汪 景 位佳琳 何 蕊 趙東凱 初洪波 位 鴻（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是持續(xù)性的呼吸系統(tǒng)癥狀和不完全可逆性氣流受限，中醫(yī)屬“肺脹”范疇。臨床表現(xiàn)以“脹、喘、咳、痰”等癥為主，隨病情發(fā)展癥狀逐漸加重，嚴(yán)重影響患者運動能力和生存質(zhì)量。COPD 的發(fā)病機制尚未完全明了，目前研究表明，氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥反應(yīng)、肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡以及自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等參與COPD的發(fā)生［1-3］。

我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療COPD 的過程中取得了不錯的效果，特別是在緩解臨床癥狀、改善預(yù)后等方面尤為突出［4］。吉林省名中醫(yī)王檀教授的臨床經(jīng)驗方“溫肺消脹”可明顯改善COPD的癥狀，延緩COPD的進展［5］。在中醫(yī)治療疾病的過程中，藥物之間不同的配伍可以起到不同的治療作用［6］，藥對是最簡單的配伍，只含兩味藥。“附子-熟地黃”為溫肺消脹方中的君藥，組方原則源于陰陽學(xué)說，以附子、熟地黃陰陽同補，以陽化陰，以陰涵陽，溫腎以助元陽，滋陰以填腎精。而在肺脹病中，以肺腎關(guān)系為要，“附子-熟地黃”以補腎精而達到緩解治療肺脹的目的。

中藥對“附子-熟地黃”中的確切活性成分及其治療COPD 的機制尚不清楚。本研究旨在分析FZSD 治療COPD 的有效成分及初步探索可能的作用機制，為治療COPD提供更多的臨床理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 附子（Aconitum carmichaeli Debx.）、熟地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)肖井雷教授鑒定均符合規(guī)定；乙腈為色譜純（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；水為超純水（實驗室自制）；高效液相質(zhì)譜-飛行質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，美國）；人肺泡上皮細胞A549細胞（中國科學(xué)院上海細胞生物研究所細胞庫，中國）；胎牛血清（Clark，美國）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；青鏈霉素雙抗（定州百克賽斯生物科技有限公司，中國）；CCK-8 工作液（大連美侖生物技術(shù)有限公司，中國）；脂多糖（上海懋康生物科技有限公司，中國）；TNF-α、IL-17 ELISA 試劑盒（人源）（黃石研科，中國）；抗體AKT1、MAPK8、羊抗兔IgG（索萊寶，英國）；CO2培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；TC20細胞計數(shù)儀（Bio-Rad，美國）；可視相差倒置顯微鏡（奧林普斯，日本）。

1.2 方法

1.2.1 活性成分及作用靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫將附子、熟地黃所有的化學(xué)成分和藥物靶點進行篩選，類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為條件篩選出其主要活性成分及藥物靶點。以“chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞，從Gene cards 數(shù)據(jù)庫查找COPD 的疾病靶點，并以相關(guān)性得分（relevance score≥10）作為條件篩選出疾病靶點。

1.2.2 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）的構(gòu)建 將藥物與COPD 的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白之間的結(jié)合度數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2實現(xiàn)可視化。

1.2.3 基因本體（GO）功能、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析 使用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對藥物治療COPD的靶點進行GO、KEGG分析，借助R語言對兩者結(jié)果進行可視化處理。

1.2.4 “疾病-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建疾病-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，以說明FZSD通過多通路、多靶點來發(fā)揮治療COPD的作用機制。

1.2.5 供試品的制備 根據(jù)吉林省名中醫(yī)王檀教授的院內(nèi)制劑“溫肺消脹方”的臨床用法用量，稱取附子10 g、熟地黃20 g，先以蒸餾水浸泡30 min，加入10 倍量的水，先以武火煮沸后再以文火煎煮1 h，煎煮兩次，將兩次的煎煮液合并過濾得水煎液，冷凍干燥，得凍干粉。精密量取凍干粉0.2 g，加入50%甲醇8 ml，至10 ml 容量瓶中超聲30 min 后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm 濾膜，得供試品溶液。

1.2.6 色譜及質(zhì)譜條件 檢測色譜條件：色譜柱（OOD-4475-ANC18，2.1×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），如表1進行梯度洗脫；流速0.3 ml/min；進樣量5 μl，柱溫室溫。

