江 鈺 胡金霞 趙翠霞 劉 濤 胡婧靈

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院老年病科，烏魯木齊 830000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈管壁的一種長期的慢性炎癥性疾病［1］。AS 及其并發(fā)癥（冠心?。┟磕陮?dǎo)致的死亡人數(shù)高居不下，嚴(yán)重危害人類健康［2］。在AS 的發(fā)病過程中，免疫反應(yīng)發(fā)揮多重而復(fù)雜的作用，貫穿AS 的發(fā)生發(fā)展［3］。越來越多的證據(jù)顯示，AS 不但具有慢性炎癥的特征，其炎癥反應(yīng)的起始與持續(xù)都有先天性和獲得性免疫應(yīng)答的參與［4］。秦皮素（fraxetin，F(xiàn)RA）別名白蠟樹內(nèi)酯，是一種天然香豆素類化合物，具有多種藥理學(xué)作用，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等［5］。因此設(shè)想秦皮素可能參與調(diào)節(jié)AS過程中的炎癥免疫反應(yīng)，并具有抗AS 的作用。本研究將系統(tǒng)地探討秦皮素在體內(nèi)對AS 的抵抗作用，并綜合評價(jià)其對體內(nèi)AS 模型炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，為AS 的治療提供新的方法，為秦皮素的成藥發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 80 只雄性5 周齡C57BL/6 背景的ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量（13～15）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。將實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物房。飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，濕度為（60±5）%，光照/黑暗周期為12 h。2 周適應(yīng)環(huán)境，正常飲水飲食。

1.1.2 主要試劑 秦皮素（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminnobenzidine，DAB）顯色盒及免疫組化試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；Masson 染色試劑盒購自美國Sigma 公司；氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）試劑盒、TNF-α 試劑盒、IL-1β 試劑盒及IL-6試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；鼠抗巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞（Monocyte+Macrophage，MOMA-2）和lexa Fluor?594 標(biāo)記的驢抗鼠熒光二抗購自美國Abcam公司；兔抗CD40抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體、兔抗血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗體和山羊抗兔IgG二抗購自Cell Signaling Technology 公司；Trizol 試劑、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix EX TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 建立AS 模型：將ApoE-/-小鼠用高脂飼料（主要成分包括15%脂肪、1.25%膽固醇、0.2%膽酸鹽）飼養(yǎng)12周，小鼠在主動脈弓等大動脈處有不同程度的斑塊形成，視為造模成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為4 組：對照組、模型組（AS組）、秦皮素低劑量組（AS+FRA-L組）、秦皮素高劑量組（AS+FRA-H 組），每組20 只小鼠。對照組小鼠使用正常飼料飼養(yǎng)，AS組、AS+FRA-L組及AS+FRA-H 組小鼠使用高脂飼料飼養(yǎng)。給藥方式為灌胃，對照組：生理鹽水；AS組：生理鹽水；AS+FRA-L組：20 mg/kg的秦皮素；AS+FRA-H 組：50 mg/kg的秦皮素，1次/d，連續(xù)12周。

1.2.3 血脂水平測定 給藥結(jié)束后，將各組小鼠禁食12 h，用3%戊巴比妥麻醉小鼠，眼球取血1 ml，4℃高速離心機(jī)中以1 000 g 離心15 min 分離血清。利用德國羅氏日立MODULAR全自動生化分析儀測定總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）含量。

1.2.4 ELISA 檢測小鼠血清oxLDL、TNF-α、IL-β 及IL-6含量 收集各組小鼠血清進(jìn)行ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測血清中oxLDL、TNF-α、IL-β及IL-6含量。①加樣：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液50 μl，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，待測樣品孔加入不同組別的小鼠血清50 μl。37℃反應(yīng)60 min；②棄去孔中液體，每孔加入檢測A 工作液50 μl，37℃孵育60 min；③棄去孔內(nèi)液體，洗板3 次后甩干，每孔加入檢測B 工作液50 μl，37℃孵育60 min；④棄去孔內(nèi)液體，洗板3 次后甩干，每孔加入底物溶液45 μl，37℃避光顯色15 min；⑤依序每孔加入終止液45 μl，終止顯色；⑥用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測定各孔的光密度（OD 值）；⑦以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

