王昊天 段晶晶 陳幸運(yùn) 高春濤

E26 轉(zhuǎn)化特異性同源因子（E26 transformationspecific homologous factor，EHF），又名上皮特異性轉(zhuǎn)化因子3（epithelium-specific ETS factor family member 3，ESE3），是ETS 超家族中的一員，廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。EHF 在胰腺癌、前列腺癌中均發(fā)揮抑癌作用[1-4]。最新研究發(fā)現(xiàn)EHF 可下調(diào)胰腺癌細(xì)胞的干性[5]，而干性是導(dǎo)致胰腺癌耐藥及進(jìn)展的重要原因[6-7]，提示有望針對(duì)EHF 通路探索治療胰腺癌的新方法。基于此，本研究通過生物信息學(xué)分析，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及經(jīng)典的干性功能學(xué)實(shí)驗(yàn)[8]探討EHF 調(diào)控胰腺癌細(xì)胞干性的具體機(jī)制，以期為探索胰腺癌治療新靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胰腺癌細(xì)胞系 BXPC-3 及PANC-1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，MIA PaCa2 及SW1990 購自美國American Type Culture Collection（ATCC）公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 EHF 抗體（貨號(hào)LS-C30726）購自美國LifeSpan Biosciences 公司；GADPH 抗體（貨號(hào)RM-2005）購自中國北京銳抗生物科技有限公司；β-catenin 抗體（貨號(hào)YM3345）、c-myc 抗體（貨號(hào)YT0991）、CD44 抗體（貨號(hào)YM6155）購自美國Immunoway 公司；PE-Cy7 標(biāo)記的ESA 抗體（貨號(hào)9C4）、FITC 標(biāo)記的CD24 抗體（貨號(hào)ML5）以及APC 標(biāo)記的CD44 抗體（貨號(hào)BJ18）購自美國Biolegend 公司；GFP 標(biāo)記的EHF 過表達(dá)和敲低的病毒液購自中國北京奧科鼎盛生物科技有限公司；Polybrene 購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；Wnt/β-catenin 通路抑制劑XAV939 購自美國MedChemExpress 公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA 裂解液購自中國碧云天生物科技公司；Trizol Regent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 和RNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒均購自日本Takara 公司；ChIP 試劑盒購自瑞士Roche公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega 公司；帶有目標(biāo)基因片段的PGL3 熒光素酶質(zhì)粒及海腎質(zhì)粒購自中國吉?jiǎng)P基因公司；Western Blot 化學(xué)發(fā)光成像儀購自中國深圳佰思恒科技有限公司；CFX96 Real time PCR 反應(yīng)儀購自美國Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；普通倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 EHF 過表達(dá)及敲低細(xì)胞系構(gòu)建 利用PANC-1 細(xì)胞構(gòu)建EHF 穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系，利用SW1990 細(xì)胞構(gòu)建EHF 穩(wěn)定敲低細(xì)胞系。通過感染EHF 過表達(dá)和敲低的病毒，繼而以嘌呤霉素藥篩的方法構(gòu)建EHF外源性過表達(dá)及敲低細(xì)胞系。

1.2.2 蛋白提取及Western blot 利用RIPA 裂解液進(jìn)行細(xì)胞蛋白的提取。Western blot 具體步驟同常規(guī)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR 利用Trizol裂解液提取細(xì)胞RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒說明書構(gòu)建RT-qPCR 體系上機(jī)檢測(cè)。引物序列見表1，基因的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 RT-qPCR 的引物序列

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)、清洗后，避光條件下加入binding buffer 及流式抗體，室溫孵育半個(gè)小時(shí)后清洗細(xì)胞，移入流式檢測(cè)管內(nèi)，避光保存于4℃冰箱內(nèi)，在24 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 懸浮細(xì)胞成球 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行消化及計(jì)數(shù)，將5 000 個(gè)細(xì)胞均勻加入含有2 mL 干性培養(yǎng)基的低粘附6 孔板內(nèi)，保證細(xì)胞不成團(tuán)且均勻懸浮分布，每3 d 添加500 μL 干性培養(yǎng)基，約14 d 后用普通倒置顯微鏡進(jìn)行采圖，計(jì)算干性細(xì)胞球的細(xì)胞成球率（sphere formation efficiency，SFE）：每個(gè)孔中形成的干性球總數(shù)/每孔細(xì)胞數(shù)總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均值。