表1 液相梯度Tab.1 UPLC gradient elution

質(zhì)譜條件：使用Agilent 6540 Q-TOF LC/MS系統(tǒng)（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，United States）進行質(zhì)譜分析，ESI源，掃描方式ESI+模式。界面的操作條件如下：正/負電離模式；噴霧電壓3.8 kV；干燥氣體流速10.0 L/min；氣體溫度350℃；流速0.3 ml/min；全掃描范圍為50～1 000 m/z。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出活性成分的基礎(chǔ)上，建立FZSD 篩選出的化合物的分子離子數(shù)據(jù)庫［7］，在分析供試品數(shù)據(jù)的時候，利用建立的數(shù)據(jù)庫進行靶向提取，在相對誤差＜10 ppm 的條件下，確認目標(biāo)化合物。

1.2.7 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出存有A549 細胞的凍存管，于37℃恒溫水浴中輕輕搖動2～3 min使其迅速融化，在紫外消毒的超凈臺內(nèi)操作，將細胞懸液加入完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基）中；1 000 r/min 離心5 min 后棄除上清，再用5 ml DMEM 完全培養(yǎng)基懸浮細胞，加入培養(yǎng)皿中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日進行常規(guī)換液，觀察細胞生長狀態(tài)，細胞生長密度至70%～80%使用胰酶消化傳代培養(yǎng)擴增。

1.2.8 CCK-8 法檢測細胞增殖活力 在96 孔板內(nèi)鋪A549 細胞懸液8 000 個/孔，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，給予不同濃度的FZSD 對其干預(yù)，觀察細胞增殖狀態(tài)。將細胞分成3組，對照組：完全培養(yǎng)基+細胞；空白組：完全培養(yǎng)基；FZ-SD 組：FZ-SD（31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/ml）干預(yù)24 h。3組處理后，每孔加入CCK-8工作液10 μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在波長450 nm 下檢測各孔吸光度（OD）值，計算各組細胞存活率。

1.2.9 ELISA 法檢測A549 細胞中TNF-α 和IL-17的表達 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-17的水平。A549細胞在6孔板中孵育，用FZSD預(yù)孵育24 h，分別用LPS（50 μg/ml）刺激24 h后，收集培養(yǎng)上清液。3 000 r/min 離心20 min，收集上清液檢測蛋白水平并進行分析。

1.2.10 蛋白免疫印跡法檢測A549 細胞中MAPK8和AKT1 蛋白表達 收集A549 細胞樣品，并將細胞裂解液加入到A549 細胞中，4℃超聲裂解5 次，12 000 r/min離心10 min取上清；按照BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，經(jīng)凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，按照說明書配制相應(yīng)濃度的一抗稀釋液，4℃搖床過夜；再用TBST 溶液清洗5 次，5 min/次，加入終濃度1∶5 000 的二抗稀釋液，室溫搖晃1 h，再用TBST 溶液清洗5 次，5 min/次；最后使用凝膠成像系統(tǒng)進行發(fā)光顯色，拍照記錄條帶。

2 結(jié)果

2.1 COPD 靶點分析結(jié)果 通過對TCMSP 數(shù)據(jù)庫的檢索可得到：附子的所有成分65 種，主要為生物堿類成分，相關(guān)的藥物靶點139個；熟地黃的所有成分76種，主要成分為環(huán)烯醚萜、單萜類及其苷類，相關(guān)的藥物靶點327 個。通過對Gene Cards 數(shù)據(jù)庫的檢索可得到COPD 的相關(guān)靶點有6 843 個，以Rele?vance score≥10 為篩選條件，得到COPD 相關(guān)靶點3 868個。將藥物成分靶點和疾病的靶點做韋恩圖，得到兩者的交集靶點81個，如圖1A所示。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶標(biāo)的篩選 將81 個交集靶點導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫，進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)置信度＞0.9，初步篩選出關(guān)鍵蛋白后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，使用Network 中的Analyzer 插件對網(wǎng)絡(luò)圖的拓撲性質(zhì)進行分析，其中節(jié)點的面積越大，顏色越深，表示degree 值越大，與其相關(guān)的靶點蛋白越多，結(jié)果如圖1B 所示，MAPK8、NCOA1、AKT1、NR3C1、NCOA2、PPARG、FOS、IL-6、ESR1蛋白degree值較大。

圖1 FZSD治療COPD的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析圖Fig.1 Analysis of network pharmacology results of FZSD in treatment of COPD

