王 佳 林雪容 高恒波 張志斌（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科，張家口 075000）

膿毒癥是由感染引起的危重癥，以全身炎癥反應(yīng)激活為特征，炎癥因子大量釋放并引發(fā)膿毒癥性休克、多器官功能障礙，病死率較高，救治難度較大。心肌是膿毒癥常見(jiàn)的受累臟器，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)膿毒癥大鼠心肌中細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)均呈過(guò)度激活狀態(tài)，但調(diào)控膿毒癥病程中心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚未闡明［1-2］。

微小RNA（microRNA，miR）是近年心血管領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)并發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明，膿毒癥患者外周血中miR-21表達(dá)減少且與臟器損傷、炎癥反應(yīng)激活及預(yù)后密切相關(guān)，提示miR-21低表達(dá)可能在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3］。研究表明，心血管系統(tǒng)中miR-21 能夠靶向程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）基因并抑制心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中的細(xì)胞凋亡［4］；也可靶向CC趨化因子配體20（CC chemokine ligand 20，CCL20）基因并抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)［5］；PDCD4 及CCL20 高表達(dá)與膿毒癥患者炎癥反應(yīng)激活、臟器中細(xì)胞凋亡激活密切相關(guān)［6-7］。因此，課題組假設(shè)miR-21 可能靶向CCL20、PDCD4并抑制心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，miR-21在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中表達(dá)減少可能使其靶向作用減弱，進(jìn)而激活心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。為驗(yàn)證以上假設(shè)，本研究具體分析miR-21 靶向CCL20 及PDCD4 對(duì)膿毒癥大鼠心肌中細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 成年雄性SD大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004；心肌H9c2 細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑與儀器 miR-21 mimic 及陰性對(duì)照（negative control，NC）mimic 購(gòu)自上海吉瑪公司；miR 提取分離試劑盒、miR cDNA 第一鏈合成試劑盒、miR 熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司；cTnⅠ、CK-MB 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢明德生物公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司；HE 染色試劑盒、一步法TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；CCL20、PDCD4抗體購(gòu)自Abcam公司；CCL20、PDCD4雙熒光素酶報(bào)告基因及檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自Promega 公司，其中突變型CCL20、PDCD4雙熒光素酶報(bào)告基因根據(jù)TargetScan生物信息學(xué)分析結(jié)果將miR-21 靶向結(jié)合的堿基進(jìn)行突變；儀器熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司；顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司；離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù) SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、膿毒癥組、膿毒癥+NC 組、膿毒癥+miR-21 組，每組8 只。對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)操作，膿毒癥組、膿毒癥+NC 組、膿毒癥+miR-21 組采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥模型：腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.3 ml/kg），開(kāi)腹并分離盲腸，在距離盲腸末端1 cm處用手術(shù)縫線結(jié)扎，用針頭在結(jié)扎處穿過(guò)3次，腸管放回腹腔并逐層縫合切口。造模完成后，膿毒癥組尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml，膿毒癥+NC 組尾靜脈注射含20 μg NC mimic 的生理鹽水0.2 ml，膿毒癥+miR-21 組尾靜脈注射含20 μg miR-21 mimic 的生理鹽水0.2 ml。48 h 后處死大鼠，收集外周血及心肌組織。

1.2.2 miR-21 表達(dá)檢測(cè) 取心肌組織約10 mg，采用miR 提取分離試劑盒提取心肌中miR，采用miR cDNA 第一鏈合成試劑盒將miR 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miR 熒光定量檢測(cè)試劑盒配制PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μl、10 μmol/L 正反向引物各0.6 μl、反應(yīng)混合液10 μl、去離子水7.8 μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min，95℃5 s，60℃15 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），計(jì)算miR-21表達(dá)。

1.2.3 血清中cTnⅠ、CK-MB 含量檢測(cè) 外周血3 000 r/min 離心10 min，分離血清，采用試劑盒檢測(cè)cTnⅠ、CK-MB含量，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 心肌HE 染色 取4%多聚甲醛固定的心肌組織，石蠟包埋，制作石蠟切片，HE 染色試劑盒染色，按照試劑盒說(shuō)明書操作，染色完成后顯微鏡下觀察心肌病理改變。