1.2.6 軟瓊脂克隆形成 將培養(yǎng)基與1.2%的瓊脂糖液按1∶1 比例混合，取1 mL 迅速鋪于6 孔板內(nèi)，待其凝固。取500 個(gè)目標(biāo)細(xì)胞與2×全培養(yǎng)基及0.7%的瓊脂糖液進(jìn)行混合（后兩者按1∶1 的比例提前混合），隨后將含有細(xì)胞的混合液均勻鋪至已經(jīng)凝固的下層凝膠上，等待上層凝膠慢慢凝固。凝固后，在表面均勻滴加500 μL 2×全培養(yǎng)基，隨后每3d 滴加500 μL 2×全培養(yǎng)基。14d 后觀察克隆形成的數(shù)量和大小，計(jì)算克隆形成率（colony formation efficiency，CFE）。每50 個(gè)細(xì)胞形成的集落認(rèn)為是1 個(gè)單克隆，計(jì)數(shù)每個(gè)孔中克隆總數(shù)/孔中細(xì)胞總數(shù)×100%即得單孔的克隆形成率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均值。

1.2.7 ChIP 實(shí)驗(yàn) 按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，EHF 結(jié)合序列的PCR 引物為：β-catenin-F：5，-CGCCTT ACCACCCACCAAG-3，，β-catenin-R: 5，-GGCATATC GTTGTGCCAGGT-3，。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，計(jì)算平均值。

1.3 生物信息學(xué)分析

下載TCGA 數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌數(shù)據(jù)，通過DAVID 網(wǎng)站及KOBES 網(wǎng)站進(jìn)行EHF 差異基因的功能富集分析及KEGG 通路富集分析[9]，在前十位分子通路中尋找與胰腺癌細(xì)胞干性相關(guān)的信號(hào)通路。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)利用基因探針富集分析（GSEA）[10]對(duì)TCGA中胰腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步驗(yàn)證EHF 與KEGG富集出的干性相關(guān)通路是否存在相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 通路參與EHF 對(duì)胰腺癌細(xì)胞干性的調(diào)控

通過KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)在富集出的與EHF相關(guān)的前十位分子通路中，與胰腺癌細(xì)胞干性相關(guān)的為位列第五位的Wnt/β-catenin 通路（圖1A），該通路為經(jīng)典的干性通路[11]。在此基礎(chǔ)上，GSEA分析提示EHF mRNA 水平與Wnt/β-catenin 通路的活性呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1B）。

圖1 胰腺癌EHF 表達(dá)與Wnt/β-catenin 通路存在相關(guān)性

2.2 胰腺癌細(xì)胞EHF 的表達(dá)水平與Wnt/β-catenin通路的活性呈負(fù)相關(guān)

選取4 種常用的人源胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3、PANC-1、MIA PaCa2 以及SW1990 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，檢測(cè)其EHF 的基礎(chǔ)表達(dá)量。PANC-1 細(xì)胞及MIA PaCa2 細(xì)胞EHF 基礎(chǔ)表達(dá)量低，后續(xù)利用PANC-1細(xì)胞構(gòu)建外源性EHF 穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系；BXPC-3細(xì)胞及SW1990 細(xì)胞EHF 基礎(chǔ)表達(dá)量高，后續(xù)利用SW1990 細(xì)胞構(gòu)建外源性EHF 穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。進(jìn)而以上述細(xì)胞系為基礎(chǔ)探討EHF 對(duì)Wnt/β-catenin 通路活性的影響（圖2A）。Wnt/β-catenin 通路中有多個(gè)重要分子，如β-catenin、c-myc、Cyclin D1、CD44、TCF-1[12]，本研究最終選擇β-catenin、c-myc 及CD44作為代表Wnt/β-catenin 通路活性的指標(biāo)。前兩個(gè)蛋白是研究Wnt/β-catenin 通路最常用的蛋白，而考慮到本研究選取CD44 作為胰腺癌細(xì)胞干性特征的標(biāo)志物，故CD44 的表達(dá)也用于反映Wnt/β-catenin 通路的活性。通過Western blot 及RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，證實(shí)EHF的表達(dá)水平與代表Wnt/β-catenin 通路活性的因子βcatenin、c-myc 及CD44 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，圖2B，2C）。