2.3 GO、KEGG 分析 通過GO 數(shù)據(jù)庫分析，如圖2A 所示，對FZSD 水煎液中的49 個核心靶標(biāo)進行GO 富集分析，篩選P＜0.05 的數(shù)據(jù)，并選出前20 條結(jié)果做以下分析，圖中數(shù)量值的大小表示在該生物功能中富集的靶蛋白數(shù)量，數(shù)量值越大則說明富集的靶標(biāo)數(shù)越多，P值越小代表相關(guān)性越強。GO 富集分析結(jié)果表明，核心靶標(biāo)主要涉及炎癥、細胞凋亡、癌癥等。核心靶標(biāo)主要參與蛋白酶活性、酶結(jié)合和蛋白結(jié)合等途徑。其中相關(guān)性較強的為G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腎上腺素受體活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等生物功能。

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫分析，如圖2B 所示，對FZSD 水煎液中的49 個核心靶標(biāo)進行KEGG 通路富集分析，篩選P＜0.05 的數(shù)據(jù)，并選出前20 條結(jié)果做以下分析，圖中數(shù)量值的大小表示在該條通路富集的靶標(biāo)數(shù)，數(shù)量值越大則說明富集的靶標(biāo)數(shù)越多；P值表示該通路與COPD 的相關(guān)強弱，值越小代表相關(guān)性越強。KEGG 通路富集分析表明，與這些靶標(biāo)關(guān)聯(lián)最為密切的有脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、Toll 樣受體信號通路、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、小細胞肺癌、IL-17 信號通路、細胞凋亡、NF-κB 信號通路、環(huán)腺苷酸信號途徑、雌激素信號通路等。

2.4 “疾病-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖分析 篩選得到化學(xué)成分、靶點及其相應(yīng)信號通路，具體如圖3所示。將編輯好的化合物、靶點、信號通路Network及相對應(yīng)的Type 導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)通路圖。從內(nèi)到外分別為最內(nèi)層菱形為慢性阻塞性肺疾病，第二層三角形為通路，第三層三角形為化學(xué)成分，最外層三角形為靶點。由圖可直觀看出，連接10 個以上交集靶點的成分為Benzoylmesaconine、Salsolinol、Acetylcatalpol、Sitogluside、Succinic acid、Lauric acid、TMPEA、Sucrose、Stigmasterol，Deltoin 連接7 個交集靶點Arachic acid 連接8 個交集靶點，其余成分連接2 個及以上交集靶點，這些成分可能是FZSD 治療COPD 的活性成分。MAPK8、PTGS1、PTGS2、NCOA2、AKT1、IL-6 連接的活性成分較多，且和通路密切相關(guān)，可能為治療COPD的核心靶點。

2.5 FZSD化學(xué)成分結(jié)果分析 為了進一步確認基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測FZSD 水煎液中對COPD 有治療作用的活性成分，采用LC-MS 對FZSD 水煎液中的化學(xué)成分進行驗證。結(jié)果如圖3、表2所示。正譜負譜的總離子流圖以及確認的化合物棒狀圖和化合物結(jié)構(gòu)式，見附圖1、附圖2（http：//www.immune99.com）。表2為正譜以及負譜數(shù)據(jù)庫中鑒定出來的化學(xué)成分，其中包括其出峰時間、化學(xué)名稱、分子式、相對分子量以及加合物的相對分子質(zhì)量。通過與化學(xué)數(shù)據(jù)庫的比對，共鑒別出15 種化學(xué)成分，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中預(yù)測的相關(guān)成分有8 種，附子中的成分有：（R）-Norcoclaurine、Benzoylmesaconine、Glutin?oside、Deltoin；熟地黃中的成分有：Sitosterol、Pen?tadecylic acid、Acetylcatalpol、Arachic acid。

表2 FZSD水煎液質(zhì)譜化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定結(jié)果Tab.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS identification results of chemical components of FZSD decoction mass spectrometry

圖3 “疾病-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 "Disease-component-target-pathway"network diagram

2.6 FZSD的細胞毒性 為了選擇合適的濃度用于后續(xù)實驗，本研究采用CCK-8 法檢測FZSD 對A549細胞的毒性。用含有不同濃度的FZSD 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞，24 h后用CCK8檢測細胞活力，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)用31.25、62.5、125 μg/ml的FZSD處理細胞時，促進細胞增殖；當(dāng)用125、250、500 μg/ml的FZSD處理細胞時，細胞活力沒有顯著變化；1 000 μg/ml時有顯著毒性，因此，選擇了31.25、62.5和125 μg/ml進行后續(xù)實驗。

