出的冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)11個(gè)模塊
GO注釋包含生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、和分子功能(MF),對(duì)冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)富集分析共識(shí)別出211個(gè)RNA,其中BP涉及生物調(diào)節(jié)、代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞復(fù)制等過程,CC顯示分布在20個(gè)細(xì)胞組分中,MF主要集中在蛋白質(zhì)結(jié)合、離子束縛、核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合等功能。FDR<0.05的前10個(gè)條目見圖4。KEGG分析顯示冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)富集到62條通路(FDR<0.05),集中在腫瘤、局部黏附、PI3K-Akt信號(hào)通路等方面,前10條通路見圖5。
圖4 冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)mRNA的GO富集分析
圖5 冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)mRNA的KEGG通路富集分析
模 塊1、2、6、7同 時(shí) 包 含3種RNA,因 此lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控軸可能存在于以上4個(gè)模塊中。對(duì)4個(gè)模塊中的基因分別進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,基于5個(gè)數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn),模塊1、2、7的節(jié)點(diǎn)未在文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)冠心病生理病理相關(guān)的上下游調(diào)控關(guān)系,模塊6中節(jié)點(diǎn)具有調(diào)控關(guān)系,且符合調(diào)控軸預(yù)測(cè)原則。模塊1中節(jié)點(diǎn)PVT1、hsa-miR-370-5p、hsa-miR-16-5p、
hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-23a-3p、TGFBR1、MTRR、MTHFR、OLR1、GCLC、APC、RAP1A均報(bào)道與冠心病生理相關(guān),但并無文獻(xiàn)報(bào)道節(jié)點(diǎn)之間的調(diào)控關(guān)系;模 塊2中 節(jié) 點(diǎn)hsa-miR-130a-5p、CD46、CXCL12、CAV1、H19均報(bào)道與冠心病生理相關(guān),但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的調(diào)控關(guān)系與冠心病無關(guān);模塊7中節(jié)點(diǎn)HOTAIR、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-214-3p均報(bào)道與冠心病生理相關(guān),但其之間存在的調(diào)控關(guān)系與冠心病生理病理無關(guān)。只有模塊6中UCA1、miR-1、G6PD3個(gè)節(jié)點(diǎn)符合調(diào)控軸預(yù)測(cè)條件,其中UCA1冠心病生理病理相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道5篇,miR-1文獻(xiàn)報(bào)道44篇,G6PD文獻(xiàn)報(bào)道5篇。UCA1-miR-1-G6PD三者之間相關(guān)關(guān)系的文獻(xiàn)共報(bào)道17篇,與冠心病生理病理相關(guān)的文獻(xiàn)5篇,符合調(diào)控軸預(yù)測(cè)要求,其中有4篇文獻(xiàn)經(jīng)過驗(yàn)證。該軸靶向關(guān)系體現(xiàn)如下:miR-1能夠抑制G6PD的表達(dá),導(dǎo)致心肌梗死、心肌缺血等冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生,而UCA1能夠通過解除miR-1的抑制恢復(fù)G6PD的正常表達(dá)。驗(yàn)證三者之間關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道見表3。
表3 UCA1-mir-1-G6PD與冠心病血瘀證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
MRE是RNA的重要組成部分,在ceRNA網(wǎng)絡(luò)基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用,具有相同的MRE的mRNA、lncRNA、miRNA存在ceRNA調(diào)控機(jī)制,而不具有相同MRE,則不能發(fā)生調(diào)控。StarBase數(shù)據(jù)庫提示lncRNA UCA1、mRNA G6PD分別與miRNA miR-1具有共同的MRE(見圖6),為通過網(wǎng)絡(luò)篩選調(diào)控軸提供了生物學(xué)依據(jù)。
圖6 冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)MRE驗(yàn)證
中醫(yī)證候宜使用復(fù)雜系統(tǒng)方法學(xué)探究其生物學(xué)基礎(chǔ),現(xiàn)有研究在質(zhì)量和數(shù)量上均無法滿足需求,其方法也尚未形成體系[26]。構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò),以模塊藥理學(xué)的方式挖掘證候的生物學(xué)基礎(chǔ)是分析病證結(jié)合機(jī)制的新方法之一,目前已有多項(xiàng)研究通過構(gòu)建無向的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[27]或有向的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[28]、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)[29]等探討證候與疾病的共同生物學(xué)機(jī)制,但基于構(gòu)建的整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,難以直接找到其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)及調(diào)控關(guān)系。模塊藥理學(xué)認(rèn)為,復(fù)雜疾病的研究需要一種模塊化的靶點(diǎn)研究模式,強(qiáng)調(diào)對(duì)復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化分析,用于度量和整合藥物干預(yù)網(wǎng)絡(luò)的特征。