李利玲 劉 歡 廖慧敏 胡金鑫 劉鳳曉 趙 棋 高 強

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410208；2 中南大學(xué)，長沙，410083)

內(nèi)毒素所致肺損傷發(fā)生比較迅速，挽救的時間窗口比較短暫，同時肺損傷也是內(nèi)毒素小鼠死亡的主要原因之一。各種因素導(dǎo)致的急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)共同病理改變?yōu)閺V泛嚴重的肺泡損傷和間質(zhì)性肺水腫，肺泡腔內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，灌洗液中的炎癥介質(zhì)明顯增多，肺泡上皮細胞凋亡或死亡[1-2]。內(nèi)皮細胞學(xué)說則認為內(nèi)皮或上皮細胞的凋亡，直接造成了肺泡上皮或內(nèi)皮屏障功能障礙，血管通透性增加，肺水腫加劇[3]。本實驗通過采用腹腔注射內(nèi)毒素方法制造白化的家鼠亞系(Bagg Albino，Laboratory-bred Strain of the House Mouse，BALB/c)小鼠ALI模型，用辣椒素干預(yù)后硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid，TBA)化學(xué)比色法檢測小鼠丙二醛(Malondiachehyche，MDA)水平；一氧化氮還原酶法測定氮氧化物(Nitrogen Oxide,NOX)水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測各組小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)水平，以及在光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變，以期為辣椒素干預(yù)內(nèi)毒素所致ALI小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)改善提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 120只無特定病原體(Specefic Pathogen Free，SPF)級BALB/c小鼠，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自武漢蜂鳴生物科技有限公司，動物購買許可證號SCXK(湘)2018-0003，動物使用許可證號SYXK(湘)2018-0004。倫理審批號：HN.No20180930b1000120，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房中飼養(yǎng)，給食顆粒飼料，自由飲水，動物房溫度(25±1)℃，相對濕度40%～70%，自然晝夜光照。

1.1.2 藥物 辣椒素(上海源葉生物科技有限公司，貨號：B2069)和脂多糖(福州奧研實驗器材有限責任公司，貨號：HX100003929)。

1.1.2 試劑與儀器 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)測定試劑盒(硝酸還原酶法，南京建成生物工程研究所，貨號A012)和MDA測定試劑盒(TBA法，南京建成生物工程研究所，貨號:YBA003-1)，TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，貨號:EMC102a)、IL-1β ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，貨號:EMC001b)，4%多聚甲醛組織固定液(長沙國昌生物技術(shù)有限公司，貨號:AR1069)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本，型號:CX23)，全自動石蠟切片機(SLEE公司，德國，CUT6062型號)等，全波長酶標儀(Thermo公司，美國，型號:Multiskan Sky)，攤片機(SKU公司，美國，型號:KD-PⅢ)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(崢嶸儀器公司，型號:DHP260)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠120只采用隨機數(shù)字法分為4組：正常對照組，辣椒素對照組，內(nèi)毒素急性肺損傷組，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組，每組30只。

1.2.2 給藥方法 正常對照組：小鼠腹腔注射生理鹽水，分別于干預(yù)后22 h、4 h、6 h時麻醉處死；辣椒素對照組：先給小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射生理鹽水，分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h時麻醉處死；急性肺損傷組：給小鼠腹腔注射內(nèi)毒素10.0 mg/kg，構(gòu)建ALI模型，分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死；辣椒素干預(yù)組：先小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射內(nèi)毒素10.0 mg/kg，分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死。以上各組處死后取肺組織，固定于4%多聚甲醛中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 比色法檢測MDA含量 按照實驗分組，取10%肺組織勻漿，用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測定其蛋白含量，采用比色法，檢測肺組織MDA水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。機體產(chǎn)生的氧自由基能通過脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物MDA引起細胞損傷。因而測試MDA的量常?？砷g接地反映出細胞損傷的程度。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。實驗取樣品100 μL，按比例加入試劑一、試劑二、試劑三，旋渦混勻器混勻，95 ℃水浴40 min，3 500～4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清100 μL，532 nm處，測各管光密度(Optical Density，OD)值。見表1。

1.2.3.2 NO還原酶法檢測NOX水平 按照實驗分組，摘眼球取血，離心取血清，用NO還原酶法測定NOX水平，按照試劑盒說明書操作。取血清原液100 μL，按步驟加入樣本一100 μL，樣本二200 μL，混合試劑，37 ℃水浴60 min，再加入R3、R4，抽提室溫靜置40 min，3 500～4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清160 μL，加入顯色劑，靜置10 min，550 nm測各管OD值。見表2。

1.2.3.3 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平 按照實驗分組，取10%肺組織勻漿，用BCA法測定其蛋白含量，采用QuantiCyto? ELISA試劑盒雙抗夾心法檢測肺組織TNF-α和IL-1β水平，按照試劑盒說明書操作?？剐∈骉NF-α和IL-1β單抗包被于酶標板上，標本中的TNF-α和IL-1β與單抗結(jié)合，洗滌，加入生物素化的抗小鼠TNF-α和IL-1β抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，洗滌，加入顯色底物，洗滌，加終止液，若陽性則顯黃色，陰性無色，在450 nm處測OD(光密度)值。見表3～4。

