付 媛，張美莉，張 宇，高韶輝

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學理學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

抗氧化劑可以清除自由基，并在維持細胞功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。其中，抗氧化肽可通過抑制脂質(zhì)氧化、螯合金屬離子等多種方式來提高機體的抗氧化、抗衰老、抵抗疾病能力，是備受青睞的一類抗氧化劑[2-3]。最近的研究表明，抗氧化肽的抗氧化活性與肽段大小、組成以及肽序列都有很大關(guān)系[4-5]。蘆鑫[6]研究發(fā)現(xiàn)，芝麻抗氧化肽中天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸出現(xiàn)的幾率大；Luo Xiaoyu等[7]分離出氨基酸序列分別為GEVPW、YMENF、AFYRW的3種抗氧化肽，均表現(xiàn)出較好的抗氧化效果；付媛等[8]從裸燕麥中分離出的活性肽（苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-亮氨酸）表現(xiàn)出較好的自由基清除性能，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該活性肽鏈中亮氨酸也出現(xiàn)在末端，并且肽鏈中也出現(xiàn)色氨酸，推測其可能起到促進抗氧化作用。然而，目前活性肽在體內(nèi)的抗氧化機理研究仍面臨很大的挑戰(zhàn)，一些研究利用各種動植物蛋白水解產(chǎn)物中分離得到的多肽片段，通過氨基酸測序確定其一級結(jié)構(gòu)，試圖分析其構(gòu)效關(guān)系，但是由于抗氧化肽氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)復雜，實驗手段很難準確獲得多肽抗氧化活性的作用位點和電子轉(zhuǎn)移路徑[9-10]。在這種情況下，量子化學模擬方法體現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。文超婷[11]采用量子化學對西瓜籽抗氧化肽P1-P5的化學結(jié)構(gòu)進行分子模擬，計算P1-P5的前線分子軌道分布和能量、原子凈電荷分布和鍵長，并推測出P1-P5的活性位點；聶挺等[12]采用半經(jīng)驗AM1和密度泛函理論（density functional theory，DFT）研究了天然抗氧化肽的活性位點，并提出了抗氧化肽自由基清除活性機理。

本課題組前期從燕麥中分離出兩種多肽（燕麥活性肽I及II），并確定了活性肽I的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，前期研究證明，裸燕麥源多肽確實可通過改變代謝通路來實現(xiàn)抗氧化的作用[8]，但是對于多肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)與抗氧化性之間的構(gòu)效關(guān)系并沒有闡明。本實驗對活性肽II的氨基酸序列結(jié)構(gòu)進行確定，并利用動物實驗測定了兩種多肽以及對照物分子VC的抗氧化活性，進一步通過量子化學計算獲得兩種裸燕麥源多肽的電子結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)型，推測其清除自由基的活性位點，以期揭示裸燕麥源多肽清除自由基的機理，為裸燕麥抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購自內(nèi)蒙古大學實驗動物部。生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2016-0001，使用許可證號：SYXK（蒙）2010-0006。

裸燕麥產(chǎn)自內(nèi)蒙古自治區(qū)武川縣，曬干、粉碎后過60 目篩備用。

D-半乳糖 美國Sigma公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）英國BDH公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、單胺氧化酶-B（monoamine oxidase-B，MAO-B）試劑盒、總蛋白定量測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Epoch2多功能微孔板檢測儀 美國BioTek公司；H2500R-2高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Triple TOF 5600+質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國SCIEX公司；1290 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography）系統(tǒng) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥源活性肽的制備

按本課題組前期研究[8-10]方法，以裸燕麥為原料制備兩種活性肽（活性肽I及II），并采用HPLC-MS/MS鑒定活性肽II氨基酸序列。

1.3.2 實驗動物分組及處理

50 只昆明種健康小鼠隨機分為5 組：正常對照組、衰老模型組、活性肽I治療組、活性肽II治療組及VC陽性對照組。除正常對照組外，其他各組按120 mg/（kgmb·d）劑量頸背部皮下注射D-半乳糖，正常對照組注射等量生理鹽水；活性肽I治療組、活性肽II治療組分別灌胃1 000 mg/（kgmb·d）活性肽I或活性肽II，VC陽性對照組灌胃100 mg/（kgmb·d）VC。每日定時灌胃、注射一次，連續(xù)6 周[13-15]。

1.3.3 生化指標的測定

參考本課題組前期研究[10]方法，利用相應試劑盒分別測定小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力以及腦組織中GSH-Px、MAO活力和MDA含量。

1.3.4 量子化學計算

本實驗所有計算均基于DFT平面波超軟贗勢法，運用Materials Studio 17.2軟件中的Dmol3模塊進行計算與分析[16]。計算時采用廣義梯度近似（generalized gradient approximation，GGA）中的PBE（Perdew-Burke-Ernzerhof）泛函。使用Grimme的DFT-D經(jīng)驗修正方案，研究范德華相互作用。優(yōu)化收斂公差集設(shè)置為1.0×10-5Ha（能量）、2.0×10-3Ha/?（梯度）、5.0×10-3?（位移）和1.0×10-6（自洽場（self consistent field，SCF）精度）。迭代子空間的直接反轉(zhuǎn)（direct inversion in the iterative space，DIIS）尺寸設(shè)置為6，自旋極化設(shè)置為不受限制。通過測定的氨基酸序列連接氨基酸分子建立活性肽I及活性肽II的初始結(jié)構(gòu)，對照物VC分子的初始結(jié)構(gòu)取自Materials Studio 17.2軟件數(shù)據(jù)庫。依據(jù)多肽分子優(yōu)化后的構(gòu)型使用公式（1）、（2）計算評估自由基進攻能力的f0（r）指數(shù)[17]。

