穆玉姣，宋威蓉，胡 曉，張白帆，趙嘉詠，馬紅霞，黃學(xué)勇，郭萬(wàn)申

近年來(lái)鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株(S.1,4,[5],12:i: -)在多個(gè)國(guó)家的檢出呈現(xiàn)大幅度的增加，并導(dǎo)致多次疫情在不同地區(qū)發(fā)生[1]，其是鼠傷寒沙門(mén)菌(S.1,4,[5],12:i:1,2)的Ⅱ相鞭毛抗原缺失的單相變異菌，已在動(dòng)物、食品及人類(lèi)糞便、血液中分離發(fā)現(xiàn)。在抗生素的選擇壓力下，細(xì)菌的耐藥性已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extened-spectrum β-lactamases,ESBLs)可水解滅活青霉素類(lèi)、頭孢菌素和單環(huán)酰胺類(lèi)抗生素的β內(nèi)酰胺酶，接合性質(zhì)粒介導(dǎo)其在同種或不同種屬細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移、傳播被認(rèn)為是多重耐藥基因傳播的重要機(jī)制之一[2]，可以導(dǎo)致耐藥菌株在局部大規(guī)模爆發(fā)。目前對(duì)ESBLs的分析報(bào)道多以分離自血液、引流液、尿液中分離的大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等為主[3-4]，對(duì)來(lái)源于腹瀉病人糞便中的沙門(mén)菌研究較少，特別是鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株。鼠傷寒沙門(mén)菌變異株在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象，對(duì)主要抗菌藥物氨芐西林、氯霉素、卡那霉素、慶大霉毒、四環(huán)素、新諾明等表現(xiàn)不同的敏感性，產(chǎn)生泛耐藥和多重耐藥。本研究從腹瀉病人糞便中分離產(chǎn)ESBLs 的鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株沙門(mén)菌進(jìn)行分子特征研究，為預(yù)防和控制耐藥菌的產(chǎn)生和耐藥基因的傳播提供實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 河南省腹瀉監(jiān)測(cè)點(diǎn)從2008-2017年患者糞便標(biāo)本中分離的124株1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌，藥敏質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC 25922和肺炎克雷伯桿菌 ATCC 700603，沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812為本實(shí)驗(yàn)室保存，接合受體菌大腸埃希氏菌J53(疊氮鈉耐藥)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 藥物敏感鑒定板(上海星佰公司)，疊氮鈉和頭孢噻肟(北京Solarbio公司)，LB肉湯、MH瓊脂和MAC瓊脂(北京陸橋)，引物合成(上海生工)，2×Taq PCR MasterMix和細(xì)菌DNA提取試劑盒(大連寶生物)，Seakem Glod瓊脂糖(美國(guó)LONZA公司)，蛋白酶K(英國(guó)Roche公司)，限制性內(nèi)切酶XbaI(大連寶生物公司)，1 M Tris-HC1/EDTA/5XTBE(北京solarbio公司)。

1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio rad公司)、去離子水系統(tǒng)(美國(guó)Milipore公司)、SHZ-C型水浴搖床(上海博迅儀器)、三溫水浴鍋(北京東方精瑞)、Minispin臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)、Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國(guó)梅里埃公司)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)

1.4 方 法

1.4.1 耐藥表型及基因型特征性分析 1)最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定方法：采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)CLSI推薦的肉湯稀釋法測(cè)試124株1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌的最小抑菌濃度，根據(jù)藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)選擇7類(lèi)11種抗生素：β內(nèi)酰胺類(lèi)(氨芐西林AMP、頭孢噻肟CTX、頭孢他啶CAZ、亞胺培南IMI)、氨基糖苷類(lèi)(慶大霉素GEN)、氯霉素類(lèi)(氯霉素CHL)、四環(huán)素類(lèi)(四環(huán)素TET)、喹諾酮類(lèi)(環(huán)丙沙星CIP、萘啶酸NAL)、多肽類(lèi)(多粘菌素PB)、葉酸途徑抑制劑(復(fù)方新諾明SXT)。2)產(chǎn)ESBLs的菌株篩選： CLSI篩選和確認(rèn)ESBLs的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。3)ESBLs基因型檢測(cè)：PCR擴(kuò)增ESBLs四種耐藥基因[5](SHV、OXA、TEM、CTX-M)型別，其中CTX-M型陽(yáng)性的菌株，再分別擴(kuò)增CTX-M組特異引物。PCR陽(yáng)性菌株送上海生工測(cè)序、結(jié)果比對(duì)，確定基因型。

