許 晅 李 璋 馬群飛 柳春燕 邵太麗 袁平川 陳靠山（山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266237）

補體系統(tǒng)被認(rèn)為是由血清、組織液和細(xì)胞膜表面的一組不耐熱的具有酶活性的球蛋白組成的生物效應(yīng)系統(tǒng)，由復(fù)雜的酶促級聯(lián)反應(yīng)最終形成攻膜復(fù)合體，實現(xiàn)對靶細(xì)胞的裂解和破壞以保護宿主機體。補體系統(tǒng)有3 條相互交叉的途徑：經(jīng)典途徑（classical pathway，CL）、替代途徑（alternative pathway，AP）以及凝集素途徑（mannose-bing lectin，MBL），主要在病原體感染、局部性組織損傷以及炎癥與過敏等方面起關(guān)鍵性免疫調(diào)節(jié)作用。其中，肝臟是機體補體的最主要來源，由此產(chǎn)生的補體被稱為系統(tǒng)補體，主要負(fù)責(zé)血清的補體免疫調(diào)節(jié)；局部感染或損傷條件下，機體組織細(xì)胞也會產(chǎn)生補體，稱為局部補體［1］。這兩類補體發(fā)揮黏附細(xì)胞、中和病毒、降解免疫復(fù)合物以及調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫的作用，因此，補體也被視為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁［2］。

近年細(xì)胞中補體及其功能的研究受到越來越多關(guān)注［3-4］。研究表明，細(xì)胞內(nèi)可能也存在由補體、補體受體、組織蛋白酶等組成的一個相對獨立的可調(diào)控細(xì)胞代謝與功能的胞內(nèi)生物效應(yīng)系統(tǒng)，由于其存在與功能區(qū)別于由肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的“胞外”補體系統(tǒng)，又被稱為胞內(nèi)補體系統(tǒng)（intracelluar complement system,ICS）［5］。胞內(nèi)補體在細(xì)胞中具有特定亞細(xì)胞定位區(qū)室，與域蛋白3（NLRP3）炎癥小體形成密切相關(guān)，因此，PETER GARRED 建議將其命名為complosome，即補體小體［6］。

1 胞內(nèi)補體的發(fā)現(xiàn)

C3 和C5 在“胞外”補體系統(tǒng)中處于關(guān)鍵地位，其產(chǎn)生的活性組分C3a 和C5a（也被稱為過敏毒素，anaphylatoxin）不僅能夠招募單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞到感染部位，還可產(chǎn)生增強平滑肌細(xì)胞收縮、舒張血管、誘導(dǎo)粒細(xì)胞與肥大細(xì)胞脫顆粒和促進細(xì)胞因子分泌等作用［7］。在細(xì)胞內(nèi)ICS中，C3 和C5 也處于類似的關(guān)鍵地位，但卻發(fā)揮全然不同的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。尤其在人CD4+T免疫細(xì)胞中，胞內(nèi)C3 和C5 系統(tǒng)對該細(xì)胞的靜息態(tài)與激活態(tài)維持與轉(zhuǎn)變、營養(yǎng)代謝與增殖分化、凋亡調(diào)控等方面均具有重要作用［8］。

自2005 年起，研究者開始認(rèn)識到源自T 細(xì)胞內(nèi)的補體對Th1 效應(yīng)細(xì)胞分化以及IFN-γ 表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，尤其是C3a 和C3b 及其各自受體C3aR和CD46［9-13］。后來，LISZEWSKI 等［3］發(fā)現(xiàn)人CD4+T細(xì)胞受外源刺激時會在極短時間（5 min 內(nèi)）將胞內(nèi)的C3a 和C3b 分泌至細(xì)胞外并與細(xì)胞膜上各自的受體結(jié)合，進而誘導(dǎo)Th1 效應(yīng)細(xì)胞分化。但胞內(nèi)C3 補體的快速響應(yīng)現(xiàn)象并不能用蛋白從頭合成的時間線機制合理解釋。隨后研究表明，靜息狀態(tài)下，人CD4+T 細(xì)胞中會儲存C3、組織蛋白酶L（cathepsin L，CSTL）、C3a、C3b 以及C3aR 和CD46，這些組分共同構(gòu)成一個相對獨立的胞內(nèi)C3補體系統(tǒng)。其中，胞內(nèi)C3 可被CSTL 裂解產(chǎn)生活性組分C3a 和C3b。ARBORE 等［14］又在人CD4+T 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了胞內(nèi)C5系統(tǒng)并證實其對細(xì)胞營養(yǎng)代謝、線粒體氧化磷酸化、NLRP3 炎癥小體裝配、IL-1β 自分泌以及IFN-γ 誘導(dǎo)等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

