彭 樂 ，程佳偉 ，李淑楠 ，李文龍

（1. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制藥工程學(xué)院，天津 300193；2. 省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis, CE）技術(shù)于20世紀(jì)60年代首次提出[1]，自20世紀(jì)80年代至今發(fā)展快速. 與其他色譜技術(shù)相比，CE具有分析速度快、分離模式多、樣品和試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，是一種污染后易清洗的環(huán)境友好型綠色分析技術(shù)[4-5]. 如今，CE已廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物化學(xué)、藥物化學(xué)、食品科學(xué)等眾多領(lǐng)域，在復(fù)雜樣品的分析檢測(cè)過程中發(fā)揮了重大作用，具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]. 自人類基因組計(jì)劃以來，CE便廣泛應(yīng)用于脫氧核糖核酸（DNA）、蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的分析. 常用于生物大分子分析的毛細(xì)管電泳技術(shù)包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦電泳、親和毛細(xì)管電泳以及微流控芯片毛細(xì)管電泳等，其基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)如表1所列. 本文就CE在多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離、結(jié)構(gòu)鑒別、定量方法等方面的研究進(jìn)行了綜述（如圖1所示）.

圖1 毛細(xì)管電泳技術(shù)分析生物大分子的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of analysis of biomacromolecules by capillary electrophoresis

表1 常用于分析生物大分子的毛細(xì)管電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用特點(diǎn)[8-9]Table 1 Principles and application characteristics of capillary electrophoresis often used to analyze biological macromolecules [8-9]

近年來，很多相關(guān)科研工作者越來越多的關(guān)注CE在多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子分析上的應(yīng)用. 但在樣品制備、毛細(xì)管內(nèi)壁吸附、儀器的研制等方面仍存在著一些亟待解決的問題. 本文首先對(duì)在分析生物大分子中應(yīng)用最多的毛細(xì)管電泳分離模式的技術(shù)原理進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，然后對(duì)其在生物大分子分析領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道進(jìn)行了綜述，最后對(duì)這類技術(shù)的應(yīng)用前景及其存在的問題進(jìn)行了總結(jié)和展望，以期為相關(guān)的研究提供參考，從而推動(dòng)這類技術(shù)在生物大分子分析領(lǐng)域更大范圍的推廣應(yīng)用.

1 應(yīng)用對(duì)象

1. 1 多糖

多糖是由10個(gè)以上單糖分子通過縮合反應(yīng)形成的具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物，是動(dòng)植物體內(nèi)最主要的能量來源. 過去人們常將多糖視為非活性成分，近年來隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了上百種多糖具有藥效活性，如抗凝、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等作用，其中香菇多糖、肝素、人參多糖等已被制成相關(guān)藥物投入臨床[10-11]. CE技術(shù)主要應(yīng)用于檢測(cè)多糖的單糖組成及摩爾比、糖苷鍵鑒定以及糖類含量測(cè)定等方面[12].

Bai等[13]開發(fā)了一種快速且高效的膠束動(dòng)力毛細(xì)管色譜（MECC）結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器方法，用于確定竹蓀多糖樣品的單糖組成. 該法在原有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上測(cè)得竹蓀多糖樣品由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，易于操作、分析時(shí)間短、靈敏度高. 林曉燕等[14]采用水提醇沉法從太子參中提取得到粗多糖，經(jīng)分離純化后采用CE測(cè)定其單糖組成及比例. 谷楓等[15]選取巴戟天粗多糖，酸水解后進(jìn)行1-苯基-2-甲基-4-吡唑啉酮（PMP）衍生化，隨后采用CE分析測(cè)定其單糖組成. Snyder等[16]使用CE-MS分離并鑒別了77種血清中的N-聚糖，其中31個(gè)N-聚糖結(jié)構(gòu)在先前的研究中未被發(fā)現(xiàn). 此外，采用了芯片電泳和毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合選擇性電荷中和法，此法通過甲基酰胺化中和唾液酸對(duì)N-聚糖的電荷，但嗎啉鹽酸鹽（DMT-MM）在氯化銨條件下選擇性酰胺化α-2, 6鍵，未處理?xiàng)l件下形成α-2, 3鍵，對(duì)α-2, 3和α-2, 6鍵異構(gòu)體進(jìn)行分離. 此法可鑒別不同糖苷鍵化合物，并可以通過質(zhì)譜進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu). 譚惠文等[17]采用水提醇沉的方法從德國(guó)洋甘菊和羅馬洋甘菊中得到多糖，再經(jīng)三氟乙酸（TFA）水解，PMP衍生化，最后使用CE對(duì)兩種洋甘菊多糖中單糖組分的摩爾比進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明德國(guó)洋甘菊和羅馬洋甘菊的多糖組成分別為半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖. 周艷[18]采用CE測(cè)定猴頭菌及其多糖水解物中單糖組成及比例. 優(yōu)化分離條件：電動(dòng)進(jìn)樣10 s，以35 mmol/L硼砂緩沖液為電泳介質(zhì)，分離電壓為20 kV. 測(cè)得猴頭菌多糖水解液中含有3種單糖，包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖. 該方法快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性較好，可用于中藥糖類組分的分析檢測(cè).