其中,靶點(diǎn)-靶點(diǎn)相互作用及動(dòng)態(tài)平衡規(guī)律不僅是影響模塊化功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素,也是疾病影響因素?cái)_動(dòng)的體現(xiàn)[30]。本研究在探討冠心病血瘀證生物學(xué)基礎(chǔ)過程中,考慮到lncRNA能夠直接作用于mRNA,補(bǔ)充了lncRNA與mRNA之間的相互作用關(guān)系,不僅豐富了ceRNA網(wǎng)絡(luò),且使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在空間上更加穩(wěn)定;對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊劃分,依據(jù)熵值法篩選模塊劃分的最佳方法,確保網(wǎng)絡(luò)的有序性和功能性;利用功能模塊篩選出潛在調(diào)控軸,能夠基于已有的數(shù)據(jù)庫實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)快速篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)及靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系,為開展證候生物學(xué)機(jī)制研究提供新思路。
模塊6涉及 的lncRNA UCA1、miRNA miR-1、mRNA G6PD臨床報(bào)道較多。miR-1在心肌梗死患者中的表達(dá)水平顯著高于非心肌梗死患者,在急性胸痛發(fā)作3 h內(nèi)具有診斷價(jià)值,是心肌梗死預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,此外還參與心肌缺血再灌注損傷的治療過程中[31-32]。UCA1(尿路上皮癌相關(guān)蛋白1)能夠通過MAPK通路減少心肌梗死患者由于缺血缺氧引起的細(xì)胞凋亡和損傷,在成年人心臟中特異性表達(dá),心肌梗死患者中表達(dá)量顯著降低[22-23,33]。G6PD參與冠狀動(dòng)脈和肺動(dòng)脈收縮和舒張的調(diào)節(jié),在冠心病中表達(dá)水平顯著降低[34],且能作為冠心病診斷的關(guān)鍵基因[35]。三者之間存在密切的調(diào)節(jié)關(guān)系:G6PD抑制或敲低時(shí),血管平滑肌細(xì)胞限制性收縮蛋白、心肌蛋白及miR-1的表達(dá)增加[24]。miR-1能夠通過抗氧化網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄后修飾加重心臟氧化應(yīng)激,其過表達(dá)時(shí)能夠表現(xiàn)出較高的心肌細(xì)胞活性氧水平和對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的較低抵抗力,證實(shí)G6PD是miR-1轉(zhuǎn)錄后抑制的新型靶標(biāo)[25]。
冠心病血瘀證ceRNA網(wǎng)絡(luò)富集分析得到多條通路,如PI3K-Akt信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。活化的PI3K-Akt途徑中,PI3K和Akt表達(dá)及磷酸化水平顯著提高,可抑制磷酸酶和張力蛋白同源物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞存活的抑制作用,使細(xì)胞增殖率增加,細(xì)胞凋亡水平降低,從而保護(hù)心肌細(xì)胞[36]。miRNA-26a-5p能夠通過靶向PTEN激活PI3K-Akt通路,影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡[37]。動(dòng)脈粥樣硬化中上皮脂肪組織p53表達(dá)水平較高,能夠通過mRNA和蛋白水平觀察到Sirt-1和p53之間存在負(fù)相關(guān),Sirt1-p53軸可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡參與動(dòng)脈粥樣硬化[38]。
除相關(guān)通路外,KEGG還富集到18條癌癥相關(guān)通路,占富集通路總數(shù)的29%,考慮可能由于冠狀動(dòng)脈疾病和癌癥通常通過共同的生物學(xué)途徑和危險(xiǎn)因素在同一患者體內(nèi)發(fā)生[39],此外,也有通過生物信息學(xué)方式探討乳腺癌與冠心病共享生物標(biāo)志物的篩選,發(fā)現(xiàn)NLN、POSTN、MAPT、MYO6、MAP1B、FBXO31、KIT、PIK3R等18個(gè)mRNA可作為檢測(cè)乳腺癌誘導(dǎo)冠心病的潛在標(biāo)志物。模塊1中的PVT1是新發(fā)現(xiàn)的致癌因子,參與胃癌、膽囊癌等多種癌癥的發(fā)生過程,同時(shí)也能通過miR-128-3p-SP1-TGF-β1-Smad軸促進(jìn)心房纖維化[40]。模塊2中的H19在正常動(dòng)脈中檢測(cè)不到,但在損傷的血管和動(dòng)脈粥樣硬化病變后的內(nèi)膜中高度表達(dá)[41],高表達(dá)H19會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,下調(diào)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖[42]。同樣,模塊6中的UCA1不僅參與到UCA1-miR-1-G6PD軸,也能夠通過miR-143/MYO6軸促進(jìn)大腸癌的發(fā)生,且UCA1還能作為結(jié)直腸癌的治療靶標(biāo)[43]。
ceRNA調(diào)控理論代表了廣泛的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控模式,篩選冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA、miRNA、mRNA,構(gòu)建基因間調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)制層面研究冠心病血瘀證物質(zhì)基礎(chǔ)和病理機(jī)制,可為中醫(yī)證型相關(guān)研究提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。功能模塊識(shí)別很好地解決了生物網(wǎng)絡(luò)過于復(fù)雜難以分析的問題。通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),能夠更高效整合人體和疾病生物分子層面的數(shù)據(jù),從空間結(jié)構(gòu)層面找到關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn),有助于闡釋疾病發(fā)生的機(jī)制,預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生與發(fā)展,為早篩早檢早治療提供可能。本研究在構(gòu)建冠心病血瘀證相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)時(shí),補(bǔ)充了lncRNA與mRNA之間的聯(lián)系,并通過模塊藥理學(xué)理論劃分模塊,從模塊中篩選潛在lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控軸,可在一定程度上為挖掘冠心病血瘀證潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)提供重要參考。