1.4.2 產(chǎn)ESBLs沙門(mén)菌分子特征分析 按照Pulsenet China網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室公布的沙門(mén)菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)標(biāo)準(zhǔn)分型方法，對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行分子分型，沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812作為分子量標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶XbaI(50 U)，37 ℃酶切2 h。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm，脈沖時(shí)間2.2～63.8 s，線性轉(zhuǎn)換，電場(chǎng)角度120°，電泳時(shí)間19 h，電泳液溫度14 ℃。電泳結(jié)束后膠塊用GelRed染料染色20 min后純水清洗30 min后凝膠成像儀拍照(曝光時(shí)間3.0 s，去過(guò)飽和成像)。

1.4.3 產(chǎn)ESBLs沙門(mén)菌接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn) 使用肉湯接合法[6]，將供體菌(產(chǎn)ESBLs沙門(mén)菌)和受體菌(J53)分別于5 mL LB肉湯中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，各取1 mL，10 000×g離心1 min，棄上清液，加入新鮮LB肉湯混勻后再次10 000×g離心1 min，棄上清液，加入1 mL LB肉湯混勻后，將兩者混合，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日將稀釋后的結(jié)合液涂布于加有100 μg/mL疊氮鈉和4 μg/mL頭孢噻肟的麥康凱平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行篩選，次日挑取單個(gè)紅色菌落, 37 ℃孵育18 h后，系統(tǒng)生化鑒定并采用通過(guò)PCR方法進(jìn)行CTX-M基因檢測(cè)，篩選CTX-M基因陽(yáng)性接合子，依次進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、PFGE。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用凝膠分析聚類(lèi)軟件BioNumerics 6.0對(duì)PFGE結(jié)果進(jìn)行分析，樹(shù)狀圖和相關(guān)性由UPGMA聚類(lèi)分析和Dice相似性系數(shù)推算而得。條帶位置差異容許度選擇1.5%，優(yōu)化值選擇1.5%。Dice系數(shù)(F×100%，F(xiàn) value×100%)來(lái)衡量PFGE帶型之間的相似度。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 124株1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌中，男女性別比為1.64(77/47)，其中51.61%(64/124)為1歲以下嬰幼兒，28.23%(35/124)為1～2歲幼兒。農(nóng)村地區(qū)檢出率 (%) 高于城市地區(qū) (%)。見(jiàn)表1。

表1 124株人源1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌菌株信息Tab.1 Information on 124 strains from human of S.1,4, [5], 12: i: -

2.1 耐藥表型 124株1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌株中，除對(duì)亞胺培南和多粘菌素B外均有不同程度的耐藥(圖1)，其中對(duì)氨芐西林和四環(huán)素耐藥率最高，分別為90.32%(112/124)和97.58%(121/124)；其次為氯霉素61.29%(76/124)、萘啶酸58.87%(73/124)和復(fù)方新諾明52.42%(65/124)；但對(duì)三代頭孢類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素較敏感。92.74%(115/124)的菌株同時(shí)對(duì)三類(lèi)以上的抗生素耐藥，為多重耐藥菌株。

圖1 124株1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Drug suseptibility test results of 124 strains of S.1,4, [5], 12: i: -

2.2 產(chǎn)ESBLs沙門(mén)菌株的篩選 124株1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌株中有16株對(duì)頭孢噻肟耐藥，耐藥率為12.90%；9株對(duì)頭孢他啶耐藥，耐藥率為7.26%。ESBLs菌株確證試驗(yàn)驗(yàn)證了16株頭孢噻肟耐藥菌均為產(chǎn)ESBLs菌株。16株產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)IMI、PB全部敏感，對(duì)剩余的8種抗生素均有不同程度的耐藥，其中對(duì)AMP、TET、CHL全部耐藥(圖2)。16株產(chǎn)ESBLs菌株均為多重耐藥菌，其中1株(6.25%)對(duì)五類(lèi)抗生素耐藥，6株(37.5%)對(duì)6類(lèi)抗生素耐藥，9株(56.25%)對(duì)7類(lèi)抗生素耐藥。

