王傳旭，周嘉寶，吳志遠(yuǎn)，吳燕升，郭亞芳，高建東

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院，上海 201399

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸生成過多或排泄減少，導(dǎo)致血清尿酸水平升高超過其臨界值的一種代謝性疾病[1]。尿酸被認(rèn)為是慢性腎臟病腎損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高水平尿酸誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是腎小管損傷的中心機(jī)制[2-3]。目前臨床常用降尿酸藥物黃嘌呤氧化酶抑制劑如非布司他、別嘌醇，促尿酸排泄藥物如苯溴馬隆，長(zhǎng)期服用存在一定不良反應(yīng)[4-6]。

尿酸在多種信號(hào)通路中發(fā)揮促炎作用，可溶性尿酸和尿酸結(jié)晶均可激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體，通過白細(xì)胞介素（IL）-1β等細(xì)胞因子觸發(fā)免疫反應(yīng)[7]。尿酸主要通過腎臟排泄，其在腎小管的重吸收和分泌是由不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成，其中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OAT）1和OAT3是表達(dá)于腎小管的功能蛋白，在腎小管尿酸分泌中起關(guān)鍵作用[8]。肝細(xì)胞核因子（HNFs）首先被鑒定為肝臟所富含的轉(zhuǎn)錄因子，之后發(fā)現(xiàn)其在其他多個(gè)組織和器官中表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)發(fā)育和器官功能作用[9]。研究表明，HNF1α、HNF4α參與OAT1和OAT3的調(diào)控[10-11]，IL-1β又可抑制HNF1α/HNF4α及其下游靶基因表達(dá)[12-13]。抑制IL-1β信號(hào)通路可減輕炎癥，還可促進(jìn)OAT1、OAT3表達(dá)，減輕腎損傷，發(fā)揮保護(hù)腎臟作用[14-15]。

矢志方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎內(nèi)科臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有化痰祛濕、活血化瘀功效。研究表明，矢志方治療痰濁瘀阻型尿酸性腎病具有較好臨床療效，并可通過清除或抑制氧自由基改善尿酸性腎病氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)腎功能[16-17]。此外，矢志方通過抑制活性氧及下游NLRP3-ASC-Caspase-1通路激活，減少IL-1β、IL-18活化和釋放，減輕HUA腎小管炎癥損傷[18]，降低血尿酸水平[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過氧嗪酸鉀灌胃建立HUA小鼠模型，基于炎癥因子IL-1β觀察矢志方對(duì)HUA小鼠腎組織OAT1、OAT3及HNF1α、HNF4α表達(dá)的影響，為明確矢志方治療HUA的作用機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠32只，8周齡，體質(zhì)量12～22 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度25℃，相對(duì)濕度45%，12 h光照，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PZSHUTCM211227011）。

1.2 藥物

矢志方（車前子30 g，芥子15 g，王不留行15 g，冬葵子15 g），飲片購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，并委托國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心制備成中藥復(fù)方顆粒劑（1 g顆粒相當(dāng)于原方20 g），使用時(shí)用蒸餾水配制成70 mg/mL藥液。非布司他片，40 mg/片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20130081，將藥片粉碎，以蒸餾水溶解，配制成0.75 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀、羧甲基纖維素鈉（CMCC-Na），上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)分別為P831461、C10097951；IL-1β，武漢ABclonal有限公司，貨號(hào)A16288；HNF1α抗體，英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab272693（Western blot）、ab268116（免疫熒光）；HNF4α抗體，英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab201460（Western blot）、ab41898（免疫熒光）；OAT1抗體，英國(guó)Biorbyt公司、美國(guó)Immunoway公司，貨號(hào)分別為orb11177（免疫熒光）、YT3220（Western blot）；OAT3抗體，英國(guó)Biorbyt公司、北京博奧森，貨號(hào)分別為orb136646（免疫熒光）、bs-0609R（Western blot）；β-actin，美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)66009-1；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，上海碧云天，貨號(hào)分別為A0216、A0208、A0423、A0473；PVDF膜，美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)IPVH00005。離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司，型號(hào)Avanti J-E；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能，型號(hào)Tanon-5200；生物組織冷凍包埋機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-BM；烘片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-H；酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司，型號(hào)Synergy 2；組織勻漿器，上海凈信科技有限公司，型號(hào)JY-24；顯微鏡，日本奧林巴斯，型號(hào)CX33。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥

