史玉柱 王林林 李玉環(huán) 黃 華*

1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050

乙肝病毒(HBV)屬噬肝DNA病毒科，具有雙鏈環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)和明顯的噬肝性，乙肝病毒侵入機體后，在肝細胞內(nèi)復(fù)制繁殖，引起細胞免疫及體液免疫應(yīng)答，并激發(fā)自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，使病變的肝細胞產(chǎn)生或釋放大量正?；虍惓５牡鞍踪|(zhì)，進一步導(dǎo)致免疫損害加重，使病情不斷發(fā)展。HBV感染呈世界性流行，同時，它又是最容易變異的病毒之一，可通過基因突變來抵抗藥物的效力。目前臨床上常用的抗HBV藥物均無法徹底清除HBV慢性感染，如干擾素、拉米夫定、齊多夫定等，這些抗病毒藥還存在副作用多、停藥復(fù)發(fā)率高、易產(chǎn)生耐藥等種種問題[1-4]。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)一種能夠真正清除乙肝病毒，徹底治愈乙型肝炎的藥物，因此,HBV感染也被認為是最難治愈的病毒性疾病之一。

在我國，中藥是臨床治療乙型肝炎的重要手段之一，一些中藥材有效部位，不僅可抑制乙肝病毒的復(fù)制，還可通過調(diào)節(jié)免疫功能幫助機體清除病毒，因其可能多成分、多靶點發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，在抗病毒研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。常用藥材中，茵陳、蒲公英、黃芩、黃芪、野菊花、秦艽、杜仲、葉下珠、荔枝核、石榴皮等幾十種中藥材的提取物經(jīng)實驗研究證實具有抗HBV作用[5-11]，能有效抑制乙肝病毒的復(fù)制，它們多為抗乙肝中成藥或經(jīng)驗方的基本組方藥材。研究這些中藥材及其提取物的抗乙肝病毒作用，不僅可為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療乙型肝炎的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，還有助于從傳統(tǒng)藥物中探尋新的抗病毒天然產(chǎn)物。

濱蒿(ArtemisiascopariaWaldst.et kit)學(xué)名豬毛蒿，古代本草中稱北茵陳或山茵陳，民間又稱“土茵陳”，為菊科蒿屬多年生草本植物，其收載于《中國藥典》，與茵陳蒿同為中藥材茵陳的植物來源，藥用部位為干燥地上部分。濱蒿其植株具有濃烈的香氣，性味苦、辛、微寒，具有清濕熱、退黃疸等功效，其濱蒿作為傳統(tǒng)中藥材常用于治療傳染性黃疸型肝炎，但有關(guān)其抗乙肝病毒作用的實驗研究尚未見報道。濱蒿原植物在歐、亞大陸溫帶與亞熱帶地區(qū)廣泛分布，生長于草原坡地、荒漠邊緣、林邊路旁等。在我國西北地區(qū)，濱蒿的資源分布比茵陳蒿更為廣泛，其適應(yīng)性、再生性和抗逆性強。新疆地區(qū)的濱蒿野生資源極為豐富，其作為維吾爾醫(yī)常用藥材也有悠久的應(yīng)用歷史，維吾爾醫(yī)認為其具有清熱解毒、開竅化痰、消敗津、除積物等功效[12]。濱蒿雖作為常用藥材在我國中醫(yī)學(xué)中有悠久的應(yīng)用歷史，但其相關(guān)基礎(chǔ)研究還比較薄弱，遠不如茵陳蒿。據(jù)報道[13-16]，濱蒿中含有香豆素、酚酸、黃酮類、揮發(fā)油、色原酮等多種成分，其化學(xué)成分與茵陳蒿相近，但有所不同[17-18]。筆者前期研究[19]表明,濱蒿提取物中含有薊黃素、槲皮素、金絲桃苷等黃酮類成分，以及3,5—二咖?？鼘幩岬榷喾N酚酸類成分[20]，其具有明確的抗流感病毒作用[21],并可調(diào)節(jié)機體的免疫功能[22]。鑒于濱蒿作為茵陳藥材源在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中常用于乙型肝炎的治療，而其在抗乙肝病毒方面的基礎(chǔ)研究以往未見報道，本研究通過體外實驗考察濱蒿提取物在兩種載體細胞中對HBV復(fù)制的干預(yù)作用，為濱蒿的傳統(tǒng)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并為濱蒿提取物作為廣譜抗病毒天然產(chǎn)物繼續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 樣品 藥材于2014年7月采自烏魯木齊八道灣，由新疆藥物研究所何江研究員鑒定為濱蒿ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.的全草。

濱蒿提取物(BH)，其大類成分含量按總黃酮計為51.6%(主要為黃酮類成分和酚酸類成分)，由新疆藥物研究所植化室提供。

制備方法：濱蒿地上部分的粗粉加8～10倍量的水，在100 ℃提取兩次，每次2～3 h，過濾，合并濾液，將濾液濃縮后加相當(dāng)于濃縮液體積2倍量的無水乙醇，放置沉淀24 h，濾除沉淀得到乙醇溶液；將乙醇溶液濃縮后以稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值為6～8，采用AB-8大孔樹脂-聚酰胺聯(lián)合柱層析，以去離子水沖洗層析柱,再以70%的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇,在60 ℃下真空干燥，即得,出膏率約2.5%。