2.3 產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥基因型 四種型別耐藥基因PCR結(jié)果顯示(圖2)，16株產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌均攜帶CTX-M型耐藥基因，其中3株同時(shí)攜帶OXA型，9株同時(shí)攜帶TEM型，22株同時(shí)攜帶OXA型和TEM型，2株未攜帶OXA型和TEM型；本研究未檢測(cè)出攜帶SHV型的菌株。見(jiàn)圖2。經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果顯示， TEM基因均為T(mén)EM-1型， OXA均為OXA-1型。擴(kuò)增CTX-M組特異引物，經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ群?，CTX-M型菌株中12株為CTX-M-1組(4株CTX-M-15型和8株CTX-M-55)，4株為CTX-M-9組(4株CTX-M-14型)。

圖2 16株產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌耐藥表型及ESBLs基因型結(jié)果Fig.2 Drug resistance phenotype and ESBL genotype results of 16 strains of S.1,4, [5], 12:i: - producing ESBLs

2.4 產(chǎn)ESBLs菌株間親緣關(guān)系分析 PFGE分析結(jié)果如圖3，通過(guò)BioNumerics6.0指紋圖譜分析軟件對(duì)PFGE結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，16株產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌經(jīng)XbaⅠ酶切后共分為14種帶型(Dice,positiontolence1.5%),分別命名為T(mén)H1-TH14。結(jié)果顯示絕大多數(shù)菌株在基因圖譜上分布在不同的遺傳分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，沒(méi)有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的PFGE圖譜，僅有兩株菌PFGE圖譜具有100%同源性，其余帶型各僅包含1株菌，相似度在52%～97%，無(wú)明顯的優(yōu)勢(shì)帶型。此外, 帶型也無(wú)明顯的地域、時(shí)間、聚集特征。

圖3 16株產(chǎn)ESBLs1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌PFGE聚類(lèi)分析Fig.3 PFGE cluster analysis of 16 strains of S.1,4, [5], 12: i: - producing ESBLs

2.5 產(chǎn)ESBLs沙門(mén)菌接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn) 16株ESBLs 1,4,[5],12:i:-沙門(mén)菌中有9株與大腸埃希菌J53接合后在篩選MAC平板上(100 μg/mL疊氮鈉+4 μg/mL頭孢噻肟)有紅色菌落生長(zhǎng)，經(jīng)Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定為大腸埃希菌。接合子藥敏結(jié)果顯示9株菌成功的發(fā)生了β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物耐藥性接合轉(zhuǎn)移，除頭孢他啶、環(huán)丙沙星、萘啶酸和慶大霉素外，細(xì)菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、多粘菌素、復(fù)方新諾明都具有耐藥性，說(shuō)明這些耐藥基因可以與CTX-M在一個(gè)質(zhì)粒上發(fā)生共轉(zhuǎn)移。PFGE結(jié)果顯示接合成功的9株接合子的PFGE分型與受體菌(J53)一致而與供體菌不同。提取接合子菌DNA進(jìn)行CTX-M基因PCR驗(yàn)證，接合子獲得了與供體菌株一致的CTX-M基因。

3 討 論

近年來(lái)，有關(guān)鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株(1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌)的文獻(xiàn)報(bào)道越來(lái)越多，由其引起的感染比例大幅上升，其已成為一種非常重要的沙門(mén)氏菌血清型。隨著抗生素的廣泛使用，抗生素耐藥菌株在臨床分離菌株中所占比例不斷增加，給臨床抗感染治療造成了巨大的困擾。本藥敏研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株對(duì)臨床治療傳統(tǒng)藥物廣譜青霉素、氯霉素、磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗生素均產(chǎn)生了一定的耐藥性，對(duì)三代頭孢類(lèi)和三代喹諾酮類(lèi)抗生素敏感性較強(qiáng)，這和栗薇薇[7]、許云敏[8]等報(bào)道一致。但隨著第三代頭孢菌素的廣泛使用,出現(xiàn)了一類(lèi)能夠水解第三代、甚至第四代頭孢菌素超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，產(chǎn)ESBLs的沙門(mén)菌通常把抗生素耐藥質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子攜帶的可轉(zhuǎn)移元件作為抗生素耐藥性傳遞的供體,參與發(fā)病機(jī)制的某些ESBLs基因通常與這些抗生素耐藥基因元件一起轉(zhuǎn)移,將編碼基因ESBLs轉(zhuǎn)移到細(xì)菌宿主的基因組或質(zhì)粒中促進(jìn)了更具毒性和耐藥性的分離株的出現(xiàn)[9],并因此導(dǎo)致更難以治療的感染。

