徐如夢，李冬月，劉秀麗，嚴(yán)成其，陳劍平，王栩鳴*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021； 3.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

水稻是我國主要的糧食作物之一，也是全世界大量人口的主糧。然而，水稻因其固定的生長環(huán)境和單一的種植模式容易遭受各種病蟲害的侵襲，每年水稻因病害、蟲害以及不良的環(huán)境因素造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。水稻白葉枯病作為一個傳統(tǒng)病害，曾經(jīng)在浙江等地沉寂了很長時間，但是最近由于氣候、耕作條件等變化，白葉枯病的發(fā)生也在逐年加重，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌水稻致病變種引起的一種細(xì)菌性維管束病害，于1884年在日本福岡縣被首次發(fā)現(xiàn)[1]。目前，防治病害的主要措施還是利用殺菌劑，但長期大量的使用殺菌劑不僅會對生態(tài)環(huán)境造成污染，還會造成谷物農(nóng)藥殘留、稻米的品質(zhì)以及安全性下降，不當(dāng)?shù)霓r(nóng)藥使用還會導(dǎo)致病菌抗藥性增強(qiáng)，使病害變得更加嚴(yán)重，削減防治的效果。然而，抗性基因的挖掘和其抗病機(jī)理的研究，為水稻抗病資源的高效利用以及病害的防控提供了新的思路。1995年，宋文源等[2]克隆了水稻中的第一個抗白葉枯病基因Xa21。迄今為止，已經(jīng)在水稻中克隆了16個白葉枯抗病基因，分別是Xa1[3]、Xa2[4]、Xa3/Xa26[5]、Xa4[6]、xa5[7]、Xa7[8]、Xa10[9]、xa13[10]、Xa14[4]、Xa21[2]、Xa23[11]、xa25[12]、Xa27[13]、Xa31(t)[4]、xa41(t)[14]和Xa45(t)[4]。近年來，水稻抗病基因與Xoo無毒基因之間互作的分子機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，促使水稻與Xoo之間的互作機(jī)制成為研究水稻與病原細(xì)菌相互作用的模型。為此，本文對水稻與Xoo之間的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜述，剖析水稻抗病基因與Xoo無毒基因之間互作的分子機(jī)制，以期為水稻抗病分子育種提供理論支持。

1 Xoo對水稻的侵染過程

水稻白葉枯病主要發(fā)生在熱帶和溫帶稻區(qū)，集中分布在亞洲、澳大利亞北部、拉丁美洲、非洲等地區(qū)[15]。水稻白葉枯病最初被認(rèn)為是一種由酸性土壤環(huán)境引起的非侵染性病害[16]。20世紀(jì)初，科研工作者從患病的水稻葉片上分離和純化出了大量的細(xì)菌，并通過將這些細(xì)菌接種到同一水稻品種的健康葉片上重現(xiàn)了該癥狀[16]。后來，該病害被確定為細(xì)菌性病害，從中分離純化的病原物被作為一個新的物種命名為Xoo[17-18]。

在接觸到水稻葉片后，Xoo可以通過水孔或傷口進(jìn)入葉片細(xì)胞進(jìn)行半活體營養(yǎng)型生殖[1]。水稻葉片在夜間通常會出現(xiàn)“吐水現(xiàn)象”，這些從水孔中滲漏出的水滴會將葉表面的Xoo懸浮起來，從而使Xoo通過主動或被動的形式進(jìn)入葉片細(xì)胞[19]。在侵入植物后，Xoo主要在水稻葉片的下表皮細(xì)胞間隙生長和繁殖，并通過木質(zhì)部進(jìn)入和傳播到植物的其他部位[20]。幾天時間內(nèi)，Xoo和其產(chǎn)生的胞外多糖便會充滿木質(zhì)部導(dǎo)管，并從水孔滲到葉尖和葉邊緣上形成珠狀或絲狀滲出物[15]。這些滲出物會使水稻的葉尖和葉邊緣形成綠色的浸水斑點，隨著時間的推移這些斑點會沿著葉脈延伸逐漸使葉片黃化直至壞死形成不透明的灰白色病斑[16]。

2 水稻抵御Xoo侵染的免疫防御反應(yīng)