圖4 不同濃度FZSD對細胞活力值的影響Fig.4 Effect of FZSD decoction of different concentrations on cell viability

2.7 FZSD 抑制促炎細胞因子的表達 根據(jù)結(jié)果2.3 可知，F(xiàn)ZSD 與TNF-α 信號通路和IL-17 信號通路有關(guān)，故采用ELISA 法測定細胞炎癥因子證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測，即FZSD 通過抑制炎癥因子釋放來達到治療COPD 的目的。結(jié)果如圖5 所示，在A549 細胞中，模型組與空白組相比，A549 細胞在LPS 的刺激下，能顯著增加TNF-α 和IL-17 的表達。藥物組與模型組相比，隨著FZSD 在LPS 誘導(dǎo)的A549 細胞中孵育，培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-17 的蛋白表達呈顯著降低，鑒于以上研究結(jié)果，表明FZSD可以有效下調(diào)TNF-α和IL-17的水平。

圖5 FZSD對IL-17、TNF-α表達水平的影響Fig.5 Effects of FZSD on expression levels of IL-17 and TNF-α

2.8 FZSD 對MAPK8、AKT1 蛋白表達的影響 根據(jù)結(jié)果2.4 可知，MAPK8、AKT1 連接的活性成分較多，且和通路密切相關(guān)，可能為治療COPD 的核心靶點。采用Western blot 法檢測A549 細胞中MAPK8、AKT1 蛋白的變化，與對照組相比，模型組細胞MAPK8、AKT1蛋白表達明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，F(xiàn)ZSD低中高劑量組（31.25 μg/ml、62.5 μg/ml、125 μg/ml）細胞中AKT1蛋白表達有下降趨勢，MAPK8 蛋白表達呈劑量依賴性下降（P＜0.05），見圖6。

圖6 FZSD對MAPK8、AKT1表達水平的影響Fig.6 Effects of FZSD on expression levels of MAPK8，AKT1

3 討論

COPD 是呼吸內(nèi)科常見病之一，具有較高的患病率及致死率，患者通常伴有不完全可逆性氣流受限的現(xiàn)象，并且此現(xiàn)象呈進行性進展，其實質(zhì)是發(fā)生在氣道、肺血管和肺泡的一種慢性炎癥。臨床應(yīng)用表明，溫肺消脹方可以有效緩解COPD 患者“脹、喘、咳、痰”的癥狀，從而達到緩解COPD 的發(fā)展進程。附子和熟地黃這兩味藥在溫肺消脹方中，其組方原則為“行溫補肺腎，逐飲化瘀之效”。雖有臨床使用可證明FZSD 可治療COPD，但其潛在的作用機制尚不明確，因此研究探索FZSD 治療COPD 的潛在作用機制。

本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來預(yù)測FZSD 治療COPD的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制［8］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中共篩選出45種活性成分和81種藥物與疾病的交集靶標(biāo)蛋白，其中附子的生物堿類成分（R）-Norcoclaurine、Benzoylmesaconine、熟地黃的Sitosterol 和環(huán)烯醚萜類成分Acetylcatalpol 連接最多的靶點蛋白為MAPK8、PTGS1、PTGS2、NCOA2、AKT1、IL-6，因此預(yù)測這些化合物為FZSD 治療COPD 的主要成分，這些靶點為治療COPD 的核心靶點。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲進行分析，其中與COPD 疾病相關(guān)性顯著的靶點蛋白是MAPK8、NCOA1、AKT1、NR3C1、NCOA2、PPARG、FOS、IL-6、ESR1等。HOU 等［9］通過體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，MAPK8 信號通路是COPD 的潛在治療靶點。有研究表明，AKT1 和IL-6 等蛋白靶點可通過參與PI3K-Akt 信號通路和MAPK 信號通路，預(yù)防COPD的病程進一步發(fā)展［10］。DASTAN 等［11］臨床試驗在對急性加重COPD 患者的常規(guī)治療過程中，通過抑制IL-6、TNF-α 蛋白的表達使全身炎癥得到顯著緩解。由此可推測，F(xiàn)ZSD 中的有效成分可能通過MAPK8、AKT1、TNF-α 等靶點蛋白參與相關(guān)的信號通路來發(fā)揮治療COPD的作用。