BH樣品在小鼠給藥時以0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液助懸配制成所需濃度的混懸液，臨用前配制；體外實驗時先用DMSO溶解配成母液，臨用前加細胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度；

拉米夫定(LAM)，由北京諾德恒信化工技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號為NDS0061105。

1.2 病毒株及體外細胞模型 轉(zhuǎn)染人HBV-DNA的肝癌細胞HepG 2.2.15細胞，美國Mount Sinai 醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所傳代儲存。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(新)2011-0001。

1.4 試劑 谷氨酰胺，ELISA檢測HBsAg和HBeAg試劑盒,由上海科華生物工程股份有限公司提供；Eagles MEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素雙抗、G418，為美國GIBCO公司產(chǎn)品; Real time PCR SYRB green試劑盒，由美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)提供; DNA提取試劑盒，為北京全式金生物技術(shù)有限公司 (TransGen Biotech)產(chǎn)品。羧甲基纖維素鈉，由上海山浦化工有限公司生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 濱蒿提取物對HepG2.2.15細胞上清中乙肝病毒復(fù)制的影響 樣品對2.2.15細胞分泌HBsAg和 HBeAg的抑制作用: HepG2.2.15細胞在96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后，加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9 d(每3 d換液1次)，收集上清液，用HBsAg和HBeAg診斷試劑盒(ELISA)檢測HBsAg和 HBeAg(平行三孔)。

樣品對HepG 2.2.15細胞上清HBV DNA表達的抑制作用：將上述細胞上清液取100 μL，加100uL 8% PEG8000，振蕩混勻。4 ℃靜置4h或者過夜放置，15000RPM，4 ℃離心15 min，棄去上清。加100 μL 12% Chelex-100，振蕩混勻，100 ℃加熱10 min。取上清2 μL，進行熒光定量PCR檢測，實驗重復(fù)兩批。

2.2 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞穩(wěn)定表達HBV DNA的影響 HepG2.2.15細胞(約50萬個/L)接種96孔板培養(yǎng)板，每孔100 μL，37℃ 5% CO2條件培養(yǎng)48h左右加樣，BH取25～1.562 μg/mL 5個2倍稀釋濃度， LAM取2～0.125 μm 5個2倍稀釋濃度，加樣，每濃度3孔，同時設(shè)細胞對照組，于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)，第3天換1次藥液，繼續(xù)培養(yǎng)，加樣第6天收取細胞，按試劑盒說明書方法提取DNA，實時熒光定量PCR檢測HBV- DNA載量(拷貝/mL)，計算樣品對細胞內(nèi)HBV-DNA的抑制率。結(jié)果見表2。

對 HBV- DNA 抑制采用SybrGreen熒光檢測系統(tǒng)對目的基因(HBV)進行相對定量分析，采用看家基因GAPDH作為內(nèi)參照對Ct值進行歸一化處理，基因表達差異計算方法采用ΔΔCt法,按照如下公式計算抑制率，按Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

抑制率(%) =1-2-ΔΔCT

ΔCtsample= HBV Ctsample-GAPDH Ctsample

ΔCtcontrol= HBV Ctcontrol-GAPDH Ctcontrol

ΔΔCt=ΔCtsample-ΔCtcontrol

sample代表實驗組；

control代表對照組；

HBV Ctsample代表實驗組樣品HBV基因的Ct值；

GAPDH Ctsample代表實驗組樣品內(nèi)參照基因的Ct值；

HBV Ctcontrol代表對照組樣品HBV基因的Ct值；

GAPDH Ctcontrol代表對照組樣品內(nèi)參照基因的Ct值。

2.3 濱蒿總黃酮對HepAD38細胞HBV DNA高表達的影響 HepAD38細胞接種24孔培養(yǎng)板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h左右，BH取25～1.562 μg/mL 5個2倍稀釋濃度，LAM取2～0.125 μm 5個2倍稀釋濃度，加樣，每濃度3孔, 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng), 3 d后換原濃度樣品溶液繼續(xù)培養(yǎng)，第6 天收取細胞。提取細胞內(nèi)HBV DNA，Real-time PCR檢測HBV DNA載量，HBV DNA的相對含量用ΔΔCt法進行計算，計算各濃度對HBV DNA的平均抑制率，再按Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.4 濱蒿提取物在小鼠口服的急性毒性研究

2.4.1 預(yù)實驗 取昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重18～22 g，禁食不禁水12 h。濱蒿總黃酮以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成最大給藥濃度為15%的混懸液，按40 mL/kg體重灌胃給藥2次(間隔6 h)，觀察24 h，未見死亡，且精神與活動狀態(tài)無異常。