2.3 EHF 直接調(diào)控β-catenin 的轉(zhuǎn)錄

為了探索EHF 與β-catenin 的相關(guān)性是否由EHF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控所引起，首先利用JASPAR 和UCSC 兩個(gè)在線數(shù)據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)β-catenin 啟動(dòng)子區(qū)可能存在的與EHF 發(fā)生結(jié)合的高分序列（圖2D），隨后利用ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EHF 可結(jié)合于β-catenin 啟動(dòng)子區(qū)（圖2E）。為進(jìn)一步證實(shí)這種空間結(jié)構(gòu)上的結(jié)合可引起轉(zhuǎn)錄改變，本研究進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。無論在293T 細(xì)胞還是在胰腺癌細(xì)胞中，將β-catenin 啟動(dòng)子區(qū)全長序列的質(zhì)粒導(dǎo)入后，在外源EHF 質(zhì)粒的刺激下，熒光強(qiáng)度明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2F）。而將β-catenin 啟動(dòng)子區(qū)中EHF 結(jié)合位點(diǎn)突變后的質(zhì)粒導(dǎo)入后，即使給予同樣的外源性EHF 質(zhì)粒刺激，熒光強(qiáng)度較對(duì)照組也無明顯變化（P＞0.05）。由此證實(shí)，EHF 可直接抑制β-catenin 的轉(zhuǎn)錄。

圖2 EHF 通過抑制β-catenin 的轉(zhuǎn)錄影響Wnt/β-catenin 通路的活性

2.4 利用XAV939 阻斷Wnt/β-catenin 通路的活性

以上結(jié)果證實(shí)EHF 可抑制Wnt/β-catenin 通路的活性，為進(jìn)一步證實(shí)Wnt/β-catenin 通路在EHF 促進(jìn)干性過程中的重要性，本研究進(jìn)行了阻斷實(shí)驗(yàn)，借助XAV939 阻斷Wnt/β-catenin 通路的活性。XAV939通過抑制聚ADP-核糖基化酶tankyrase 1 和tankyrase 2穩(wěn)定axin，從而刺激β-catenin 發(fā)生降解進(jìn)而阻斷Wnt/β-catenin 通路的活性[13]，是效果確切的Wnt/βcatenin 通路抑制劑。在EHF 敲低后，Wnt/β-catenin 通路激活，在此基礎(chǔ)上利用XAV939 抑制該通路的活性，隨后通過Western blot 和RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SW1990 細(xì)胞中，由EHF 敲低引起的Wnt/β-catenin 通路激活，經(jīng)XAV939 處理后，βcatenin、c-myc 及CD44 的含量均出現(xiàn)明顯的回落，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，圖3），但EHF 的含量并不受XAV939 的影響。且由于XAV939 僅影響β-catenin 的降解，故β-catenin 的mRNA 水平并不會(huì)受到XAV939 的影響。

圖3 利用XAV939 阻斷Wnt/β-catenin 通路的活性

2.5 阻斷Wnt/β-catenin 通路可抑制由于EHF 敲低引起的干性上調(diào)

利用流式細(xì)胞術(shù)、懸浮成球及軟瓊脂克隆這3 種經(jīng)典的干性功能學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的干性變化。研究顯示[14]，選擇ESA、CD24 和CD44 作為胰腺癌干性特征的標(biāo)志物，三個(gè)指標(biāo)均為陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是具有干性特征的胰腺癌細(xì)胞。如圖4A 所示，在SW1990 細(xì)胞中，隨著EHF 敲低，干性特征細(xì)胞增多（P＜0.01），但是經(jīng)XAV939 處理后，具有干性特征的細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01），甚至降至對(duì)照組水平（P＞0.05）。與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相同，發(fā)現(xiàn)隨著EHF 的含量下降，胰腺癌細(xì)胞的懸浮成球能力及軟瓊脂克隆形成增加（P＜0.001），但經(jīng)XAV939 處理（2 μM）后，懸浮成球及軟瓊脂克隆的數(shù)量和大小均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.001，圖4B，4C）。雖然EHF 作為轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)通過調(diào)控多條通路而抑制胰腺癌細(xì)胞的干性，但通過上述實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論，Wnt/β-catenin 通路在其中占有主導(dǎo)作用。

圖4 阻斷Wnt/β-catenin 通路可有效抑制由EHF 敲低引起的胰腺癌細(xì)胞干性上調(diào)