1.2.5 HE染色檢測小鼠主動脈中斑塊形成情況①處死小鼠后，剪取長約l mm 的主動脈。用最佳切片溫度（optimum cutting temperature，OCT）包埋劑包埋，并制作成6 μm 厚的冰凍切片，將切片在蒸餾水中漂洗3 min；②將切片放入蘇木素染液中染色5 min，自來水清洗后，置于1%的鹽酸乙醇中分化數(shù)秒，流水沖洗；③0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗；④將切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗；⑤梯度乙醇（70%、80%、90%、100%）脫水，各5 min；⑥將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5 min；⑦將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠，使用蓋玻片封片；⑧待中性樹脂完全凝固后，使用萊卡顯微鏡拍攝照片。

1.2.6 油紅O染色檢測AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積變化①取各組小鼠主動脈冰凍切片復(fù)溫1 h，于37℃烘箱中烤片30 min，防止脫片；②將切片放置在60%異丙醇中浸泡1 min，PBS 清洗3 次，3 min/次；③將切片置于油紅溶液中染色30 min，37℃溫浴，PBS清洗2 次，3 min/次；④使用蘇木素染色30～60 s，1%鹽酸乙醇分化，1%氨水返藍(lán)，PBS 清洗3 次，3 min/次；⑤濾紙吸干殘余水分，甘油明膠封片；⑥使用萊卡顯微鏡拍攝照片。

1.2.7 Masson 染色觀察主動脈中膠原蛋白含量①取各組小鼠主動脈冰凍切片，復(fù)溫1 h，在37℃烘箱中烤片30 min，防止脫片；②PBS清洗3次，3 min/次，于組織上滴加50 μl Bouin's 2000TM溶液，于60℃烤箱中烤片1～1.5 h；③純凈水沖洗切片至組織無色；④將切片置于蘇木素中染色5 min。純凈水清洗切片2 min；⑤在組織上滴加1 滴猩紅-酸品紅染色液，染色10 min，純凈水清洗切片2 min；⑥在組織上滴加1 滴磷鉬酸染液染色12 min，用濾紙洗去多余染液；⑦在組織上滴加1 滴苯胺藍(lán)染色8 min 后，純凈水清洗切片2 min；⑧在組織上滴加1 滴1%的醋酸孵育4 min；⑨分別用70%、80%、90%、100%的乙醇浸泡切片脫水后，二甲苯浸泡2次，2 min/次，中性樹膠封片；⑩顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8 免疫熒光檢測小鼠AS 斑塊中巨噬細(xì)胞MOMA-2 表達(dá) ①取各組小鼠主動脈冰凍切片，復(fù)溫1 h，37℃烤箱中烤片30 min，防止脫片；②PBS 清洗3次，2 min/次，用20%血清室溫封閉30 min；③棄去血清，使用濾紙吸去殘余血清，按適當(dāng)比例稀釋MOMA-2 抗體后取30 μl 滴加在組織上，4℃孵育過夜；④PBS 潤洗3 次后，向組織上滴加lexa Fluor?594標(biāo)記的熒光二抗，避光室溫孵育1 h；⑤PBS潤洗3次后，在組織上滴加適量4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染細(xì)胞核，避光孵育10 min；⑥棄掉DAPI 染液，PBS 潤洗3 次，用濾紙擦去多余水分，滴加抗猝滅劑封片；⑦使用熒光顯微鏡在594 nm 激發(fā)光下觀察并拍攝照片，紅色為MOMA-2。

1.2.9 免疫組化檢測小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白表達(dá) ①取各組小鼠主動脈冰凍切片，復(fù)溫1 h，在37℃烘箱中烤片30 min，防止脫片；②用PBS 清洗3 次，3 min/次；③將切片放入新鮮配制的3%H2O2溶液中8 min，使內(nèi)源性過氧化物滅活，PBS清洗切片3 min×3次；④滴加正常10%山羊血清封閉液，室溫孵育20 min 后，用濾紙吸取多余液體；⑤滴加適量稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗3次，3 min/次；⑥滴加相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h 后，PBS清洗3次，3 min/次；⑦取DAB顯色試劑盒中的A，B，C試劑各1 滴于切片，室溫顯色后，于顯微鏡下觀察，顯色理想后將切片置于純凈水中終止顯色；⑧蘇木素輕度復(fù)染胞核60 s，流水沖洗60 s，1%鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗2 min；⑨梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；⑩使用萊卡顯微鏡觀察并采集圖像，目標(biāo)蛋白呈棕黃色。