2.4.2 最大給藥量(MTD)的測定 取昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為3組，每組20只，即溶媒對照組、濱蒿總黃酮小劑量組和大劑量組，禁食不禁水12 h。濱蒿總黃酮以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成最大給藥濃度為15%的的混懸液，按40 mL/kg體重灌胃給藥，小劑量組給藥1次，大劑量組給藥2次(間隔6 h)，溶媒對照組灌胃等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。觀察小鼠毒性反應(yīng)情況，連續(xù)觀察14 d，詳細記錄小鼠給藥后毒性癥狀出現(xiàn)、發(fā)展、消退和死亡的時間以及出現(xiàn)反應(yīng)的動物數(shù)量；觀察期結(jié)束稱取小鼠體重、解剖受試小鼠、觀察臟器病變情況，并對肉眼可見異常的器官進行組織病理學(xué)檢查。

3 實驗結(jié)果

3.1 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞上清中HBV DNA復(fù)制及抗原分泌的影響 實驗結(jié)果表明，濱蒿總黃酮可明顯抑制2.2.15 細胞上清HBV DNA表達，IC50平均為142.5 μg/mL;同時還明顯抑制表面抗原和e抗原的分泌，IC50平均為102.9 μg/mL和105.3 μg/mL。見表1。

表1 對2.2.15細胞上清HBV DNA復(fù)制和抗原分泌的影響(2批實驗)

3.2 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞穩(wěn)定表達HBV DNA的影響 實驗結(jié)果如表2所示，濱蒿總黃酮顯著抑制HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV DNA的復(fù)制，其IC50為26.5 μg/mL(如圖1A所示), 拉米夫定對2.2.15細胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制的IC50為0.2 μM(如圖1B所示)。

3.3 濱蒿總黃酮對HepAD38細胞HBV DNA高表達的影響 實驗結(jié)果見表3，濱蒿總黃酮顯著抑制HepAD38細胞HBV DNA的高表達，其IC50為97.1 μg/mL(如圖2A所示), 拉米夫定抑制HepAD38細胞HBV DNA表達的IC50為0.28 μm(如圖2B所示)。

3.4 小鼠一日內(nèi)最大給藥量MTD 試驗觀察期內(nèi)溶媒對照組和給藥組動物均未出現(xiàn)死亡，外觀體征、行為活動及飲食等均未見異常；試驗結(jié)束時小劑量組動物體重為(31.7±4.2)g，大劑量組體重為(31.5±3.6)g，對照組體重為(31.7±3.8)g，給藥組體重與對照組比較無顯著性差異；大體解剖檢查給藥組與溶媒對照組臟器比較亦未發(fā)現(xiàn)有明顯異常。故小鼠一日內(nèi)灌胃濱蒿提取物的最大給藥量為12 g/kg·d，且未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，提示本樣品口服給藥安全性較好。

表2 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞HBV DNA表達的抑制率

表3 濱蒿總黃酮對HepAD38細胞HBV DNA表達的抑制率

A：濱蒿總黃酮；B：拉米夫定圖1 不同藥物處理對HepG2.2.15細胞內(nèi)HBVDNA的復(fù)制的影響圖

A：濱蒿總黃酮；B：拉米夫定圖2 不同藥物處理對HepAD38細胞HBVDNA表達的影響圖

4 結(jié)論與討論

目前，抗HBV 藥物的篩選都是基于對HBV DNA 表達和抗原表達的抑制活性。HepG2.2.15細胞是被轉(zhuǎn)染HBV基因的人肝癌細胞系，可以穩(wěn)定進行HBV 基因組的復(fù)制，在細胞上清中也可檢測到HBV DNA和抗原，被廣泛應(yīng)用于研究HBV復(fù)制周期、免疫效應(yīng)細胞及抗病毒藥物的篩選與評價[15-17]。HepAD38人肝癌細胞在常規(guī)培養(yǎng)時采用含四環(huán)素的培養(yǎng)基，細胞不產(chǎn)生HBV,當(dāng)撤去四環(huán)素時 細胞開始誘導(dǎo)產(chǎn)生HBV,由于其產(chǎn)毒可進行人為調(diào)控，HepAD38細胞的安全系數(shù)較2.2.15細胞高。當(dāng)對HepAD38細胞進行誘導(dǎo)時，其復(fù)制產(chǎn)生HBV顆粒的數(shù)量迅速提高，最終其產(chǎn)毒水平可達到持續(xù)產(chǎn)毒細胞的10倍[24]。

本研究采用的濱蒿提取物主要含酚酸和黃酮類成分，其在上述兩種HBV載體細胞上均顯示出良好的抗乙肝病毒作用，可明顯抑制2.2.15細胞內(nèi)HBV DNA的復(fù)制，同時抑制細胞上清中HBV DNA的表達和HBsAg、HBeAg的分泌，對HepAD38細胞HBV DNA的高表達也有顯著的抑制作用，該濱蒿提取物不僅抗HBV作用強，而且口服給藥的安全性良好，是一個值得深入研究的抗病毒天然產(chǎn)物。上述研究也為濱蒿作為傳統(tǒng)藥材在中醫(yī)藥及維吾爾醫(yī)藥中的應(yīng)用提供了的可靠的實驗依據(jù)。