1.2.5 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率 取心肌石蠟切片，采用一步法TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色，按照試劑盒說(shuō)明書操作，染色完成后顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.6 ELISA 檢測(cè)心肌中TNF-α、IL-1β 含量 取心肌組織約10 mg，加入RIPA 裂解液并充分勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，分離上清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β 含量，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白含量，計(jì)算每mg蛋白中TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7 心肌中CCL20、PDCD4 表達(dá)檢測(cè) 取心肌組織約10 mg，加入RIPA 裂解液并充分勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，分離上清，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白含量，將含有20 μg 蛋白的上清樣本與上樣緩沖液混合后加入聚丙烯酰胺凝膠，電泳，電轉(zhuǎn)移至NC 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜1 h，4℃孵育1∶1 000 稀釋的CCL20、PDCD4 抗體或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗過(guò)夜；第2天室溫孵育1∶2 000稀釋的HRP 二抗1 h，凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算CCL20、PDCD4表達(dá)。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證心肌H9c2 細(xì)胞中miR-21與CCL20、PDCD4靶向關(guān)系 H9c2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，接種于培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染NC組轉(zhuǎn)染NC mimic，miR-21組轉(zhuǎn)染miR-21 mimic，24 h 后Western blot 檢 測(cè)CCL20、PDCD4 表達(dá)；將野生型和突變型CCL20、PDCD4 雙熒光素酶報(bào)告基因與NC mimic 或miR-21 mimic共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，24 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲熒光值、海腎熒光值，螢火蟲熒光值/海腎熒光值比值作為雙熒光素酶報(bào)告基因熒光活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，四組間比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的資料進(jìn)一步采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尾靜脈注射miR-21 mimic 對(duì)膿毒癥大鼠心肌中miR-21表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中miR-21表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中miR-21 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中miR-21 表達(dá)明顯增加（P＜0.05，表1）。

表1 4組大鼠心肌中miR-21表達(dá)比較（，n=8）Tab.1 Comparison of miR-21 expression in myocardium of rats in four groups（，n=8）

表1 4組大鼠心肌中miR-21表達(dá)比較（，n=8）Tab.1 Comparison of miR-21 expression in myocardium of rats in four groups（，n=8）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.2 尾靜脈注射miR-21 mimic 對(duì)膿毒癥大鼠血清cTnⅠ、CK-MB 含量的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠血清cTnⅠ、CK-MB含量明顯增加（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠血清cTnⅠ、CK-MB 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠血清cTnⅠ、CK-MB含量明顯減少（P＜0.05，表2）。

表2 4組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB含量比較（，n=8）Tab.2 Comparison of serum cTnⅠand CK-MB contents in serum of rats in four groups（，n=8）

表2 4組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB含量比較（，n=8）Tab.2 Comparison of serum cTnⅠand CK-MB contents in serum of rats in four groups（，n=8）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.3 尾靜脈注射miR-21 mimic 對(duì)膿毒癥大鼠心肌HE 染色的影響 對(duì)照組大鼠心肌纖維排列整齊，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；膿毒癥組大鼠心肌纖維排列混亂，可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（箭頭所示）；膿毒癥+NC 組大鼠心肌纖維排列混亂及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)明顯改善；膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌纖維排列混亂及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯改善（圖1）。

圖1 4組大鼠心肌HE染色（×200）Fig.1 HE staining of myocardium of rats in four groups（×200）

2.4 尾靜脈注射miR-21 mimic 對(duì)膿毒癥大鼠心肌中細(xì)胞凋亡率的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中細(xì)胞凋亡率明顯提高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，圖2）。

圖2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（×400）Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate in myocardium of rats in four groups（×400）