在GO 和KEGG 信號通路分析中，F(xiàn)ZSD 治療COPD 密切相關(guān)的有TNF-α、IL-17、Toll 樣受體和NF-κB 信號通路等。有文獻報道，在外界環(huán)境的刺激下，氣道上皮細胞和肺泡巨噬細胞會釋放TNF-α、白細胞介素等多種炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而引起COPD 的發(fā)生［12-13］。TNF-α 相關(guān)的病理機制在COPD 的病理中起著關(guān)鍵作用，其通過加劇炎癥細胞的募集、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及氣道氧化來放大氣道炎癥［14-16］。由以上文獻可知，抑制TNF-α 蛋白表達是治療COPD 的重要途徑。MAMMEN 等［17］發(fā)現(xiàn)IL-17 調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白基因表達，導(dǎo)致COPD 中黏液高分泌和持續(xù)氣道炎癥。并且有研究表明，在肺上皮細胞系A(chǔ)549中，抑制IL-17蛋白表達水平，可導(dǎo)致氣道上皮中黏蛋白表達增加，從而起到抑制COPD 炎癥反應(yīng)的作用［18-20］。由此可預(yù)測，F(xiàn)ZSD 治療COPD可能通過調(diào)控TNF-α和IL-17信號通路。

由上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法中的推測可得知，F(xiàn)ZSD復(fù)方中的關(guān)鍵成分可通過調(diào)控MAPK8、AKT1、TNF-α等靶點蛋白調(diào)控TNF-α、IL-17 信號通路來發(fā)揮治療COPD 的作用。質(zhì)譜分析結(jié)果與上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中預(yù)測一致，確定FZSD起治療作用的關(guān)鍵成分有8個（如表2 所示），它們分別是（R）-Norcoclaurine、Benzoylmesaconine、Sitosterol、Pentadecylic acid、Arachic acid、Acetylcatalpol、Glutinoside、Deltoin（如圖3所示）。相關(guān)研究表明，（R）-Norcoclaurine 可通過抑制AKT1 蛋白的表達來發(fā)揮抗炎等作用，而AKT1 蛋白的分泌正是導(dǎo)致COPD 進一步惡化的關(guān)鍵 原因［21-24］。Benzoylmesaconine 是附 子中 的生 物堿，它可通過其抗炎活性對LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷表現(xiàn)出有效的保護作用［25-26］。Sitosterol 可用于治療肺組織的病理變化和預(yù)防氣道炎癥，顯著抑制炎癥反應(yīng)［27］。研究表明，Acetylcatalpol 具有抗炎、抗氧化等作用，可明顯降低TNF-α 蛋白表達［28-29］。由以上文獻可進一步說明，F(xiàn)ZSD 對COPD 發(fā)揮主要作用的化學(xué)成分可通過調(diào)控相關(guān)的靶點蛋白和信號通路來達到治療目的。

為了進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的推測，本文采用了體外細胞實驗研究。ELISA 和Western blot 實驗結(jié)果表明FZSD 能夠下調(diào)TNF-α、IL-17、MAPK8、AKT1 蛋白的表達水平來調(diào)控TNF-α、IL-17 信號通路，抑制COPD 炎癥細胞的增殖、生長、分化，促進炎癥細胞凋亡，從而起到抑制COPD 進一步發(fā)展的作用［30-32］。研究表明，MAPK8 蛋白的激活會誘導(dǎo)肺自噬，促進肺細胞凋亡和COPD 的發(fā)生［33］。因 此MAPK8 蛋白表達的降低可以抑制COPD 的進一步發(fā)展，達到緩解和治療的作用。體外細胞實驗證實FZSD 對COPD 有治療作用這一預(yù)測，闡明了FZSD起作用的關(guān)鍵成分通過下調(diào)TNF-α、IL-17、MAPK8、AKT1 蛋白的表達調(diào)控TNF-α、IL-17 信號通路這一作用機制。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對FZSD 治療COPD 的作用靶點及作用機制進行預(yù)測。運用UPLC-Q-TOF-MS/MS 發(fā)現(xiàn)FZSD 水煎液中的8 種活性成分，并與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中的成分相對應(yīng)。通過體外細胞實驗驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中的作用機制，說明FZSD 能通過抑制TNF-α、IL-17、MAPK8、AKT1 蛋白的表達水平減輕COPD 的損傷。本研究只進行了基礎(chǔ)的體外細胞實驗驗證，存在一定的局限性，在后續(xù)的實驗過程中會進一步進行體內(nèi)動物實驗和臨床驗證。本文的內(nèi)容為進一步深入研究FZSD 治療COPD 的機制提供了思路，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。