研究者在免疫細(xì)胞（單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK 細(xì)胞，粒細(xì)胞，T 細(xì)胞、B 細(xì)胞）和非免疫細(xì)胞（纖維母細(xì)胞、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞）發(fā)現(xiàn)了多種胞內(nèi)補體，表明胞內(nèi)補體的存在具有普遍性［3，15-17］。但ICS 及其功能仍處于初步階段，研究者對此的認(rèn)知也存在多種見解，有待進一步研究，這是由于胞內(nèi)補體的組成與功能因物種與細(xì)胞類型不同而存在差異。

2 ICS在免疫細(xì)胞中的作用

目前，研究者對人CD4+T 細(xì)胞內(nèi)的C3 補體系統(tǒng)和C5 補體系統(tǒng)的研究和認(rèn)識更為充分。而小鼠CD4+T 細(xì)胞內(nèi)缺乏CD46，而其胞內(nèi)C3 被轉(zhuǎn)運至胞外后經(jīng)由C3轉(zhuǎn)化酶裂解為具有活性的組分［18-19］。

2.1 胞內(nèi)C3 補體系統(tǒng) 人CD4+T 細(xì)胞的胞內(nèi)C3依賴于淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1（lymphocyte func?tion associated antigen 1，LFA1）合成［20-21］。當(dāng)該細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，胞內(nèi)C3 可被位于溶酶體的CSTL裂解為活性組分C3a 和C3b，并與各自受體C3aR和CD46暫存于溶酶體中。當(dāng)細(xì)胞受TCR（+CD3）、協(xié)同刺激受體（CD28）、IL-12 等外源刺激后，胞內(nèi)的C3aR和CD46 首先被快速轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜，隨后，胞內(nèi)的C3a 和C3b 也從溶酶體轉(zhuǎn)移至胞外并與膜上各自受體結(jié)合，迅速激活CD4+T 細(xì)胞分化為Th1 效應(yīng)細(xì)胞并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ［3，9］。當(dāng)外源刺激終止后，胞內(nèi)C3系統(tǒng)還可調(diào)整人CD4+T 細(xì)胞從表達(dá)IL-2 轉(zhuǎn)而表達(dá)IL-10，促使效應(yīng)細(xì)胞從激活態(tài)向靜息態(tài)轉(zhuǎn)變［22-23］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，缺失C3 或CD46 的T 細(xì)胞雖能正常分化為Th2 效應(yīng)細(xì)胞，但不能分化為Th1 效應(yīng)細(xì)胞，上述研究結(jié)果給出了一個合理解釋［24-25］。

2.2 胞內(nèi)C5 補體系統(tǒng) 人CD4+T 細(xì)胞內(nèi)有兩種C5 活性組分，即C5a 和C5a-desArg，以及兩種C5a 受體，即C5aR2（GPR77，C5L2）和C5aR1（CD88）。其中，C5aR1主要分布于質(zhì)膜，而C5aR2存在于細(xì)胞內(nèi)和質(zhì)膜［20］。研究證實組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）可裂解C5生成活性組分C5a，而組織蛋白酶G（cathepsin G，CTSG）則能夠酶解C5aR1 并使之失活［26］。靜息狀態(tài)下，人CD4+T 細(xì)胞內(nèi)儲存有較低含量的C5 及其活性組分C5a，而C5a 受體以C5aR2 為主。當(dāng)CD4+T 細(xì)胞受到外界刺激后，胞內(nèi)C5a 含量增多，C5aR 受體也轉(zhuǎn)為以C5aR1 為主。胞內(nèi)的C5a與C5aR1 被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜并相互結(jié)合，一方面可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS，另一方面也能促進NLRP3 炎癥小體裝配從而激活I(lǐng)L-1β 自分泌，最終誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生［20］。當(dāng)刺激終止后，C5aR2 表達(dá)水平恢復(fù)并與C5aR1 形成二聚體，不僅可負(fù)調(diào)控由C5aR1 介導(dǎo)的上述胞內(nèi)信號途徑，還可通過抑制由C5aR1 介導(dǎo)的胞外ERK1/2 信號途徑，使T 細(xì)胞IFN-γ 表達(dá)下降，IL-10表達(dá)增加，促使細(xì)胞從激活態(tài)快速恢復(fù)至靜息態(tài)［27-31］。ARBORE 等［4］在C5缺陷患者中也發(fā)現(xiàn)了類似于C3缺陷患者的CD4+T細(xì)胞無法正常分化為Th1效應(yīng)細(xì)胞的現(xiàn)象，證實了胞內(nèi)C5 系統(tǒng)對T 細(xì)胞活性與功能調(diào)節(jié)的重要性。