32只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、非布司他組和矢志方組，每組8只。正常組予生理鹽水灌胃，其余各組予250 mg/kg氧嗪酸鉀溶液灌胃制備HUA小鼠模型。4 h后非布司他組灌胃非布司他藥液6 mg/kg，矢志方組灌胃矢志方藥液562.5 mg/kg，給藥劑量為成人劑量的9倍，灌胃體積0.2 mL，每日1次，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，連續(xù)2周。

2.2 取材

第13日給藥后小鼠禁食不禁水，第14日給藥后，0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，摘取雙側(cè)腎臟，切去腎盂，剩余腎組織分別用于病理觀察、Western blot和免疫熒光染色。

2.3 病理觀察

小鼠腎組織經(jīng)4%中性固定液固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度4μm），脫蠟后進(jìn)行HE、Masson染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察小鼠腎組織病理形態(tài)。

2.4 Western blot檢測(cè)

取20 mg小鼠腎組織，加入RIPA裂解液200μL，勻漿機(jī)65 Hz勻漿1 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer和生理鹽水配制成濃度為40μg/μL的等量蛋白樣品。上樣，120 V電泳1 h，300 mA、1 h轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入IL-1β一抗（1∶1 000）、HNF1α一抗（1∶1 000）、HNF4α一抗（1∶1 000）、OAT1一抗（1∶1 000）、OAT3一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4℃孵育過夜；PBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍攝。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 免疫熒光染色

腎組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水，微波爐抗原修復(fù)后，1%BSA室溫封閉1 h，加入1%BSA稀釋的IL-1β一抗（1∶200）、HNF1α一抗（1∶1 000）、HNF4α一抗（1∶1 000）、OAT1一抗（1∶400）、OAT3一抗（1∶400），4℃孵育過夜；加入熒光二抗（1∶500），避光孵育1 h，加入DAPI染細(xì)胞核5 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的面積比。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件和Image J 1.8軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多重比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 矢志方對(duì)模型小鼠腎組織病理形態(tài)的影響

HE、Masson染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎小管管壁變薄，管腔擴(kuò)張，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎小管管壁變薄、管腔擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生的病理變化減輕。見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠腎組織形態(tài)（HE染色，×200）

圖2 各組小鼠腎組織形態(tài)（Masson染色，×200）

4.2 矢志方對(duì)模型小鼠腎組織白細(xì)胞介素-1β、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1/3、肝細(xì)胞核因子1α/4α蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎組織IL-1β蛋白表達(dá)顯 著 升 高（P＜0.001），OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，非布司他組和矢志方組小鼠腎組織IL-1β蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表1、圖3。

圖3 各組小鼠腎組織IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白免疫印跡

表1 各組小鼠腎組織IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組小鼠腎組織IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組非布司他組矢志方組只數(shù)4 4 4 4 IL-1β 0.51±0.10 1.20±0.20***0.85±0.11#0.77±0.18#OAT1 1.90±0.13 0.29±0.17***0.72±0.18#0.92±0.25##OAT3 1.21±0.28 0.36±0.08**0.95±0.10#0.94±0.25#HNF1α 0.98±0.02 0.06±0.02**0.75±0.25#0.36±0.19#HNF4α 0.99±0.05 0.12±0.01***0.74±0.10##0.51±0.10#

4.3 矢志方對(duì)模型小鼠腎組織炎癥因子白細(xì)胞介素-1β表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織IL-1β表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎組織IL-1β表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖4、表2。

