董麗榮

昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650100

清開靈口服液為臨床常用的清熱解毒類中成藥，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒腦開竅之功效，主要成分為膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、梔子、水牛角、板藍(lán)根、黃芩苷、金銀花[1]。水牛角作為其中的主要原料，具有清熱涼血、解毒、定驚之功效，主要藥效學(xué)成分為氨基酸[2-3]，膽酸、豬去氧膽酸為含氮有機(jī)化合物。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于2020版中國藥典一部，原標(biāo)準(zhǔn)采用半微量凱氏定氮法測定總氮量[4]，半微量測定法存在操作及裝置復(fù)雜、效率低、重現(xiàn)性差等不足。本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)凱氏定氮儀法測定其總氮量，并對實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1.1 儀器 全自動(dòng)凱氏定氮儀 (型號：kjeltec8400)，瑞典FOSS公司生產(chǎn)， 具有凱氏蒸餾和自動(dòng)滴定功能，最小滴定單位為0.004 mL，可根據(jù)滴定缸內(nèi)溶液顏色變化進(jìn)行終點(diǎn)判定，分析儀專用消化管體積為250 mL；消化儀(FOSS TecatorTM Digestor2520)，控溫范圍為50～440 ℃；梅特勒萬分之一電子天平(型號：AL204)。

1.2 試藥試劑及材料 五水合硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、氫氧化鈉、95%乙醇、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銨均為分析純。吸收液：取0.1%甲基紅乙醇溶液70 mL，0.1%溴甲酚綠乙醇溶液100 mL， 1%硼酸溶液10 L，混合、搖勻即得。清開林口服液為廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)，批號：1201104。

2 方法

2.1 消解 精密吸取清開靈口服液5 mL，加入硫酸鉀∶五水合硫酸銅(9∶1)5 g 混合均勻置于消化管中，加入10 mL濃硫酸，搖勻，靜置半小時(shí)。消化時(shí)間和溫度(200 ℃：30 min；420 ℃：90 min)，平行制備試劑空白2份。

2.2 儀器準(zhǔn)備 先確認(rèn)冷卻水閥是否打開，再打開主機(jī)電源，并進(jìn)行管路沖洗，確保吸收液、滴定液、稀釋用水為新鮮配置。用所需滴定液潤洗3次滴定器后再充滿滴定器。放入空消化管加水，啟動(dòng)蒸汽發(fā)生器進(jìn)，運(yùn)行清洗程序3次。

2.3 儀器回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取硫酸銨粉末0.1 g，平行取樣 6份，加40%氫氧化鈉溶液70 mL，稀釋液(水)30 mL，接收液30 mL，蒸汽發(fā)生器功率為90%，測定其回收率。結(jié)果見表1。

硫酸銨理論含氮量(%)

平均回收率100.6%，RSD=0.2%?；厥章试?9%～101%范圍內(nèi)，RSD≤2%，測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性符合要求。證明該自動(dòng)凱氏定氮儀性能正常，方法參數(shù)設(shè)置合理，可進(jìn)行樣品測定。

2.4 蒸餾和滴定 取消化好的試劑空白和樣品分別上機(jī)測定，加40%氫氧化鈉溶液70 mL，稀釋液(水)30 mL，吸收液30 mL，蒸汽發(fā)生器功率為90%，硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定濃度為0.05 mol/L。

2.6 參數(shù)優(yōu)化 采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化消解及堿化時(shí)硫酸鉀∶硫酸銅(9∶1)、濃硫酸、40%NaoH加入量，選用U6(63)表安排試驗(yàn)。選擇總氮的含量作為指標(biāo)，三種試劑加入量作為考察因素A、B、C，選擇6個(gè)水平，每個(gè)水平各擬一次。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素、水平及測定結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃硫酸加入量為10 mL，硫酸鉀∶硫酸銅(9∶1)加入量為5 g，40%NaoH加入量為70 mL時(shí)，測得樣品含氮量最高。

3 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取清開林口服液5.0 mL，按照優(yōu)化的凱氏定氮參數(shù)條件進(jìn)行測試，平行測定6次，結(jié)果為：2.57 mg/mL、2.55 mg/mL、2.51 mg/mL、2.65 mg/mL、2.65 mg/mL、2.62 mg/mL，平均值為2.57 mg/mL，RSD為2.2%，表明本法精密度良好。