在與病原微生物協(xié)同進(jìn)化過程中，植物發(fā)展出了多種策略來保護(hù)自己免受疾病侵害。其中，擬南芥與病原物互作系統(tǒng)作為一種模型系統(tǒng)研究得較為透徹[21-22]。與擬南芥一樣，水稻也進(jìn)化出了兩層免疫系統(tǒng)：第一層是由模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)觸發(fā)的免疫反應(yīng)(pattern-triggered immunity，PTI)，主要是通過植物細(xì)胞膜上的模式識別受體來感知由病原物產(chǎn)生的病原物相關(guān)的模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而觸發(fā)相對較弱的免疫反應(yīng)來抑制或阻止病原菌的侵染；第二層是由病原菌無毒基因編碼的效應(yīng)蛋白觸發(fā)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity，ETI)，主要是通過植物抗性基因編碼的抗性蛋白直接或者間接地識別由病原物分泌的效應(yīng)蛋白，從而觸發(fā)的一種快速而又強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[23]。

2.1 PTI反應(yīng)

PTI在非寄主抗性和基礎(chǔ)抗性中起關(guān)鍵作用，保護(hù)植物免受各種潛在的病原物的迫害[24]。在植物中，PRRs主要包括類受體蛋白激酶(receptor-like kinases，RLKs)和類受體蛋白(receptor-like proteins，RLPs)。其中，RLKs和RLPs的胞外亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)相似，但不同的是RLKs具有胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域[25]。Fritz-Laylin等[26-27]在日本粳稻基因組中鑒定出了90個RLPs基因，研究表明，這些RLPs可能參與水稻的生長發(fā)育和免疫防御信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。RLKs是植物中參與防御相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的大基因家族[27]，目前已經(jīng)定位并克隆了一些與細(xì)菌防御相關(guān)的RLKs基因，例如AtFLS2[28]和AtEFR[29]。

PAMPs是對于病原體適應(yīng)性必不可少的保守分子，并且不會存在于寄主細(xì)胞中[30]。大多數(shù)已知細(xì)菌病原物的PAMPs可分為多肽類型或碳水化合物類型。其中，具有多肽特征的PAMPs包括細(xì)菌鞭毛蛋白、延伸因子Tu和AxYS22，而具有碳水化合物特征的PAMPs包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和肽聚糖(peptidoglycan，PGN)[31]。研究表明，AtFLS2基因和AtEFR基因編碼的RLKs分別是細(xì)菌鞭毛蛋白和延伸因子Tu的受體[28-29]。與AtFLS2直系同源的OsFLS2也編碼細(xì)菌鞭毛蛋白的受體[32]，而水稻的Xa21基因編碼的XA21蛋白被鑒定為AxYS22的受體[2]。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜糖綴合物，由脂質(zhì)A、核心寡糖和多糖部分組成，其功能是協(xié)調(diào)革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜通透性，使細(xì)菌在不利的環(huán)境中生長[33]。研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞可能通過不同的受體感知LPS中的糖和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而引發(fā)不同的防御反應(yīng)[34]。盡管LPS受體的分子特征在動物中已經(jīng)得到了廣泛的研究[35-36]，但目前尚未在水稻中識別和鑒定出這些LPS受體。PGN是革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌中必不可少的細(xì)胞壁成分，可為細(xì)菌的細(xì)胞提供硬度和結(jié)構(gòu)上的支持[36]。由于目前尚未在真核生物中發(fā)現(xiàn)PGN，因此，它被認(rèn)為是植物基礎(chǔ)抗性系統(tǒng)的極佳靶標(biāo)[37-38]。來源于根癌農(nóng)桿菌和野油菜黃單胞菌的PGN作為一種多肽型的PAMPs誘導(dǎo)了擬南芥的免疫反應(yīng)，其中包括誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生、防御相關(guān)基因的表達(dá)和胼胝質(zhì)的沉積[39]。在水稻中，LYP4和LYP6基因編碼的PRRs是來源于Xoo的PGN受體。破壞其中的任一基因都會大大損害PGN誘導(dǎo)的水稻防御反應(yīng)，從而導(dǎo)致水稻對細(xì)菌病原體的敏感性增加[33]。