1.2.10 qRT-PCR檢測小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 的mRNA 表達(dá) 取各組小鼠的主動脈組織，加入Trizol 溶液后，于組織勻漿機(jī)中打碎。轉(zhuǎn)移至EP 管中，靜置20 min。每管加入0.2 ml 氯仿，振蕩15 s，室溫靜置5 min。4℃、16 113 g 離心20 min。取上清并加入等體積的異丙醇，混合均勻，靜置10 min。4℃、16 113 g 離心20 min，加入適量75%乙醇收集下層沉淀。使用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和含量，并將每個(gè)配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度，然后按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。從GenBank 中查出小鼠CD40、MMP-9、VCAM-1和β-actin的mRNA序列，使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)專一性引物。使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用FTC-3000p實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正態(tài)分布數(shù)據(jù)資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比較 如圖1 所示，與對照組相比，AS 組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量顯著升高（均P＜0.001），HDL-C 含量顯著降低（P＜0.001）；與AS組相比，AS+FRA-L組和AS+FRA-H組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量降低（均P＜0.05），HDL-C 含量升高（P＜0.05），且AS+FRA-H組作用更明顯。

圖1 各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平分析Fig.1 Analysis of TC，TG，LDL-C and HDL-C levels in serum of mice in each group

2.2 各組小鼠血清中oxLDL、TNF-α、IL-1β 和IL-6含量分析 如圖2 所示，與對照組相比，AS 組小鼠血清中oxLDL、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著升高（均P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L 組和AS+FRA-H 組小鼠血清中oxLDL、TNF-α、IL-1β 和IL-6含量降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖2 ELISA 檢測各組小鼠血清中oxLDL、TNF-α、IL-1β和IL-6含量變化Fig.2 ELISA was used to detect changes of oxLDL，TNF-α，IL-1β and IL-6 in serum of mice in each group

2.3 各組小鼠主動脈根部斑塊形成變化 如圖3所示，與對照組相比，AS 組小鼠主動脈根部顯示出明顯的AS 斑塊形成（P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L 組和AS+FRA-H 組小鼠主動脈根部AS 斑塊面積明顯減小（均P＜0.01），且AS+FRA-H 組小鼠主動脈根部AS斑塊減少更明顯。

圖3 HE 染色檢測各組小鼠主動脈根部斑塊面積變化（×200）Fig.3 HE staining was used to detect changes of aortic root plaque area of mice in each group（×200）

2.4 各組小鼠主動脈脂質(zhì)沉積變化 如圖4所示，與對照組相比，AS組小鼠主動脈上有大量紅色脂質(zhì)沉積（P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L 組和AS+FRA-H 組小鼠主動脈上的脂質(zhì)沉積較少（均P＜0.05），其中AS+FRA-H組減少最為明顯。

圖4 油紅O 染色檢測各組小鼠主動脈上脂質(zhì)沉積變化（×100）Fig.4 Changes of lipid deposition on aorta of mice in each group were detected by oil red O staining（×100）

2.5 各組小鼠主動脈中膠原蛋白含量變化 如圖5所示，對照組小鼠主動脈壁表現(xiàn)出大量的膠原蛋白和平滑肌纖維，而AS 組小鼠的AS 斑塊包含薄薄的纖維帽層和少量基質(zhì)纖維（P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L 組和AS+FRA-H 組小鼠主動脈壁表現(xiàn)出更多的膠原蛋白纖維（均P＜0.05），且AS+FRA-H組小鼠的主動脈中膠原纖維更為豐富。

圖5 Masson 染色檢測小鼠主動脈中膠原蛋白含量變化（×200）Fig.5 Changes of collagen content in mice aorta detected by Masson staining（×200）

2.6 各組小鼠AS斑塊中巨噬細(xì)胞MOMA-2的表達(dá)變化 如圖6 所示，對照組小鼠中可見極少的巨噬細(xì)胞MOMA-2 表達(dá)，而AS 組小鼠的AS 斑塊中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞MOMA-2 表達(dá)（P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L組和AS+FRA-H組小鼠AS斑塊中巨噬細(xì)胞MOMA-2 表達(dá)減少（均P＜0.05），且AS+FRA-H組小鼠AS斑塊中巨噬細(xì)胞MOMA-2表達(dá)更少。

圖6 免疫熒光檢測各組小鼠巨噬細(xì)胞MOMA-2 的表達(dá)情況（×200）Fig.6 Expression of MOMA-2 in macrophages of mice in each group was detected by immunofluorescence（×200）

2.7 各組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白表達(dá)情況 如圖7 所示，對照組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白表達(dá)甚少，AS 組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L 組和AS+FRA-H組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），其中AS+FRA-H組減少最為明顯。