2.5 尾靜脈注射miR-21 mimic 對(duì)膿毒癥大鼠心肌中炎癥因子含量的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β 含量明顯增加（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β 含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量明顯減少（P＜0.05，表3）。

表3 4組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量比較（，n=8，pg/mg）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β contents in myocar?dium of rats in four groups（，n=8，pg/mg）

表3 4組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量比較（，n=8，pg/mg）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β contents in myocar?dium of rats in four groups（，n=8，pg/mg）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.6 尾靜脈注射miR-21 mimic 對(duì)膿毒癥大鼠心肌中CCL20、PDCD4 表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中CCL20、PDCD4表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中CCL20、PDCD4 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中CCL20、PDCD4表達(dá)明顯減少（P＜0.05，圖3）。

圖3 4組大鼠心肌中CCL20、PDCD4表達(dá)比較Fig.3 Comparison of CCL20 and PDCD4 expressions in myocardium of rats in four groups

2.7 心肌H9c2 細(xì)胞中miR-21 與CCL20、PDCD4 靶向關(guān)系驗(yàn)證 TargetScan 生物信息學(xué)分析顯示，miR-21靶向CCL20基因mRNA 3'UTR第261～268堿基，靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 第242～249 堿基（圖4）。與NC組相比，miR-21組H9c2細(xì)胞中CCL20、PDCD4 表達(dá)明顯減少，含野生型CCL20、PDCD4 基因mRNA 3'UTR雙熒光素酶報(bào)告基因熒光活力明顯降低（P＜0.05），但含突變型CCL20、PDCD4 基因mRNA 3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因熒光活力無(wú)明顯變化（P＞0.05，圖5、表4）。

圖4 miR-21靶向CCL20、PDCD4的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of miR-21 targeting CCL20 and PDCD4

圖5 2組H9c2細(xì)胞中CCL20、PDCD4表達(dá)比較Fig.5 Comparison of CCL20 and PDCD4 expressions in H9c2 cells among four groups

表4 2 組H9c2 細(xì)胞中CCL20、PDCD4 雙熒光素酶報(bào)告基因熒光活力比較（，n=5）Tab.4 Comparison of fluorescence activity of CCL20 and PDCD4 double luciferase reporter genes in H9c2 cells between two groups（，n=5）

表4 2 組H9c2 細(xì)胞中CCL20、PDCD4 雙熒光素酶報(bào)告基因熒光活力比較（，n=5）Tab.4 Comparison of fluorescence activity of CCL20 and PDCD4 double luciferase reporter genes in H9c2 cells between two groups（，n=5）

3 討論

膿毒癥可導(dǎo)致多器官功能障礙，其中心臟是常見(jiàn)受累臟器，但膿毒癥患者發(fā)生心肌損傷或心功能障礙的機(jī)制尚未闡明。近年miRs 在心血管疾病中的診療價(jià)值備受關(guān)注，心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、病毒性心肌炎等疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均存在多種miRs 表達(dá)變化，miRs 異常表達(dá)不僅與病情及預(yù)后有關(guān)，還與心肌組織中細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程調(diào)控有關(guān)［8-10］。miR-21 是一類具有心血管保護(hù)作用的miR，心肌梗死、病毒性心肌炎患者外周血中miR-21 表達(dá)均明顯減少［10-12］；NA 等［3］研究表明，膿毒癥患者外周血中miR-21表達(dá)明顯減少且與患者臟器損傷、炎癥反應(yīng)激活、預(yù)后密切相關(guān)，提示miR-21低表達(dá)可能參與膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與膿毒癥病程中多臟器功能損傷有關(guān)。