本研究主要從我省腹瀉病人中分離產(chǎn)ESBLs多重耐藥1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌進(jìn)行分析，通過(guò)藥敏試驗(yàn)確定了16株ESBLs1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌。產(chǎn)ESBLs基因型主要有5種，包括 TEM、SHV、OXA、CTX-M 和其他型，沙門(mén)菌中以廣譜青霉素酶 (TEM) 為最常見(jiàn), 但近幾年以很多地區(qū)以 CTX-M 型為主[10], CTX-M可水解三代頭孢類(lèi)藥物。目前，CTX-M 型ESBLs 已發(fā)現(xiàn) 130多種亞型，根據(jù)其氨基酸序列的同源性可分為5組[11]：CTX-M-1組，CTX-M-2組，CTX-M-8組，CTX-M-9組和CTX-M-25組，上述不同組之間同源性≤90%。本次研究中共檢測(cè)到OXA、TEM和CTX-M 3種ESBLs基因型，CTX-M型檢出最多(100%)，共發(fā)現(xiàn)3種型別：blaCTX-M-55、blaCTX-M-14和blaCTX-M-15，均屬于CTX-M-1組和CTX-M-9組。有研究顯示[12-14]CTX-M-14型和CTX-M-15型是許多地區(qū)腹瀉沙門(mén)菌攜帶CTX-M的主要耐藥基因，但本研究檢出的耐藥基因以blaCTX-M-55(50.0%)為主，其次是blaCTX-M-14(37.5%)。此外，blaTEM、blaOXA的陽(yáng)性率分別為68.75%和31.25%，經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果顯示，blaTEM均為T(mén)EM-1型，blaOXA均為OXA-1型。

PFGE作為一種有效的分子分型方法，可以用于分析菌株之間的相關(guān)性，被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌的分子流行病學(xué)研究中，在疫情控制和溯源中發(fā)揮著重要方面。16株產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌經(jīng)XbaⅠ酶切后共分為14種帶型，表現(xiàn)出相當(dāng)大的多樣性，無(wú)明顯的優(yōu)勢(shì)帶型，這表明我省產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌在基因圖譜分布在不同的遺傳分支上，帶型復(fù)雜，可能來(lái)自多個(gè)克隆群，多態(tài)性明顯。較高的異質(zhì)性和更多的克隆分布意味著更大的變異性和適應(yīng)性，這說(shuō)明攜帶主要流行亞型的blaCTX-M沙門(mén)菌遺傳背景呈現(xiàn)多樣性，并且耐藥基因與基因分型無(wú)明顯相關(guān)性，這也說(shuō)明產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌中不存在同一菌株的克隆傳播，克隆傳播可能不是其傳播流行的主要方式。

本研究中，共有9株產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌通過(guò)接合試驗(yàn)進(jìn)行了blaCTX-M轉(zhuǎn)移，說(shuō)明耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)在不同細(xì)菌之間的進(jìn)行水平傳播，加重了耐藥基因的擴(kuò)散。對(duì)供體菌和接合子的藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，供體菌除了攜帶ESBLs基因外，可能還攜帶其他耐藥基因或元件，在接合試驗(yàn)中出現(xiàn)了非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性與ESBLs表型共同轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，導(dǎo)致菌株的多重耐藥。值得注意的是，同為β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的頭孢他啶在接合試驗(yàn)后的MIC值呈下降狀態(tài)，使的多株菌對(duì)頭孢他啶的耐藥表型由耐藥或中介變?yōu)槊舾?，這可能與blaCTX-M基因編碼的核苷酸序列有關(guān)，240位的賴氨酸或精氨酸活性集團(tuán)與水解頭孢他啶密切相關(guān)，而blaCTX-M缺少此類(lèi)活性集團(tuán)，因而對(duì)頭孢他啶水解能力低下。但有研究證明[15]所獲得的 CTX-M 的新型別中有64%的突變體對(duì)頭孢他啶產(chǎn)生了抗藥性，并且這些突變體一般都具有 A80V、P167S和D242G 的突變位點(diǎn)。頭孢他啶可能會(huì)作為主要的選擇壓力，對(duì) CTX-M型ESBLs分子進(jìn)化路徑產(chǎn)生較大的影響。

綜上所述，河南省腹瀉病人糞便中分離的產(chǎn)ESBLs 1,4,[5],12：i：-沙門(mén)菌與其攜帶的CTX-M 型耐藥基因有關(guān)，并且編碼該耐藥基因的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)接合轉(zhuǎn)移在細(xì)菌之間進(jìn)行水平傳播。這提示我們應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展此類(lèi)耐藥菌株的監(jiān)測(cè)，為提高治療有效率和阻止耐藥菌株的產(chǎn)生和播散提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)