圖7 免疫組化檢測各組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1蛋白表達(dá)情況Fig.7 Immunohistochemistry was used to detect expres?sions of CD40，MMP-9 and VCAM-1 in aorta of mice in each group

2.8 各組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 mRNA表達(dá)情況 如圖8所示，與對照組相比，AS組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）；與AS 組相比，AS+FRA-L 組和AS+FRA-H 組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），其中AS+FRA-H組下調(diào)最為明顯。

圖8 qRT-PCR 檢測各組小鼠主動脈中CD40、MMP-9、VCAM-1表達(dá)情況Fig.8 Expressions of CD40，MMP-9 and VCAM-1 in aorta of mice in each group was detected by qRT-PCR

3 討論

AS是心血管和腦血管病的潛在病理基礎(chǔ)，炎癥和脂質(zhì)代謝在其發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［6］。AS的病理過程進(jìn)展緩慢，主要在冠脈管腔嚴(yán)重狹窄和急性血栓形成嚴(yán)重阻斷血流時(shí)表現(xiàn)出臨床癥狀，阻斷流向心臟的血流將發(fā)生冠狀動脈性心臟病，阻斷流向腦部的血流將導(dǎo)致缺血性腦卒中，肢體末端的血流量減少會導(dǎo)致外周血管疾病。AS 在老年人中很普遍，且其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加。AS的實(shí)質(zhì)是內(nèi)皮功能紊亂后血管免疫穩(wěn)態(tài)失衡，其中LDL-C過高、HDL-C 過低及炎癥反應(yīng)對AS 的影響最為引人關(guān)注［7-10］。

在AS形成初期，主動脈內(nèi)膜下的巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞大量吞噬低密度脂蛋白，細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積，從而形成泡沫細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，AS 組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量顯著升高，HDL-C 含量顯著降低，其主動脈根部顯示出明顯的AS 斑塊形成，且主動脈上具有大量紅色脂質(zhì)沉積，主動脈壁的膠原蛋白和平滑肌纖維明顯減少；秦皮素能降低AS 小鼠血清中TC、TG、LDL-C 的表達(dá)水平，提高HDL-C 表達(dá)水平，減少主動脈根部AS 斑塊形成，且主動脈上紅色脂質(zhì)沉積減少，主動脈壁上的膠原蛋增加。因此，秦皮素可能對血脂水平有調(diào)節(jié)作用，減輕斑塊形成和脂質(zhì)沉積，從而減輕AS的形成。

AS的特征是脂質(zhì)在動脈血管墻內(nèi)沉積，引起各種免疫細(xì)胞、血管固有細(xì)胞（如：巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞）、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的活化、遷移和增殖，產(chǎn)生一系列免疫炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥細(xì)胞因子［11］。CD40 與其配體（CD40L）分別屬于TNF和TNF 超家族成員，是一對互補(bǔ)跨膜糖蛋白［12］。CD40/CD40L 是免疫系統(tǒng)細(xì)胞間信息傳遞的主要介質(zhì)［13］。研究表明CD40 信號系統(tǒng)參與了氧化修飾oxLDL引起的免疫應(yīng)答過程［14］。oxLDL 可促進(jìn)CD40/CD40L 的激活與表達(dá)，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等表達(dá)產(chǎn)生黏附分子如VCAM-1、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等，誘使免疫成分細(xì)胞黏附到血管壁［15-16］。CD40/CD40L 信號系統(tǒng)還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、T 細(xì)胞表達(dá)和釋放炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-β、IL-6 等）及單核細(xì)胞炎蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等，吸引和支配T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞到AS 斑塊內(nèi)，維持慢性炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)AS 斑塊的發(fā)展［17］。CD40/CD40L 相互作用還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)和釋放MMP 和組織因子，促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定、破裂及局部血栓形成［18］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AS 組小鼠血清中oxLDL、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高，且AS 斑塊中巨噬細(xì)胞MOMA-2 的表達(dá)明顯上調(diào)，CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白和mRNA 表達(dá)也上調(diào)；秦皮素能降低oxLDL 及炎癥因子表達(dá)，使AS 斑塊中巨噬細(xì)胞MOMA-2 的表達(dá)下調(diào)，CD40、MMP-9、VCAM-1 蛋白和mRNA 表達(dá)也下調(diào)。因此，秦皮素可能對炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，對AS 有抵抗作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明秦皮素可有效改善AS，其可能與調(diào)控脂質(zhì)物質(zhì)的釋放，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)有關(guān)，為中藥現(xiàn)代化研究起促進(jìn)作用，為AS的治療提供新的方案。