1. 2 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)在生物體中執(zhí)行著大量的生物學(xué)功能，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能通常都是通過其酶產(chǎn)生的肽片段來識(shí)別的[19]. 在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，常使用一種自下而上的方法，即通過消化成肽間接鑒定蛋白質(zhì)[20-21]. CE技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)的主要分析技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于多肽的檢測(cè)，蛋白質(zhì)的分離、定量、結(jié)構(gòu)分析及活性檢測(cè)等方面.

王洋洋等[22]在建立并優(yōu)化雙水相法分離純化鱖魚蛋白的基礎(chǔ)上，采用高效毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC）耦合二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)鱖魚肌動(dòng)蛋白的含量，背景電解質(zhì)為四硼酸鈉-十二烷基硫酸鈉（SDS）緩沖溶液. 結(jié)果顯示肌動(dòng)蛋白在10 min左右時(shí)出峰，譜圖基線平穩(wěn)無雜峰，重復(fù)性良好，為海洋藥物蛋白的定量檢測(cè)提供參考. 李振慶等[23]采用脈沖電場(chǎng)毛細(xì)管電泳（PFCE）對(duì)溶菌酶、生長(zhǎng)激素、碳酸酐酶、肌動(dòng)蛋白、牛血清白蛋白和磷酸化酶B進(jìn)行測(cè)定. 結(jié)果表明，相比于直流電場(chǎng)毛細(xì)管電泳（DCCE），相同蛋白質(zhì)分子的分離時(shí)間更短，分離度更高. Zhang等[24]報(bào)道了一種基于遷移率毛細(xì)管電泳（MCE）快速分析蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)和有效電荷的方法. 通過對(duì)5種蛋白質(zhì)在接近自然環(huán)境下的電荷態(tài)和結(jié)構(gòu)的分析，以及不同pH條件下牛血清白蛋白和溶菌酶的構(gòu)象轉(zhuǎn)變和電荷態(tài)變化的研究，證明了該法的可行性. He等[25]利用毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（MCE-MS）技術(shù)完成了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)分析，并對(duì)MCE-MS技術(shù)分析復(fù)雜基質(zhì)中微量的生物分子進(jìn)行了研究，證明了該法是一種功能強(qiáng)大的生物分子結(jié)構(gòu)分析技術(shù). Deyanova等[26]開發(fā)了一種快速而強(qiáng)大的微流控芯片毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CEMCMS）方法，用于識(shí)別具有復(fù)雜的唾液化N和O鏈糖型的治療性融合蛋白的完整糖基化指紋. 該方法能有效地分離多種唾液化糖型，并能在6 min內(nèi)快速檢測(cè)糖基化譜的變化. 李悅[27]將毛細(xì)管電泳和固定化酶技術(shù)結(jié)合用于組蛋白去乙?；福℉DACs）抑制劑的在線活性篩選. 在優(yōu)化分離條件后，結(jié)果顯示測(cè)得的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與抑制劑動(dòng)力學(xué)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致. 此法穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單高效、消耗物料量小且具有較高的自動(dòng)性，有望成為組蛋白去乙?；敢种苿┭邪l(fā)的重要手段.

