李 璘，邱蓉麗，魏凱峰，孫東東,3

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院、2.藥學(xué)院，3.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

斑馬魚作為一種體外受精的模式動物，廣泛應(yīng)用于人類多種疾病的研究。由于斑馬魚腫瘤模型與人類腫瘤的高度保守性，許多人類腫瘤相關(guān)通路在斑馬魚腫瘤中存在同源物。早在2005年斑馬魚就用于腫瘤的研究[1]，近來轉(zhuǎn)基因斑馬魚和腫瘤移植斑馬魚的出現(xiàn)，使其成為具有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N腫瘤動物模型。

1 斑馬魚在腫瘤研究中的優(yōu)勢

斑馬魚屬于非哺乳類脊椎動物，比無脊椎動物線蟲和果蠅更加與人類相近，用于體內(nèi)腫瘤增殖、分裂、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤藥物的快速篩選研究。斑馬魚先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)與人和小鼠高度保守，造血系統(tǒng)與人類相似且和人類的血細(xì)胞相對應(yīng)，適用于人類血液腫瘤的研究[2]。斑馬魚受精24 h后主要器官發(fā)育完成，受精7～14 d相當(dāng)于生命的早期階段，先天免疫系統(tǒng)受精后開始發(fā)育，約2～3周獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，這個時間窗可以植入人或鼠的腫瘤細(xì)胞而不被斑馬魚的免疫系統(tǒng)排斥。斑馬魚產(chǎn)生天然色素前處于透明狀態(tài)，可以觀察腫瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)和腫瘤大小[3]。斑馬魚每兩周產(chǎn)卵約600～700枚，產(chǎn)生遺傳一致的后代，細(xì)胞培養(yǎng)板即可飼養(yǎng)。斑馬魚移植的腫瘤與小鼠腫瘤模型具有相似的藥物敏感性，腫瘤細(xì)胞移植于成體魚，短時間內(nèi)可獲得大量腫瘤移植模型[4]。轉(zhuǎn)基因斑馬魚和熒光標(biāo)記細(xì)胞的出現(xiàn)，擴大了斑馬魚在腫瘤研究方面的應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Casper)終身保持透明，用于腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成、腫瘤與微環(huán)境的相互作用、腫瘤募集免疫細(xì)胞能力等多方面的研究。

2 斑馬魚腫瘤模型

2.1 誘發(fā)性斑馬魚腫瘤模型誘發(fā)性斑馬魚腫瘤模型包括自然狀態(tài)下發(fā)生和致癌劑誘發(fā)的腫瘤模型。自然狀態(tài)下因斑馬魚體溫比較低(28.5 ℃)，自發(fā)性腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生凋亡，腫瘤的自然發(fā)生率比較低，一般發(fā)生在1～2年的斑馬魚[3]。自然誘發(fā)的腫瘤主要與魚類病毒、寄生蟲及水污染物有關(guān)[5]。假毛細(xì)線蟲(Pseudocapillariatomentosa)感染斑馬魚產(chǎn)生腸道多病灶異常增生物，在感染附近組織形成腫瘤[6]。斑馬魚自發(fā)性腸腫瘤包括腸腺癌、小細(xì)胞腸癌，它們在腸道中隨機分布，常侵襲黏膜皮下組織[7]。斑馬魚的大腦在組織學(xué)上與哺乳類動物明顯不同，大量前腦、間腦和延腦的嗜堿性胚胎細(xì)胞緊緊圍繞著腦室系統(tǒng)，腦室周圍的細(xì)胞容易發(fā)生胚胎性神經(jīng)瘤，這與兒科神經(jīng)瘤相似。犬、貓等哺乳動物和成人腦部發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但斑馬魚常發(fā)生分化度較低的成神經(jīng)細(xì)胞瘤。如果抑癌基因，如tp53、mlh1、msh2、msh6等發(fā)生變異，斑馬魚容易發(fā)生周圍神經(jīng)鞘瘤[6]。

與人類相似，許多致癌劑可以誘發(fā)斑馬魚發(fā)生腫瘤，且兩者具有組織學(xué)相似性。肝臟是斑馬魚最容易發(fā)生腫瘤的臟器，因為魚類的肝臟一生中不停生長，NDMA和DBP可以誘發(fā)肝腫瘤。用DEN飼養(yǎng)斑馬魚8周后，肝臟及胰腺發(fā)生腫瘤。DMBA和MNNG除可誘發(fā)消化系統(tǒng)的腫瘤外，還可誘發(fā)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤[8]。用DMBA飼養(yǎng)感染假毛細(xì)線蟲的斑馬魚，腫瘤發(fā)病率比沒有感染的斑馬魚提高50%[8]。DABA導(dǎo)致斑馬魚發(fā)生混合性腫瘤(平滑肌和腺上皮惡性惡性腫瘤)，檢測斑馬的嵌合眼判斷EMS或ENU誘發(fā)囊胚期斑馬魚腫瘤發(fā)生情況[9]。致癌劑還可以誘發(fā)斑馬魚多處血管瘤，眼球脈絡(luò)膜和鰓處血管容易發(fā)生血管瘤，與這些部位豐富的小血管密度大有關(guān)[6]。