表2 各組小鼠腎組織IL-1β陽(yáng)性表達(dá)比較（±s，%）

表2 各組小鼠腎組織IL-1β陽(yáng)性表達(dá)比較（±s，%）

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001

組別正常組模型組非布司他組矢志方組只數(shù)4 4 4 4 IL-1β 0.05±0.02 0.92±0.20***0.28±0.09###0.21±0.02###

圖4 各組小鼠腎組織IL-1β陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

4.4 矢志方對(duì)模型小鼠腎組織有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1/3、肝細(xì)胞核因子1α/4α表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見圖5、圖6、表3。

表3 各組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3陽(yáng)性表達(dá)比較（±s，%）

表3 各組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3陽(yáng)性表達(dá)比較（±s，%）

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

組別正常組模型組非布司他組矢志方組只數(shù)4 4 4 4 HNF1α 2.85±0.75 0.24±0.05***1.44±0.21##1.40±0.14##HNF4α 3.77±0.46 0.93±0.14***1.96±0.22##2.09±0.23###OAT1 12.63±1.16 2.17±0.64***4.42±1.05#8.49±0.92###OAT3 13.12±1.16 1.70±0.70***4.93±0.83###8.63±0.64###

圖5 各組小鼠腎組織HNF1α、OAT1陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

圖6 各組小鼠腎組織HNF4α、OAT3陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

5 討論

HUA血尿酸水平升高與腎小管損傷相關(guān)，當(dāng)血尿酸水平超過正常范圍，可引起腎小管多種病理變化，如炎癥、凋亡和纖維化等[20-22]，進(jìn)一步促進(jìn)慢性腎臟病腎損傷的發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)顯示，尿酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞NLRP3、IL-1β及腫瘤壞死因子-1α水平升高[23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，尿酸誘導(dǎo)大鼠腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，IL-1β表達(dá)增加，最終導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)和功能損傷[24-25]。OAT1與OAT3通過有機(jī)陰離子與二羧酸的交換發(fā)揮排泄尿酸作用[26]。在敲除OAT1的小鼠中，腎小管分泌尿酸鹽功能減弱[27]；在單側(cè)輸尿管梗阻模型中也發(fā)現(xiàn)因腎小管炎癥損傷導(dǎo)致的OAT1和OAT3表達(dá)下降，而多種中藥及其提取物通過抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)減輕HUA腎損傷[7，14-15]。

本實(shí)驗(yàn)通過氧嗪酸鉀灌胃建立HUA小鼠模型。2周后，腎小管出現(xiàn)管壁變薄、管腔擴(kuò)張、腎組織纖維化等病理改變，炎癥因子IL-1β表達(dá)升高，OAT1、OAT3及HNF1α、HNF4α表達(dá)降低，提示HUA小鼠腎組織出現(xiàn)炎癥損傷，腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，并伴有纖維化改變。給予矢志方治療后，HUA小鼠炎癥反應(yīng)、腎組織損傷減輕，腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)功能改善，纖維化病理改變減輕。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕濁痰瘀是HUA的基本病機(jī)，痰瘀互結(jié)可能與HUA導(dǎo)致腎小管炎癥損傷、尿酸排泄障礙有關(guān)。據(jù)此創(chuàng)立化痰祛濕、活血化瘀中藥復(fù)方矢志方。該方以車前子、芥子為君藥，利濕化痰、祛痰散瘀；配伍王不留行為臣，逐瘀通絡(luò)，使瘀血化、痰濕去；佐以冬葵子利水消導(dǎo)，使邪有去路，津行得通。諸藥合用則水道通利、脈道得通、血行得暢，共奏化痰祛濕、活血化瘀功效。

綜上所述，矢志方可減輕HUA小鼠腎臟損傷，其機(jī)制與抑制腎組織炎癥因子IL-1β，促進(jìn)OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α表達(dá)有關(guān)。此外，HNF1α、HNF4α在矢志方調(diào)控IL-1β-OAT1/3中的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。