絲裂原活化的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)是(mitogen-activated protein kinase cascade，MAPK)植物免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路，在PRRs的下游起作用，可將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)[40]。MAPK級聯(lián)反應(yīng)至少由3種激酶組成：MAPK激酶激酶(MAP3K)、MAPK激酶(MAP2K)和MAPK[41]。這些酶在高等植物中是高度保守的，在植物的生長發(fā)育和防御反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[42-45]。植物通過PRRs感知到病原物的刺激后，其MAPKKKs被磷酸化并激活下游的MAPKKs，后者又磷酸化并激活MAPKs。活化的MAPK磷酸化特定的下游底物，從而導(dǎo)致植物防御反應(yīng)的激活[46]。MAPKs級聯(lián)反應(yīng)通過調(diào)節(jié)防御相關(guān)基因的激活、抗菌代謝物的合成以及過敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive response-like cell death，HR)而賦予了植物另一道防御機(jī)制[42-45]。例如，AtMPK3和AtMPK6在病原體(flg22和LPS)誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉中發(fā)揮重要作用[47-48]。當(dāng)病原細(xì)菌入侵時，OsMPKK10.2在S304處被未知的激酶磷酸化，隨后激活了OsMPK6，經(jīng)過一系列的信號傳遞使OsMPKK10.2-OsMPK6信號級聯(lián)的激活被放大，從而通過積累H2O2等防御反應(yīng)增強(qiáng)了水稻的抗性[49]。

2.2 ETI反應(yīng)

盡管水稻能夠觸發(fā)PTI反應(yīng)，產(chǎn)生一種對多種病原物都有效的基礎(chǔ)免疫，但是在植物與病原物共同進(jìn)化的過程中，病原物也通過產(chǎn)生一些?；缘男?yīng)因子規(guī)避了這種防御反應(yīng)，從而導(dǎo)致了植物的效應(yīng)子觸發(fā)易感性[50]。植物在遭受病原物無休止的攻擊后，也會進(jìn)化出一些新的抗性基因以求生存。這些抗性基因編碼的蛋白可以特異性識別病原物無毒基因編碼的效應(yīng)因子，從而激活ETI[51-52]。迄今為止，已經(jīng)鑒定出了超過46個基因賦予水稻對Xoo的抗病性，且成功克隆了其中的16個抗性基因[8]。為了進(jìn)一步理解水稻-Xoo互作的分子機(jī)制，暫時將這16個已被克隆的抗性基因根據(jù)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分為以下五類：(1)直接或間接感知細(xì)胞表面的PAMPs；(2)直接或間接感知細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)因子；(3)ExectorR基因-針對類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effectors，TALEs)的啟動子陷阱；(4)被動的喪失易感性基因-喪失與宿主互作的關(guān)鍵靶標(biāo)；(5)其他分子機(jī)制。

2.2.1 直接或間接感知細(xì)胞表面的PAMPs

在已被克隆的所有抗白葉枯病基因中，Xa21和Xa3/Xa26基因是一類編碼類受體蛋白激酶的抗病基因。其中Xa21的抗病相關(guān)機(jī)制研究的較為清晰，研究表明，XA21可以通過結(jié)合ATPase(XB24)、E3泛素連接酶(XB3)、PP2C磷酸酶(XB15)、WRKY62轉(zhuǎn)錄因子(XB16)、錨蛋白重復(fù)蛋白(XB25)和輔助因子蛋白(XB21)[53-58]等蛋白來調(diào)節(jié)水稻對Xoo的防御反應(yīng)。其中，XB15[55]、XB16[56]是負(fù)調(diào)控Xa21介導(dǎo)的抗病性，而XB24[53]、XB3[57]、XB25[54]和XB21[58]正向調(diào)控Xa21介導(dǎo)的抗病性。例如，當(dāng)沒有病原物入侵時，XB24結(jié)合在XA21上，利用其ATPase活性促使XA21上某些Ser/Thr位點的磷酸化，從而使XA21蛋白處于非活性狀態(tài)[53]；當(dāng)病原物入侵時，XA21在識別PAMPs后從XB24上分離，分離下來的XA21被切割，其被切割的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能[53,59]。另外，這些細(xì)胞表面的PRRs在識別PAMPs的過程中還需要招募一些額外的LRR-RLKs共受體。其中，OsSERK2是一種LRR-RLKs共受體，參與XA21介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[60]。此外，LRR1與OsSERK2的胞外結(jié)構(gòu)域具有68%的相似性，是XA21介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所必需的[61]。Xa3/Xa26也是編碼類受體蛋白激酶的抗病基因，與Xa21屬于同一種類型。含有Xa3/Xa26的轉(zhuǎn)基因植物通過增強(qiáng)防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)提高了水稻對白葉枯病的抗病性[62]。