1. 3 核酸

核酸是生物遺傳信息載體，包括DNA與RNA，是由多個(gè)核苷酸單體聚合而成的長(zhǎng)鏈，經(jīng)盤曲折疊形成多級(jí)結(jié)構(gòu). 核酸適配體是RNA或短的單鏈DNA（ssDNA）分子，可與某些目標(biāo)物如金屬離子、蛋白質(zhì)等特異性結(jié)合. 適配體具有體積小、重復(fù)性高、維持可逆變性能力強(qiáng)、容易和可控的修飾以及缺乏免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，作為抗體替代品具有巨大的潛力[28]. 目前CE是分析核酸的重要工具，主要在核酸適配體的表征、核酸的分離檢測(cè)及核苷酸的測(cè)定等方面得到了廣泛應(yīng)用.

蔡先洪等[29]采用毛細(xì)管電泳法-指數(shù)富集配體系統(tǒng)（CE-SELEX）對(duì)維吉霉素M1適配體進(jìn)行篩選分析，并測(cè)定了其中親和力最大以及特異性最強(qiáng)的適配體的平衡常數(shù)（Kd）. Wang等[30]利用熒光耦合毛細(xì)管電泳法研究了凝血酶與其G-四鏈適配體的動(dòng)態(tài)結(jié)合狀態(tài)及其相互作用對(duì)的穩(wěn)定性. Yu等[31]首次建立了毛細(xì)管電泳串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定8種RNA修飾核苷酸的方法，并進(jìn)一步研究了Ni2+對(duì)RNA表觀遺傳學(xué)的影響. Lu等[32]建立了高分辨CGE分離大分子RNA的方法. 該方法使用了非水凝膠，相較于標(biāo)準(zhǔn)的水性凝膠，對(duì)大分子RNA的分辨率提高了6倍. Demelenne等[33]采用親水液相色譜（HILIC）和毛細(xì)管區(qū)帶電泳-紫外（CZE-UV）法分析脫氧（胸腺）核酸（dT）和經(jīng)修飾的硫代寡核苷酸（PS），比較了HILIC法和CZE法在選擇性、分離度、重復(fù)性等方面的差異，并將HILIC和CZE與漂移管離子遷移四極飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（DTIMSQTOF）耦合，檢測(cè)PS中核苷酸的數(shù)量. Wei等[34]開發(fā)了一種基于分離輔助雙循環(huán)信號(hào)擴(kuò)增策略的超靈敏CEMC方法，用于檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的microRNA（miRNA）. 該方法以最高靈敏度對(duì)微量miRNA進(jìn)行了檢測(cè)，在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中具有巨大的潛力. 張麗霞等[35]采用CGE結(jié)合熒光檢測(cè)器的方法來分離質(zhì)粒DNA，該方法能很好地將質(zhì)粒DNA超螺旋、線性及開環(huán)三種構(gòu)象分開，是一種靈敏度高，可重復(fù)性好的分析方法.

1. 4 脂質(zhì)

脂質(zhì)也是能量的儲(chǔ)存形式，是細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，可以分為簡(jiǎn)單脂質(zhì)、復(fù)合脂質(zhì)以及衍生脂質(zhì)，而CE主要在衍生脂質(zhì)中的應(yīng)用較多.