為闡明miR-21 在膿毒癥導(dǎo)致心肌損傷中的作用，本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥大鼠模型，在心肌中檢測(cè)到miR-21 表達(dá)減少，在血清中檢測(cè)到cTnⅠ、CK-MB 含量增加，表明膿毒癥大鼠出現(xiàn)心肌損傷，結(jié)合miR-21 的心血管保護(hù)作用分析，膿毒癥大鼠心肌中miR-21 表達(dá)減少可能與心肌損傷有關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21 與膿毒癥大鼠心肌損傷的關(guān)系，本研究在膿毒癥造模后通過(guò)尾靜脈注射miR-21 mimic 的方式增加miR-21 表達(dá)，在心肌中檢測(cè)到miR-21表達(dá)明顯增加，在血清中檢測(cè)到cTnⅠ、CK-MB含量明顯減少，表明增加miR-21表達(dá)可減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，進(jìn)而驗(yàn)證miR-21低表達(dá)與膿毒癥大鼠心肌損傷有關(guān)。

膿毒癥發(fā)病過(guò)程中心肌損傷與局部組織中細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)激活有關(guān)，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)且炎癥因子TNF-α、IL-1β分泌增多［13-14］。本研究顯示，膿毒癥大鼠心肌中細(xì)胞凋亡率明顯增加，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，且TNF-α、IL-1β分泌增多，與既往血清中細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)激活與膿毒癥心肌損傷相關(guān)的研究結(jié)果相符。miR-21 在心血管系統(tǒng)中的保護(hù)作用與其抗凋亡、抗炎作用密切相關(guān)，本研究在膿毒癥造模后尾靜脈注射miR-21 mimic，過(guò)表達(dá)miR-21后觀察到心肌中細(xì)胞凋亡率、TNF-α、IL-1β 含量均降低，說(shuō)明增加miR-21表達(dá)能夠減輕膿毒癥大鼠心肌中細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，可能是miR-21在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

miR 發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是與靶基因mRNA 3'UTR 結(jié)合，抑制靶基因表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，近年也有多項(xiàng)關(guān)于miR-21發(fā)揮生物學(xué)作用的研究。范麗等［4］研究表明，miR-21 通過(guò)靶向PDCD4 減輕心肌缺血再灌注過(guò)程中的細(xì)胞凋亡；XIAO 等［15］研究表明，心臟祖細(xì)胞來(lái)源外泌體分泌miR-21并靶向PDCD4，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡；李陽(yáng)春等［5］分析miR-21 的抗炎作用結(jié)果顯示，miR-21 靶向CCL20 并減輕心肌細(xì)胞炎癥，抑制心肌細(xì)胞凋亡。PDCD4 和CCL20 分別是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的基因，本研究顯示，膿毒癥大鼠心肌中PDCD4、CCL20 表達(dá)明顯增加，而尾靜脈注射miR-21 mimic后，心肌中PDCD4、CCL20表達(dá)明顯減少，表明miR-21可能靶向抑制PDCD4、CCL20表達(dá)。說(shuō)明靶向PDCD4、CCL20 是miR-21 在膿毒癥的發(fā)病過(guò)程中減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡并發(fā)揮心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制之一，但同時(shí)體內(nèi)也可能存在其他信號(hào)通路介導(dǎo)miR-21的上述心肌保護(hù)作用。

為闡明miR-21 在心肌中靶向PDCD4、CCL20 的作用，本研究在心肌H9c2細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證。采用TargetScan 進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 中存在miR-21 結(jié)合位點(diǎn)；將PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 的雙熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞，miR-21 mimic 可使其熒光活力降低，但將雙熒光素酶報(bào)告基因中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miR-21 結(jié)合靶點(diǎn)進(jìn)行突變后，miR-21 mimic 不再影響其熒光活力，表明miR-21 靶向PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 且具體結(jié)合靶點(diǎn)與TargetScan 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)一致。miR-21 同時(shí)靶向PDCD4、CCL20基因mRNA 3'UTR，但具體靶向結(jié)合位點(diǎn)存在差異，miR-21 靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 的 第242～249 堿基以及CCL20 基因mRNA 3'UTR的第261～268堿基。

綜上，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-21 能夠抑制膿毒癥大鼠心肌中細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，分子機(jī)制可能為靶向抑制CCL2 及PDCD4表達(dá)，miR-21 有望成為膿毒癥致心肌損傷的診治靶點(diǎn)。