2.2.2 直接或間接感知在細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)因子

為了有效地侵染植物，病原菌會將稱為效應(yīng)因子的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外空間或直接分泌到植物宿主細(xì)胞中[63]。植物固有的免疫受體包括定位在細(xì)胞表面的PRRs以及定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜的NLR受體[64-65]。PRRs可以識別保守的PAMPs和細(xì)胞外效應(yīng)因子[63,65]，而NLR則是檢測感染過程中傳遞到宿主細(xì)胞中的效應(yīng)因子的存在或活性的[64]。顯性主效抗病基因Xa1編碼的蛋白產(chǎn)物含有核苷酸結(jié)合位點(nucleotide binding sites，NBS)和一種新型的富含亮氨酸的重復(fù)序列(Leucine-rich repeats，LRR)，是NBS-LRR類蛋白中的一員[3]。Xa1能夠識別病原菌的多種TALEs，當(dāng)Xoo侵染時，會導(dǎo)致植物木質(zhì)部薄壁組織細(xì)胞形成自噬小體，從而通過自噬性細(xì)胞死亡過程來影響水稻對Xoo的抗性[66]。近期已成功鑒定并克隆了4個Xa1的等位基因，分別是Xa2、Xa14、Xa31(t)和Xa45(t)[4,51]。這些等位基因也編碼NLR類蛋白，其中Xa1、Xa2和Xa14之間的相互作用在水稻對Xoo的抗病性中起著非常復(fù)雜的作用[51]。

2.2.3 ExectorR基因-針對TALEs的啟動子陷阱

TALEs通過結(jié)合到特定的DNA序列，操縱宿主中的關(guān)鍵感性基因的轉(zhuǎn)錄[67-68]。但是在共同進(jìn)化的過程中，水稻進(jìn)化出了ExecutorR基因，其啟動子可以充當(dāng)誘餌，模仿這些易感性基因的啟動子區(qū)域，從而引發(fā)免疫反應(yīng)[68-69]。迄今為止，已經(jīng)克隆了4個ExecutorR基因，分別是：Xa10、Xa27、XA23和Xa7。它們可以被相應(yīng)的TALEs(AvrXa10、AvrXa27、AvrXa23和AvrXa7)激活，從而觸發(fā)ETI[8-9,11]。其中，Xa10基因被AvrXa10特異性誘導(dǎo)表達(dá)后[70]，其編碼的產(chǎn)物XA10以六聚體的形式定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)膜上，從而通過破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的保守機(jī)制來觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)[9]。野生稻來源的Xa23與Xa10具有50%以上的序列同源性，該基因啟動子區(qū)域含有AvrXa23的TALE結(jié)合元件(TALE binding element，EBE)，因而能夠被Xoo中的AvrXa23特異性的結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，使植株產(chǎn)生抗病性。而AvrXa23廣泛存在于各種Xoo菌株的生理小種中，因此，含有啟動子區(qū)域存在EBEAvrXa23元件的Xa23基因的水稻對白葉枯病表現(xiàn)出極廣的抗病性[71]。而其易感的等位基因xa23，雖然和Xa23有相同的編碼序列，但其啟動子區(qū)域缺乏EBEAvrXa23元件，無法被AvrXa23激活表達(dá)，表現(xiàn)出感病的表型[11]。相比之下，Xa27介導(dǎo)的抗病性是取決于其編碼的XA27蛋白在質(zhì)外體的定位[72]。最新的研究表明，Xa7基因賦予了水稻對白葉枯病的廣譜高抗性和持久性。Xoo菌株分泌的AvrXa7和PthXo3可以識別并結(jié)合在Xa7啟動子中的效應(yīng)物結(jié)合元件上，通過誘導(dǎo)Xa7的表達(dá)引發(fā)了植物的過敏性細(xì)胞死亡反應(yīng)[8]。

2.2.4 被動的喪失易感性基因的轉(zhuǎn)錄-喪失與宿主互作的關(guān)鍵靶標(biāo)