斑馬魚的誘發(fā)性腫瘤與人和哺乳類動物具有很高的相似性，但它們解剖結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致其腫瘤類型存在一些不同的特點。斑馬魚的卵巢腫瘤大部分是上皮組織癌，腺癌很少，也極少發(fā)生脂肪肉瘤和脂肪瘤。血源性腫瘤除淋巴瘤外，斑馬魚很少患有其它血液腫瘤，氣囊罕見發(fā)生腫瘤[6]。斑馬魚腫瘤很少發(fā)生哺乳類動物類似的自發(fā)性淋巴轉(zhuǎn)移和骨髓轉(zhuǎn)移[10]。

化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的斑馬魚腫瘤模型操作非常方便，但因其發(fā)生率低、腫瘤發(fā)生的臟器不確定，具有一定的局限性。但這類腫瘤組織細(xì)胞的雜合性與人類腫瘤發(fā)生的過程高度相似，常用于因基因變異而誘發(fā)腫瘤的病因?qū)W研究。

2.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型現(xiàn)代生物及轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以改變斑馬魚的遺傳背景，將腫瘤誘導(dǎo)基因?qū)氚唏R魚生殖細(xì)胞可以形成轉(zhuǎn)基因腫瘤模型。用rag2啟動斑馬魚淋巴細(xì)胞基因c-myc表達(dá)，產(chǎn)生T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病模型，并從胸腺擴散至骨和內(nèi)臟組織，hlk，srk和otg基因變異也產(chǎn)生T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病模型[11]。有學(xué)者用電轉(zhuǎn)基因方法，在BRAF/p53-/-/mitfa背景下，Cas9敲除抑癌基因Rb1造成高侵襲性黑色素瘤細(xì)胞，7周內(nèi)100%產(chǎn)生具有免疫相容的黑色素瘤斑馬魚模型[12]。建立這種轉(zhuǎn)基因模型需要大量時間，腫瘤發(fā)生位置隨機性大，大部分轉(zhuǎn)基因斑馬魚不能成活至性成熟期形成可遺傳性的腫瘤模型。

組織特異性啟動子可以特異地控制組織的基因表達(dá)，誘發(fā)特定組織的斑馬魚腫瘤模型。黑色素細(xì)胞特異性啟動子mitfa促進(jìn)BRAF高表達(dá)，絲氨酸/蘇氨酸激酶BRAF活性增加，激活MAPK通路產(chǎn)生黑色素瘤。在p53-/-突變背景下，BRAF激活組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1促進(jìn)黑色素瘤增長，形成黑色素瘤斑馬魚模型。阻斷SPRED1后，同時抑制pten和p53后促進(jìn)斑馬魚粘膜黑色素瘤的生成。BRAF/p53-/-/mitfa斑馬魚僅5%發(fā)生黑色素瘤，SETDB1阻斷15周后20%形成黑色素瘤[13]。改變許多組織特異性啟動子造成斑馬魚腫瘤模型，啟動子fabp10促進(jìn)KRAS或激活肝β-catenin，6個月后誘發(fā)斑馬魚產(chǎn)生肝癌，ptf1啟動子促進(jìn)KRAS產(chǎn)生胰腺癌，KRAS或Mylz2基因的表達(dá)產(chǎn)生橫紋肌肉瘤斑馬魚模型[14-15]。nf1基因的缺失促進(jìn)轉(zhuǎn)基因斑馬魚MYCN誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲作用，dbh和sox可誘發(fā)腦部腫瘤[16-17]。特異性啟動子誘發(fā)的斑馬魚腫瘤組織特異性強，但存在基因的脫靶現(xiàn)象，有時啟動子的組織特異性不強，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率不高。

與誘發(fā)性斑馬魚腫瘤模型比較，轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型可控性和發(fā)生率均增高，但其操作的復(fù)雜性也增加，需要大量的經(jīng)費和時間。

2.3 植入性斑馬魚腫瘤模型植入性斑馬魚腫瘤模型是將標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞植入斑馬魚胚胎或成體魚不同位置，用于研究腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤藥物。斑馬魚受精后48 h內(nèi)是植入腫瘤細(xì)胞的最佳時期[18]，植入的位置包括卵黃囊、卵周間隙或居維葉氏管，也可以注入成體斑馬魚的腹腔內(nèi)。腫瘤細(xì)胞植入斑馬魚的位置不同，腫瘤細(xì)胞的生長方式不同，研究目的也不相同。卵黃囊是有清晰界限無細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，由膽固醇、甘油三酯和磷脂膽堿等脂類物質(zhì)組成，植入卵黃囊標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞非常容易觀察，用于研究腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂和運動功能[19-20]。卵黃周隙沒有血管及淋巴管等結(jié)構(gòu)，在發(fā)育過程中靠近胸腹部的血管，腫瘤細(xì)胞植入卵黃周隙，利于研究在腫瘤細(xì)胞刺激下血管發(fā)生、血管轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞增殖[21]。這種模型觀察窗口較短，只有5～6 d(植入后)，并且對幼體產(chǎn)生損傷。也可在2～3 dpf直接將腫瘤細(xì)胞(熒光標(biāo)記)注入居維氏管而導(dǎo)入血循環(huán)[22]。循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞在尾部造血組織附近生成腫瘤，適用于腫瘤細(xì)胞的血管侵襲轉(zhuǎn)移和EMT的研究。