1.2.4 病理學(xué)觀察 按照實驗分組，將肺組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，進行切片和HE染色，在放大400倍光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 辣椒素干預(yù)前后小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β比較 與正常對照組比較，內(nèi)毒素組小鼠肺組織MDA水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對照組則變化不明顯(P>0.05)，與內(nèi)毒素組比較，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組小鼠肺組織MDA水平在2 h、4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對照組比較，內(nèi)毒素組小鼠肺組織NOX水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對照組則無明顯變化(P>0.05)，與內(nèi)毒素組比較，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組肺組織NOX水平在4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對照組比較，內(nèi)毒素組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對照組則變化不明顯(P>0.05)，與內(nèi)毒素組比較，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組小鼠肺組織在4 h、6 h TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β水平變化及辣椒素干預(yù)結(jié)果

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 光鏡下，正常對照組、辣椒素組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無炎癥細胞浸潤，無出血或有少量出血，肺間質(zhì)無明顯滲出；急性肺損傷組2 h損傷不明顯，但4 h、6 h可見肺泡腔大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分增寬，肺泡毛細血管擴張，部分肺泡內(nèi)可見出血，肺間質(zhì)水腫，可見炎癥細胞浸潤；與急性肺損傷組比較，辣椒素干預(yù)組肺泡壁增厚、毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤及肺間質(zhì)水腫程度均明顯減輕。見圖1。

圖1 不同組別不同處理時間小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

3 討論

ALI是呼吸系統(tǒng)疾病中最常見的導(dǎo)致死亡的原因之一，同時ALI也是肺炎和急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)等其他疾病發(fā)展的重要風險因素[4-5]。由于其病情發(fā)展迅速同時病死率較高，其發(fā)病機制仍處于探討之中，同時缺乏明確的治療手段，因此目前在呼吸疾病中越來越受到重視。

此前已有研究表明氧自由基損傷是ALI的一個重要因素，其細胞脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物主要就是MDA，其大小可以間接反映細胞氧化損傷的程度[6]。降低ALI細胞和大鼠模型中MDA和NO的水平，抑制SOD活性，可明顯減輕內(nèi)毒素所致的肺組織病理改變[7]，本研究中小劑量辣椒素作用于ALI模型小鼠后可降低血清MDA水平，可以在一定程度上減輕ALI造成的氧化應(yīng)激損傷。

Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)辣椒素對小鼠體內(nèi)的2種NO合酶均有促進作用。而Demirbilek等[9]采用不同劑量辣椒素干預(yù)膿毒癥大鼠，發(fā)現(xiàn)小劑量辣椒素可以抑制大鼠血清NOX水平，但具體機制不明。唐婧等[10-11]研究不同處理因素對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細胞后相關(guān)炎癥介質(zhì)表達的影響，明確辣椒素的抗炎效應(yīng)表明辣椒素具有抗炎的作用，并發(fā)現(xiàn)瞬時受體辣椒素電位1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1)是辣椒素在治療ALI/急性呼吸窘迫綜合征作用中的新靶點。南超等[12]初步研究過辣椒素對小鼠ALI氧化應(yīng)激的影響，測定了辣椒素作用下肺組織SOD、MDA以及血紅素氧合酶等的表達變化，發(fā)現(xiàn)辣椒素有改善小鼠ALI氧化應(yīng)激的作用，但沒有進一步測定NOX、TNF-α、IL-1β等與氧化應(yīng)激相關(guān)關(guān)鍵因子的表達變化，因此本研究的完成對于進一步探索辣椒素改善小鼠ALI氧化應(yīng)激的作用就顯得特別有意義。

本實驗發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)NOX水平變化趨勢為急性肺損傷組>辣椒素加急性肺損傷組>辣椒素組>正常對照組。血漿NOX水平的升高可能與多器官衰竭的發(fā)生有關(guān)，小劑量的辣椒素降低了ALI小鼠血漿中的NOX水平，其可能的機制是小劑量的辣椒素干預(yù)可能使小鼠產(chǎn)生較小數(shù)量的細胞因子，例如TNF-α、IL-1β等，從而減少NOX產(chǎn)生。

目前的主流觀點認為，內(nèi)毒素注射入人體后會導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，刺激機體釋放炎癥介質(zhì)，從而引發(fā)瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，使肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞受損，間隙增大，大分子物質(zhì)透過血管進入肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)，從而引起肺部一系列的病理生理改變[13-14]。內(nèi)毒素引起ALI動物肺泡腔和間質(zhì)中性粒細胞募集、肺泡壁變薄和蛋白水腫液聚集在肺泡腔[15-16]；上皮細胞在動物注入內(nèi)毒素后迅速凋亡并先于其他組織損傷發(fā)生[17]。

在實驗中，通過腹腔注射辣椒素觀察其對內(nèi)毒素所致ALI小鼠的改善作用，結(jié)果顯示，辣椒素能夠降低實驗小鼠中血清的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的水平，同時提高抗炎癥介質(zhì)水平，說明了辣椒素可以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)及抗炎癥介質(zhì)的平衡，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對肺組織的保護作用。

本研究的實驗結(jié)果中，辣椒素能調(diào)控炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β等的釋放，減輕內(nèi)毒素所致肺損傷的炎癥程度，降低ALI小鼠肺組織MDA和NOX水平，從而阻斷肺損傷繼續(xù)進展為ALI/ARDS，因而小劑量辣椒素對ALI有一定的保護作用。目前已有研究人員從磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)以及核因子κB等信號通路對黃酮類等對脂多糖誘導(dǎo)小鼠ALI的保護作用機制進行了研究[18-20]。下一步我們擬繼續(xù)對辣椒素改善實驗小鼠ALI氧化應(yīng)激的機制進一步研究。