許多的黃單胞菌屬的菌株將其TALEs通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，T3SS)直接注入植物宿主細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入宿主細(xì)胞的TALEs隨后易位至細(xì)胞核，從而與宿主的易感性基因中的特定啟動子序列結(jié)合，達(dá)到引起植物病害的目的[73-74]。TFIIA作為RNA聚合酶Ⅱ所需的通用轉(zhuǎn)錄因子之一，可以與TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH組裝成具有轉(zhuǎn)錄能力的預(yù)起始復(fù)合物來啟動真核生物中的mRNA合成[74]。其中，Xa5(OsTFIIAγ5)基因編碼TFIIA的一個小亞基，對依賴于RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[75-77]。隱性基因xa5作為Xa5的天然等位基因，其在編碼區(qū)的第39個氨基酸殘基上發(fā)生了一個突變，即其纈氨酸(V)殘基被谷氨酸殘基(E)(V39E)取代[76]。研究表明，xa5的錯義突變削弱了TALEs和具有轉(zhuǎn)錄能力的預(yù)起始復(fù)合物之間的相互作用，抑制了相應(yīng)的易感性基因的轉(zhuǎn)錄，從而賦予了水稻對Xoo的抗病性[69,78-79]。但是，在xa5背景下，TALEs對抗病性基因和感病性基因的誘導(dǎo)能力都會被削弱[9,80-81]。除了Xa5，Xoo的TALEs還可以直接靶標(biāo)在Xa13/OsSWEET11[50]、Xa25/OsSWEET13[82]和Xa41/OsSWEET14[14]基因的相應(yīng)效應(yīng)子結(jié)合元件(effector binding elements，EBEs)上，通過上調(diào)其在水稻中的表達(dá)使水稻患病。研究表明，xa13、xa25和xa41(t)基因與其相應(yīng)的易感性等位基因編碼相同的蛋白質(zhì)，但在其啟動子區(qū)域具有關(guān)鍵的序列差異。它們通過導(dǎo)致TALEs靶向錯誤減少其啟動子區(qū)域與TALEs的結(jié)合，賦予了水稻對部分Xoo菌株的抗性[14,82-83]。

2.2.5 其他分子機(jī)制

細(xì)胞壁相關(guān)激酶(cell wall-associated kinase，WAK)基因家族是一個大基因家族，在水稻中至少有125個成員[84]。但是，僅有少數(shù)的WAK基因參與植物與病原菌的相互作用[85-86]。其中，Xa4編碼一種細(xì)胞壁相關(guān)激酶，由預(yù)測的半乳糖醛酸結(jié)合域、鈣結(jié)合表皮生長因子結(jié)構(gòu)域、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(serine/threonine kinase domain，STK domain)組成[6]。研究表明，Xa4通過促進(jìn)纖維素合成和抑制細(xì)胞壁松弛來增強(qiáng)水稻植株的細(xì)胞壁，從而提高了水稻對Xoo的抵抗力[6]。除了從細(xì)胞壁這一防線遏制Xoo入侵外，Xa4還可以通過產(chǎn)生植保素來保護(hù)水稻免受Xoo的迫害[6]。

3 小結(jié)和展望

植物的抗病性與病原物的致病性都不是一成不變的，植物與病原物處于一個長期協(xié)同進(jìn)化的過程中。水稻與Xoo之間的協(xié)同進(jìn)化的動態(tài)變化規(guī)律也遵循Jones[23]提出的Z字形模型。在進(jìn)化的過程中，改變抗病基因可識別的無毒基因并進(jìn)化出新的毒力因子是Xoo逃避和抵消水稻免疫力的2種常見機(jī)制[87]，而植物則是通過進(jìn)化出PTI和ETI 2層免疫系統(tǒng)抵御病原物的入侵。

隨著水稻白葉枯病抗性基因作用機(jī)理的深入研究，極大的加速了水稻白葉枯病抗性育種的進(jìn)程。近年來，已經(jīng)有不少抗病基因被成功應(yīng)用到水稻的抗病育種中。但是，由于很多抗病基因表現(xiàn)出很強(qiáng)的小種特異性，而這些抗病性會隨著病原菌小種間的變異而發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生的抗性在生產(chǎn)應(yīng)用上難以長久維持。而發(fā)掘新種質(zhì)、創(chuàng)制抗病新材料、培育抗性新品種，被認(rèn)為是提高糧食產(chǎn)量和保證糧食安全生產(chǎn)的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。其中，培育水稻抗病新品種的基礎(chǔ)在于利用優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，成功的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確選擇合適的廣譜高效的抗病基因進(jìn)行改造。野生稻作為一種能夠長期在野生狀態(tài)下生存的水稻，在與病原物的長期協(xié)同進(jìn)化過程中進(jìn)化出了大量的抗性基因，是水稻抗病基因資源挖掘的寶庫。因此，綜合運(yùn)用現(xiàn)代分子生物技術(shù)手段挖掘這些基因資源，利用基因編輯等新技術(shù)研究相應(yīng)的抗病基因功能，采用體細(xì)胞雜交、分子標(biāo)記輔助等方法，創(chuàng)制新型的種質(zhì)資源，選育抗病新品種，對于實現(xiàn)水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)以及安全生產(chǎn)具有直接的現(xiàn)實意義。