3 討論

胰腺癌是一種相對(duì)少見的消化道惡性腫瘤[15]，其發(fā)病率為十萬分之十二到十五，位于胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、食管癌之后，位列消化道惡性腫瘤的第5 位[16]。由于其解剖位置相對(duì)隱匿，早期癥狀缺乏特異性，患者就診時(shí)往往已處于晚期，可接受手術(shù)的患者比例不足20%，而可以從中獲益的患者甚至不足5%[17]。胰腺癌可以選擇的化療藥物非常有限[18]，且存在嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象[19]，而分子靶向治療[20]及免疫治療[21]在胰腺癌中的響應(yīng)均較差[22]，導(dǎo)致胰腺癌整體的死亡率幾乎與發(fā)病率持平[23]。因此迫切需要尋找胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。

EHF 為本課題組重點(diǎn)關(guān)注的具有抑癌作用的轉(zhuǎn)錄因子，前期研究發(fā)現(xiàn)EHF 可抑制胰腺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移[2]?？紤]到惡性腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細(xì)胞的干性特征息息相關(guān)[24]，干性又是引起惡性腫瘤耐藥[25]和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[26]的重要原因，而EHF 被證實(shí)可抑制胰腺癌細(xì)胞的干性[5]，故推測(cè)可以從EHF 入手尋找抑制胰腺癌細(xì)胞干性的方法。作為轉(zhuǎn)錄因子，EHF 調(diào)控的下游靶基因及信號(hào)通路眾多。在精準(zhǔn)治療的背景下，可將影響權(quán)重最大的通路篩選出來，并針對(duì)其進(jìn)行臨床治療的轉(zhuǎn)化研究。因此，本課題組借助生物信息學(xué)的分析方法篩選出受EHF 調(diào)控且會(huì)影響腫瘤細(xì)胞干性的Wnt/β-catenin 通路，通過Western blot 和RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)其調(diào)控關(guān)系，即在胰腺癌細(xì)胞中EHF 的表達(dá)水平與Wnt/βcatenin 通路的活性呈負(fù)相關(guān)。后續(xù)的機(jī)制實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，EHF 可通過抑制β-catenin 的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮下調(diào)Wnt/βcatenin 通路活性的作用。

為證實(shí)Wnt/β-catenin 通路在EHF 影響胰腺癌干性過程中發(fā)揮重要作用，本研究利用該通路的活性抑制劑XAV939 成功構(gòu)建了阻斷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。以此模型為?shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、懸浮細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等得出了一致的結(jié)論，雖然EHF可能調(diào)控很多分子信號(hào)通路，但Wnt/β-catenin 通路在其中占據(jù)主導(dǎo)地位，針對(duì)該通路進(jìn)行抑制是有意義的。后續(xù)可以嘗試?yán)肳nt/β-catenin 通路抑制劑來降低胰腺癌細(xì)胞的干性能力，進(jìn)而減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，甚至逆轉(zhuǎn)耐藥，而EHF 也有望成為篩選從該治療中獲益人群的分子標(biāo)記物。

本研究也存在不足之處。首先，僅在胰腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行了探索，后續(xù)仍需在動(dòng)物體內(nèi)甚至臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)論的正確性和治療的安全性。其次，XAV939 是否符合活體使用的標(biāo)準(zhǔn)，是否需要改變化學(xué)結(jié)構(gòu)以適用于臨床試驗(yàn)，亦或在已經(jīng)上市的藥物中是否已經(jīng)存在抑制Wnt/β-catenin 通路活性的藥物，這些均是接下來研究工作的重點(diǎn)。EHF 伴隨診斷的檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)也存在很多不確定性，使用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)還是基因測(cè)序[27]，或者使用創(chuàng)傷性更小的技術(shù)如ctDNA 或ctRNA 的液態(tài)活檢等[28]，需要更加深入的頭對(duì)頭研究去選擇敏感性和特異性更高、臨床操作簡便、同時(shí)符合醫(yī)學(xué)經(jīng)濟(jì)學(xué)要求的檢測(cè)方法。

綜上所述，EHF 可抑制胰腺癌細(xì)胞的干性，而Wnt/β-catenin 通路在該過程中起著主導(dǎo)作用，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過抑制該通路的活性可有效降低腫瘤細(xì)胞的干性。該研究為胰腺癌臨床治療提供了新的思路，但尚待進(jìn)一步的體內(nèi)研究進(jìn)行論證。