但HAGGADONE 等［32］在單核/巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)C5a 介導(dǎo)的信號途徑卻能夠抑制NLRP3 炎癥小體裝配。此外，研究還發(fā)現(xiàn)補體調(diào)節(jié)蛋白CR1（CD35）和CD59 以及補體C1q 可負(fù)調(diào)控T 細(xì)胞存活及其細(xì)胞因子分泌［33-35］。以上研究表明ICS 可能因細(xì)胞類型差異而發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用。

3 胞內(nèi)補體對細(xì)胞基本代謝的調(diào)控

ICS 也在細(xì)胞有氧糖酵解、線粒體氧化磷酸化途徑、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、細(xì)胞凋亡等基本代謝方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

3.1 胞內(nèi)補體對細(xì)胞營養(yǎng)代謝和線粒體氧化磷酸化的影響 作為一種補體跨膜蛋白受體，CD46存在于所有有核細(xì)胞細(xì)胞膜，具有2 種胞質(zhì)末端，即CYT-1 和CYT-2［36-37］。當(dāng)人CD4+T 細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，其細(xì)胞膜上的CD46 主要以CD46-CYT-2 形式存在。而細(xì)胞受刺激后會分泌C3b 與CD46 結(jié)合并上調(diào)CD46-CYT-1含量。隨后，胞質(zhì)末端的CYT-1被γ-分泌酶（γ-secretase）切割，入核后誘導(dǎo)多種營養(yǎng)代謝相關(guān)基因表達(dá)，如葡萄糖轉(zhuǎn)運體1（GLUT1，SLC2A1）與L 型氨基酸轉(zhuǎn)運體1（LAT1，SLC7A5），從而促進外源葡萄糖和氨基酸內(nèi)流；此外，CD46-CYT-1信號途徑也可調(diào)節(jié)受體調(diào)控蛋白（LAMTOR5，一種氨基酸感應(yīng)調(diào)節(jié)復(fù)合物的組成亞基）表達(dá)。最終，通過上述兩條途徑實現(xiàn)mTORC1 在溶酶體膜上的駐留，進而調(diào)整細(xì)胞營養(yǎng)代謝水平，使胞內(nèi)糖酵解和線粒體氧化磷酸化處于高水平狀態(tài)以利于Th1細(xì)胞增殖分化和IFN-γ 表達(dá)［8，38-40］。當(dāng)刺激信號終止時，T 細(xì)胞CD46-CYT-2 恢復(fù)至主導(dǎo)地位，并使細(xì)胞因子IL-10 上調(diào)，糖酵解水平恢復(fù)至常態(tài)，實現(xiàn)Th1效應(yīng)細(xì)胞活性回縮［17］。說明胞內(nèi)補體及其受體動態(tài)變化影響細(xì)胞靜息態(tài)與激活態(tài)轉(zhuǎn)變。另外，ASGARI 等［41］在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)C3aR 能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)ATP 外流并激活TLR 介導(dǎo)的炎癥小體裝配，認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)存在“補體-代謝-炎癥小體”信號軸，且對免疫細(xì)胞效應(yīng)活性調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用［14］。

3.2 胞內(nèi)補體對細(xì)胞周期與凋亡的影響 研究表明，C3a 和C5a 能夠通過激活NF-κB 和STAT-3 兩條信號途徑起始細(xì)胞周期基因轉(zhuǎn)錄從而使細(xì)胞進入G1 期；CR3 與CR4（均為iC3b 受體）促使細(xì)胞周期從G1期轉(zhuǎn)入S期；而C5aR1能夠通過促進DNA合成以及細(xì)胞分裂進而觸發(fā)細(xì)胞向G2/M期轉(zhuǎn)變［42-43］。