式中：E表示基態(tài)電子能；μ表示化學勢；N表示物質(zhì)所含電子數(shù)；v表示外勢；ρ（r）表示電子密度；η表示硬度；f（r）表示Fukui函數(shù)。

式中：ρHOMO（r）和ρLUMO（r）分別表示分子受到親電攻擊、親核攻擊時，分子中原子的最高占用分子軌道（highest occupied molecular orbital，HOMO）和最低未占用分子軌道（lowest unoccupied molecular orbital，LUMO）上的電荷密度；f0（r）為自由基攻擊指數(shù)，其反映自由基進攻的能力；f+（r）為親核攻擊指數(shù)；f-（r）為親電攻擊指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進行t檢驗統(tǒng)計學處理，測定結(jié)果數(shù)據(jù)均用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸燕麥源活性肽的結(jié)構(gòu)

采用HPLC-MS/MS技術(shù)鑒定活性肽II結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示，活性肽II的氨基酸序列為纈氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-精氨酸-亮氨酸（Val-Phe-Asn-Asp-Arg-Leu，VFNDRL）；結(jié)合本課題組前期工作[8]，已知活性肽I的氨基酸序列為苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-亮氨酸（Phe-Leu-Trp-Gly-Thr-Leu，F(xiàn)LWGTL），顯然二者含有不同的氨基酸排列次序，由此可推測其抗氧化能力應該有所不同。

圖1 活性肽Ⅱ的二級質(zhì)譜圖Fig. 1 Secondary mass spectrum of peptide Ⅱ

為分析多肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)與抗氧化性之間的構(gòu)效關(guān)系，對活性肽I活性肽II的電子結(jié)構(gòu)進行計算。首先根據(jù)活性肽I及活性肽II的氨基酸序列，構(gòu)建活性肽的結(jié)構(gòu)模型圖，并使用Dmol3模塊對構(gòu)型優(yōu)化，得到兩個活性肽的能量最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，如圖2A和2B所示。同時計算對照物VC的構(gòu)型，其初始構(gòu)型取自Materials Studio模型庫，得到的優(yōu)化結(jié)構(gòu)如圖2C所示。

圖2 兩種活性肽及VC的優(yōu)化結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Optimal geometric structures of peptides I and II and VC

2.2 兩種活性肽在衰老小鼠血清及腦組織中抗氧化活性的比較

圖3 兩種活性肽在衰老小鼠血清及腦組織中抗氧化活性（，n＝10）Fig. 3 Antioxidant activity of two bioactive peptides in serum and brain tissues of aging mice (, n = 10)

2.3 兩種活性肽的結(jié)構(gòu)特征及其抗氧化機理分析結(jié)果

采用Materials Studio 17.2軟件中的Dmol3模塊，利用GGA-PBE泛函，并通過Grimme的DFT-D經(jīng)驗修正方案分別計算活性肽I、活性肽II和VC分子的Fukui指數(shù)f0（r）、自由基反應活性位點、活性位點處電荷、鍵長、HOMO能級（EHOMO）和LUMO能級（ELUMO）等電子結(jié)構(gòu)特征指標。

2.3.1 兩種活性肽及VC的Fukui指數(shù)f0（r）、自由基反應活性位點

Fukui指數(shù)f0（r）可反映局部反應活性，f0（r）越大，表明是自由基反應活性位點的可能性越高[23]，通過分析計算的結(jié)構(gòu)，f0（r）最大的5個原子如表1所示，這些原子位點更容易發(fā)生自由基清除反應，這些反應位點在分子中的位置如圖4所示（紅色圓圈處）。

表1 兩種活性肽及VC中高活性原子的Fukui指數(shù)Table 1 Fukui indices of the active atoms in two bioactive peptides and VC

圖4 兩種活性肽及VC的Fukui指數(shù)f0（r）活性原子示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the active atoms with higher f0(r) of bioactive peptides I and II and VC

結(jié)合表1和圖4可知，活性肽I的活性位點在亮氨酸的羧基、苯丙氨酸的胺基以及色氨酸吲哚環(huán)的雙鍵上；活性肽II的活性位點在亮氨酸的羧基以及精氨酸胍基的兩個胺基上。而VC的活性位點在五元環(huán)上的酯基以及另外兩個羥基上。

2.3.2 兩種多肽活性位點處電荷及鍵長

由表2可知，活性肽I中鍵長較長的分別是亮氨酸中的羧基、苯丙氨酸中的胺基、色氨酸吲哚環(huán)中的雙鍵；活性肽II中鍵長較長的分別是亮氨酸中的羧基和精氨酸胍基上的兩個胺基?；瘜W鍵鍵長越長越容易斷裂，說明上述位點是自由基清除反應的活性位點。