斑馬魚胚胎免疫系統(tǒng)沒有發(fā)育成熟，利于外源腫瘤細(xì)胞的生長增殖，但因其體積小，僅能植入少量腫瘤細(xì)胞。成年斑馬魚可以植入大量腫瘤細(xì)胞，每尾魚可種植5×104個腫瘤細(xì)胞，甚至可達(dá)2×106個細(xì)胞。但成年斑馬魚對外源性腫瘤細(xì)胞具有免疫排斥反應(yīng)而不能生長增殖，因此，成年斑馬魚腫瘤模型需要用免疫抑制劑或γ-射線抑制機體的免疫系統(tǒng)。大劑量地塞米松抑制斑馬魚免疫反應(yīng)，用高分辨共聚集顯微鏡可以觀察綠色熒光蛋白標(biāo)記的斑馬魚兩周內(nèi)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的情況[21]。γ-射線照射斑馬魚后免疫系統(tǒng)的恢復(fù)需要30 d，腫瘤細(xì)胞可以生長增殖20 d[23]。也有學(xué)者先將腫瘤細(xì)胞用射線照射后植入斑馬魚幼魚，3個月后再植入沒有照射的同種腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞不被免疫系統(tǒng)抑制并表現(xiàn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的特點[24]。

用免疫抑制劑或γ-射線照射抑制斑馬魚免疫系統(tǒng)，增加了一個可變因素，還存在抑制劑與篩選藥物間可能的相互作用。為了避免高劑量地寒米松或低致死量γ射線所致的不利因素，可用免疫缺陷型斑馬魚建立植入性腫瘤模型。改變斑馬魚rag2基因，降低T、BK細(xì)胞數(shù)而抑制斑馬魚的免疫系統(tǒng)，可在不同位置植入腫瘤細(xì)胞[25]。采用prkdc-/-和il-2rga-/-基因突變造成免疫缺陷斑馬魚(T、B、NK細(xì)胞缺陷)，這種斑馬魚可以37 ℃水溫中飼養(yǎng)，移植腫瘤細(xì)胞株或患者腫瘤細(xì)胞可以生長28 d，有效地避免了腫瘤細(xì)胞與斑馬魚生長的溫度差異問題[26]。

植入性斑馬魚腫瘤模型與誘發(fā)性及轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型比較具有更高的可控性，研究者可以將腫瘤細(xì)胞植入斑馬魚的不同位置實現(xiàn)自己的研究目的。但斑馬魚胚胎或成體斑馬魚的免疫系統(tǒng)處于不成熟或抑制狀態(tài)，對研究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的相互作用有一定的影響。

3 結(jié)語

斑馬魚腫瘤模型制作方法簡便、實驗周期短，有較好的重現(xiàn)性，與人類基因高度相似，且具有體內(nèi)成像、遺傳易處理性和藥物效應(yīng)測試的順從性等特點，給學(xué)者提供了研究腫瘤機制的獨特優(yōu)勢。斑馬魚腫瘤模型已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但斑馬魚腫瘤模型也有其局限性。斑馬魚個體小，解剖及組織定位有一定的難度，原位腫瘤植入難度較大。斑馬魚可以產(chǎn)生大量遺傳一致的后代，但胚胎和幼體死亡率較高，后代的純合子雄性多于雌性。斑馬魚可以用來研究胃癌、肺癌、乳腺癌及前列腺癌，但因其沒有相應(yīng)的組織結(jié)構(gòu)而不能進(jìn)行原位腫瘤的研究[27-28]。斑馬魚移植瘤生長時間短、種植細(xì)胞少，很難進(jìn)行獲得性腫瘤抗藥性研究[29]，也缺乏相應(yīng)有效的斑馬魚蛋白抗體。斑馬魚正常體溫約28 ℃，哺乳類動物的腫瘤細(xì)胞高于這個體溫，并且有些腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵基因?qū)囟确浅Ｃ舾小ｋm然斑馬魚腫瘤模型有以上不足，但不可否認(rèn)，斑馬魚作為新興的獨具特點的實驗動物，其腫瘤模型給人類抗腫瘤藥物高通量篩選，預(yù)測抗腫瘤藥物的抗腫瘤范圍以及臨床腫瘤個體化治療方案提供非常有用的價值，也為腫瘤的研究提供了新的途徑和模型系統(tǒng)。