LISZEWSKI 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)CSTL 酶解產(chǎn)生的胞內(nèi)C3a 對人CD4+T 細(xì)胞存活至關(guān)重要。缺失C3a 會導(dǎo)致該細(xì)胞在8～12 h 凋亡，同時，其對C3 缺失的T 細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，該類T 細(xì)胞無法正常分化為Th1效應(yīng)細(xì)胞因而無法產(chǎn)生IFN-γ，但仍能產(chǎn)生足夠胞內(nèi)C3a 使T 細(xì)胞正常存活。另外，當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）處于低氧條件時會下調(diào)胞內(nèi)C3 含量以延長細(xì)胞存活時間［44］。而CD46、C5aR1 以及亞溶解型攻膜復(fù)合體（sublytic MAC）等可通過激活Bcl-2表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡［16，45-46］。MARTIN 等［47］發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞內(nèi)的補體調(diào)節(jié)因子FH能夠調(diào)節(jié)CTSL對內(nèi)源性C3酶解活性以產(chǎn)生活性組分iC3b 從而增強凋亡細(xì)胞調(diào)理作用。此外，神經(jīng)元細(xì)胞受低氧損傷時會通過胞內(nèi)C1q和位于線粒體的受體gC1qR 結(jié)合促使線粒體產(chǎn)生更多ROS，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［48］。

4 胞內(nèi)補體與受補體調(diào)節(jié)的胞內(nèi)病原體的作用

胞內(nèi)補體研究讓研究者對由補體侵染細(xì)胞的胞內(nèi)病原體有了更為深刻的認(rèn)識。當(dāng)不同胞內(nèi)病原體“劫持”補體并侵染細(xì)胞時，胞內(nèi)補體會觸發(fā)多種途徑產(chǎn)生或有利于病原體，或有利于宿主細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮。這種對抗與協(xié)助的雙重效應(yīng)可能與胞內(nèi)補體在細(xì)胞基本代謝中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

CHEN 等［49］發(fā)現(xiàn)人宮頸癌C33a 細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞能夠通過胞內(nèi)qC1qR 激活線粒體產(chǎn)生過量ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以阻止人乳突病毒HPV-16侵染。部分胞內(nèi)病原體與胞內(nèi)C3識別后，可直接介導(dǎo)靶向線粒體抗病毒信號蛋白MAVS，進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1 入核，使細(xì)胞產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β、IFN-β）［50］。當(dāng)李斯特菌侵染巨噬細(xì)胞時，該細(xì)胞膜上的VSIG4（一種位于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上的跨膜蛋白）可識別C3b并與之相互作用，通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡小體形成以清除李斯特菌［51］。C3 可誘導(dǎo)NADPH-oxidase 信號途徑增強中性粒細(xì)胞對類鼻疽伯克氏菌（B.seudomallei）的殺傷力，也能通過激活NF-κB 信號途徑增強抗腺病毒反應(yīng)［52-53］。研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷補體受體CR1 和CR2可起抑制丙型肝炎病毒HCV 結(jié)合B 細(xì)胞的作用［54］。另外，F(xiàn)H 在牛結(jié)核分枝桿菌BT 侵染巨噬細(xì)胞的早期階段可與牛結(jié)核分枝桿菌結(jié)合并誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)大量促炎細(xì)胞因子抑制該菌增殖［55］。SHAH 等［56］發(fā)現(xiàn)抑制人腎上皮細(xì)胞293T 胞內(nèi)CTSB 和CTSL 活性可阻止SARS 病毒和埃博拉病毒侵染。