胡月芳[36]建立了毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)（CEED）方法，對(duì)淮山中3種植物甾醇（麥角甾醇、膽甾醇、β-谷甾醇）進(jìn)行了含量測(cè)定. 結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，3種植物甾醇在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離.該方法是測(cè)定淮山中植物甾醇類成分的一種簡(jiǎn)單可靠、準(zhǔn)確、有效的方法. Zhou等[37]報(bào)道了一種基于柱上酶促法和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的毛細(xì)管電泳方法，用于測(cè)定血漿中的總膽固醇含量. 在這個(gè)方法中，毛細(xì)管不僅作為分離介質(zhì)，而且還可以作為反應(yīng)室，以減少樣品數(shù)量和試劑消耗. 同時(shí)整個(gè)過程都可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，從而使可能出現(xiàn)的誤差最小化，并節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間. 最終試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的方法足以定量血漿中的總膽固醇. Du等[38]利用毛細(xì)管電泳結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器對(duì)人類尿液中的睪酮/表皮睪酮濃度比進(jìn)行了測(cè)定，最佳分離條件：壓力進(jìn)樣10 s，以15 mmol/L 醋酸-醋酸鈉溶液為電泳介質(zhì)，分離電壓為20 kV. 方法考察表明，所建立的方法能夠簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確地測(cè)定人尿液中睪酮與表皮睪酮的比例. Geda等[39]采用毛細(xì)管電泳紫外吸收檢測(cè)方法對(duì)大鼠大腦和小腦中的5種神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行了測(cè)定. 通過方法學(xué)考察，該方法的適用性得到了證明，可用于研究神經(jīng)節(jié)苷脂組成在各種病理?xiàng)l件下的變化以及對(duì)不同藥物治療的反應(yīng). Barakat等[40]建立了一種采用環(huán)糊精修飾的CZE方法研究脂質(zhì)寡核苷酸（LONs）的組成，同時(shí)采用ACE來確定LONs的結(jié)合常數(shù). 該方法成功研究了LONs的組成. 表2總結(jié)了近年來毛細(xì)管電泳技術(shù)在一些生物大分子中的應(yīng)用實(shí)例.

表2 毛細(xì)管電泳技術(shù)在生物大分子分析中的應(yīng)用Table 2 Application of capillary electrophoresis in analysis of biological macromolecules

2 總結(jié)與展望

雖然利用CE技術(shù)分析生物大分子的應(yīng)用很多，但在分析的過程中仍會(huì)遇到一些難題. 例如，多數(shù)多糖類化合物是電中性的，沒有紫外或熒光發(fā)射基團(tuán)，且分子量巨大也不易用質(zhì)譜檢測(cè)，所以一般要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，如衍生化，使其變成帶有電荷且具有一定紫外吸收或熒光發(fā)色基團(tuán)的物質(zhì). 然而，一般的衍生化步驟比較復(fù)雜，同時(shí)衍生化試劑也是有害且不環(huán)保，所以針對(duì)這一問題，有待尋找一些簡(jiǎn)單且環(huán)保的衍生化步驟，或采用一些非衍生化的方法來檢測(cè)，如電化學(xué)檢測(cè)法. 電化學(xué)檢測(cè)法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，適用于糖類化合物的測(cè)定.

對(duì)于一些堿性大分子，如堿性蛋白質(zhì)，在采用CZE分析時(shí)，由于毛細(xì)管內(nèi)壁表面的硅羥基在pH大于3時(shí)會(huì)發(fā)生電離形成帶負(fù)電的吸附點(diǎn)，使管壁對(duì)堿性蛋白質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸附，從而導(dǎo)致分離效率下降，所以克服吸附是分析蛋白質(zhì)樣品的首要任務(wù).目前最常見的減少蛋白質(zhì)吸附的方法包括改變緩沖溶液的性質(zhì)或惰化毛細(xì)管內(nèi)壁. 但惰化毛細(xì)管內(nèi)壁比較復(fù)雜，所以主要的辦法還是在緩沖液中加入添加劑，通過改變毛細(xì)管壁的狀態(tài)以及樣品的性質(zhì)來抑制蛋白質(zhì)的吸附. 近年來發(fā)展起來的離子液體（lonic liquids, ILs）和 低 共 熔 溶 劑（deep eutectic solvents, DES）有望成為一種有效的添加劑來減少蛋白質(zhì)的吸附作用.

CE技術(shù)在分離生物大分子方面已經(jīng)表現(xiàn)出巨大的潛力，但是定性分析仍然存在難題. 毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜儀的結(jié)合為定性問題提供了有力的手段，非常適合蛋白質(zhì)、肽等生物大分子的分析. 毛細(xì)管電泳和電噴霧質(zhì)譜結(jié)合是最為常見的分析方法之一，但其仍然存在一些缺點(diǎn)，如電接觸不穩(wěn)定，所以需要研發(fā)更多的儀器來彌補(bǔ)這些缺陷，毛細(xì)管電泳基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜等可以彌補(bǔ)這個(gè)缺陷.