3.2 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取3.0 mL清開林口服液6份，分別精密加入0.05 g、0.08 g、0.10 g硫酸銨各兩份，按照優(yōu)選的凱氏定氮測定條件，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。結(jié)果見表3。

表1 儀器回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素和水平

表3 方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3.3 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密吸取清開林口服液2.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL，按照優(yōu)選的凱氏定氮法測定，以取樣量為(X)橫坐標(biāo)、總氮量為(Y)縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y=2.534X+0.207，r=0.9995。結(jié)果表明，清開林口服液取樣量在2.0～12.0 mL 范圍內(nèi)與總氮量線性關(guān)系良好。

3.4 方法比對實(shí)驗(yàn) 精密吸取清開林口服液3.0 mL，參照藥典方法規(guī)定條件，采用半微量凱氏定氮法對樣品中氮含量進(jìn)行測定，平行測定6份，結(jié)果為：2.65 mg/mL、2.50 mg/mL、2.70 mg/mL、2.80 mg/mL、2.45 mg/mL、2.40 mg/mL，平均值為2.58 mg/mL，RSD為6.1%。采用自動(dòng)定氮儀法，得到的總氮量的平均值為2.6 mg/mL，RSD為2.2%(見3.1)。結(jié)果比較顯示，全自動(dòng)定氮儀法與傳統(tǒng)半微量凱氏定氮法相比，兩種方法的測定結(jié)果基本相同，無顯著性差異，但是全自動(dòng)凱氏定氮儀法組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差即變異系數(shù)要小，且精密度更好[6]。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取清開林口服液5.0 mL，按優(yōu)化的參數(shù)條件進(jìn)行消解，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h時(shí)測定總氮，不同時(shí)間點(diǎn)總氮含量的值為2.53 mg/mL、2.62 mg/mL、2.55 mg/mL、2.57 mg/mL、2.64 mg/mL，RSD 為1.8%，表明本法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4 結(jié)論

本文建立的自動(dòng)凱氏定氮儀法測定清開靈口服液中總氮量的方法，從消化到蒸餾、滴定無試樣轉(zhuǎn)移過程，滴定終點(diǎn)可自動(dòng)識別，減少了人為因素造成的誤差[7]。具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、快捷、高效的特點(diǎn)。可作為清開靈口服液中總氮量測定的有效方法。

5 討論

凱氏定氮法的原理為：在催化劑(硫酸銅、硫酸鉀)的作用下，樣品中含氮有機(jī)物被濃硫酸氧化分解為二氧化碳、水和氨氣，氨氣與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再加入強(qiáng)堿溶液，中和消化處理后剩余的濃硫酸，并使(NH4)2SO4轉(zhuǎn)化為NH4OH，通過加熱蒸餾生成氨氣逸出，被硼酸吸收液吸收，再用一定濃度的硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行酸堿滴定，根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的量計(jì)算出待測物中的總氮量[8]。硫酸銨要在足夠的堿液中才能使結(jié)合態(tài)的氨游離出來，所以用到的氫氧化鈉需過量，過量的標(biāo)志是加入40%的氫氧化鈉后變?yōu)樽睾谏芤篬9]。過量的氫氧化鈉會與硫酸銅反應(yīng)生成藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅在蒸餾過程中受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。堿加入量不夠會造成測定結(jié)果偏低[10]。

硫酸鉀與濃硫酸作用生成硫酸氫鉀可以提高反應(yīng)體系的溫度，從而提高溶液的沸點(diǎn)以加快反應(yīng)中有機(jī)物的分解。硫酸鉀的取用要適量,否則會使消化體系溫度過高，使已生成的硫酸銨過熱分解而造成氮的損失；硫酸銅除了可以起到催化作用，還可以作為指示劑指示消化終點(diǎn)的到達(dá)。使用催化劑的比例需適合,否則會導(dǎo)致消化過程時(shí)間過長,以及過量的催化劑與濃硫酸造成資源浪費(fèi)及環(huán)境污染[11-12]。

接受液為1%的硼酸溶液，加入指示劑后正常顏色為酒紅色，存儲過程應(yīng)避光熱，若使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色改變，應(yīng)重新配置。

蒸汽發(fā)生器的功率為冬春設(shè)置為90%～100%，夏秋設(shè)置為80%～90%，功率設(shè)置過高測定過程中凱氏定氮儀系統(tǒng)整體過熱，使測量值稍偏離真實(shí)值。滴定液消耗量在8～15 mL，含量結(jié)果在11.0～15.0 mg內(nèi)準(zhǔn)確性較高。