相反地，丙型肝炎病毒HCV 在侵入T 細(xì)胞時，其核心蛋白與qC1qR 結(jié)合抑制ERK/MEK 信號通路，使IL-2表達(dá)降低，抑制T細(xì)胞增殖［57］。水皰型口炎病毒VSV 可利用線粒體上的qC1qR 以不依賴PI3K的方式下調(diào)RIG-Ⅰ活性，從而促進病毒胞內(nèi)復(fù)制［58］。C 型慢性肝炎病毒可識別C3d 并在CD19 和CD81 共同作用下與B 細(xì)胞結(jié)合，通過改變B 細(xì)胞受體類型抑制B 細(xì)胞活化、增殖及抗病毒能力［59］?？死撞暇勺R別C3 并依賴于細(xì)胞膜上的玻連蛋白（vitronectin）侵染非吞噬細(xì)胞和非免疫細(xì)胞［60］。人類免疫缺陷病毒HIV 能夠利用C5aR1-CCR5 二聚體侵染宿主細(xì)胞［61］。

5 總結(jié)與展望

綜上，細(xì)胞內(nèi)存在由補體、補體受體以及組織蛋白酶共同構(gòu)成的ICS，其存在與功能均相對獨立于“胞外”補體系統(tǒng)。ICS 不僅起維持細(xì)胞存活作用，還影響細(xì)胞基本代謝活動。尤其在免疫細(xì)胞中，胞內(nèi)“補體-代謝-炎癥小體”信號軸調(diào)節(jié)細(xì)胞靜息態(tài)和激活態(tài)維持與轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞在響應(yīng)外源刺激時能夠快速調(diào)整細(xì)胞代謝水平，并影響細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞因子表達(dá)與分泌［16］。近來研究者也發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)補體與“胞外”補體在一定條件下存在交流現(xiàn)象。Ca2+作用下，C3可依賴脂蛋白受體相關(guān)蛋白/α2-巨球蛋白受體（lipoprotein-receptor-related protein/α2-macroglobulin receptor）從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)［62］。ELVINGTON 等［63］發(fā)現(xiàn)C3（H2O）通過未知受體可從細(xì)胞外迅速轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。但GHANNAM等［24］發(fā)現(xiàn)外源C3 對記憶B 細(xì)胞分化的調(diào)控作用是胞內(nèi)C3無法代替的。

與“胞外”補體系統(tǒng)相比，ICS 可能更為復(fù)雜，原因在于胞內(nèi)補體組成與功能因細(xì)胞類別不同而有所差異。研究表明，不同類別細(xì)胞存在多種組織蛋白酶，可將胞內(nèi)補體裂解成不同活性組分；而同一種細(xì)胞也存在有無外源刺激等因素引起的胞內(nèi)補體組成與活性變化。如人CD4+T 細(xì)胞的胞內(nèi)C3 活化依賴于CTSL，而人上皮細(xì)胞的胞內(nèi)C3 活化不依賴于CTSL［17］。胞內(nèi)C3 可被酶解為C3a、C3b、iC3b、C3f、C3c 以及C3dg 等不同活性組分，這些組分在細(xì)胞內(nèi)定位也不同。其中，C3a 主要定位于溶酶體，而iC3b/C3dg 主要定位于順面高爾基體［64］。此外，CTSD 能夠?qū)5 酶解為C5a，而CTSG 能夠降解C5aR1［26］。

人類存在多種因補體缺失、功能障礙或過度活化引起的免疫性疾?。?，65］，如幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、年齡相關(guān)性黃斑變性等。其中，JIA是一種因T細(xì)胞內(nèi)C3a 高表達(dá)引起的自身免疫性疾病，過量C3a 與C3aR 結(jié)合不僅活化了蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），還會增強mTOR 信號通路，導(dǎo)致T 細(xì)胞分泌大量IFN-γ、腫瘤壞死因子（TNF）等促炎因子［66-68］。而LISZEWSK等［3］發(fā)現(xiàn)CSTL抑制劑可降低此類患者T細(xì)胞內(nèi)過量的C3a，從而抑制Th1效應(yīng)細(xì)胞過度活化并使IFN-γ 等促炎因子表達(dá)恢復(fù)正常。SAMATAD等［20］發(fā)現(xiàn)通過抑制CTSL 和CTSB 活性能夠使胞內(nèi)補體過度激活導(dǎo)致的腸道組織炎癥損傷得到有效緩解。而胞內(nèi)補體的發(fā)現(xiàn)不僅為補體研究打開了新局面，也讓研究者對多種受補體調(diào)節(jié)的胞內(nèi)病原體和因補體功能紊亂引起的免疫性疾病有了更深入的認(rèn)識，更為研究與開發(fā)治療相關(guān)免疫疾病藥物提供了新的思路和方法。