表2 兩種活性肽及VC活性點位處電荷及鍵長Table 2 Atomic charges and bond lengths at the active sites of bioactive peptides I and II and VC

綜合圖4、表1及表2可推測得出：1）活性肽I、II中C端的亮氨酸殘基可釋放活潑氫與自由基發(fā)生反應，終止自由基破壞生物大分子，起到抗氧化的作用，而亮氨酸殘基轉(zhuǎn)化為羧基自由基，羧基自由基進一步脫除CO2。這個反應過程中，因為有CO2的生成，使得體系熵增大，并且亮氨酸的支鏈使空間位阻增大，均有利于反應進行。有研究顯示，亮氨酸羧基可脫除CO2，并伴隨著羧基上H的遷移[24-25]，另外，一些研究證明支鏈氨基酸，尤其是亮氨酸，可有效減緩氧化應激，降低脂質(zhì)過氧化水平，保持機體抗氧化系統(tǒng)的平衡[26]，而且細胞中自由基的生成位點在線粒體中，如果抗氧化肽的N端含有疏水性氨基酸殘基，則會增大其在脂質(zhì)-水界面的溶解性，使其易于進入線粒體中，發(fā)揮自由基清除作用[27]?；钚噪腎中N端為苯丙氨酸殘基，活性肽II中N端為纈氨酸殘基，二者均屬于疏水性氨基酸，故兩種活性肽在脂質(zhì)-水界面的溶解性都會增大，有利于清除自由基。2）活性肽I中苯丙氨酸的N—H鍵明顯偏長，說明殘基上的胺基容易釋放活潑氫，其N原子上的p電子與相鄰C—H上的σ電子產(chǎn)生超共軛現(xiàn)象，使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，釋放出活潑氫與自由基發(fā)生反應，起到抗氧化作用。此外，色氨酸殘基吲哚環(huán)上容易發(fā)生離域π鍵共軛，可以使電荷的流動性增強，從而提供活潑氫來清除自由基[12]。3）活性肽II中精氨酸殘基N原子帶電較多，是堿性氨基酸，其與金屬離子可發(fā)生螯合反應，從而阻止Cu2+、Fe2+對生物大分子的氧化損傷[28-30]；另外，精氨酸殘基的胍基釋放出活潑氫后，胍基上存在超共軛及共軛現(xiàn)象，使得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，起到清除自由基的作用。

2.3.3 HOMO和LUMO結(jié)構(gòu)及其能級

前線軌道（HOMO和LUMO）是量子化學中一個重要參數(shù)[31]。EHOMO越大，表示越可能提供電子；ELUMO越小，表明越容易接受電子；二者軌道能級差ΔE＝ELUMOEHOMO是非常重要的指標，ΔE越小，表明活性越強，越易發(fā)生反應[32-33]。由圖5可知，活性肽I的HOMO主要位于色氨酸的吲哚環(huán)上，其LUMO主要位于亮氨酸的羧基，說明電子轉(zhuǎn)移是從色氨酸的吲哚環(huán)轉(zhuǎn)移到精氨酸的羧基，和前述的電子流動方向和活性位點相符，而活性肽II的電子轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在末端亮氨酸的羧基及相鄰的精氨酸胍基上，轉(zhuǎn)移路徑較短，離域范圍??；同樣，對照物VC的電子轉(zhuǎn)移也發(fā)生在其自身的五元環(huán)內(nèi)，因此，活性肽II和VC的抗氧化能力明顯比活性肽I弱。由表3可知，活性肽I的ΔE為3.400 eV，活性肽II的ΔE為4.069 eV，VC的ΔE為3.763 eV，活性肽I的EHOMO最大，且相應的ΔE最小，因此其自由基清除能力最強，抗氧化性最強，優(yōu)于VC和活性肽II；活性肽II的ΔE最高，其抗氧化性比VC略遜一籌，這與二者在衰老小鼠實驗中的結(jié)果相符。

圖5 兩種活性肽及VC的HOMO與LUMO結(jié)構(gòu)圖Fig. 5 Highest occupied molecular orbital and lowest unoccupied molecular orbital of bioactive peptides I and II and VC

表3 兩種活性肽及VC的前線分子軌道能及其能級差Table 3 Frontier orbital energies and energy differences of bioactive peptides I and II and VC

3 結(jié) 論

由衰老模型小鼠體內(nèi)指標的測定結(jié)果可知，灌胃兩種裸燕麥源活性肽后，各治療組均顯示出良好的抗氧化效果，其中活性肽I的治療效果更好，表明活性肽I的抗氧化性更強。

通過量子化學理論計算，得到Fukui指數(shù)、鍵長、前線分子軌道能級及其能級差，結(jié)果表明，活性肽I的自由基反應活性位點在亮氨酸的羧基、苯丙氨酸的胺基以及色氨酸的吲哚環(huán)的雙鍵上；活性肽II的自由基反應活性位點在亮氨酸的羧基以及精氨酸胍基的兩個胺基上；活性肽I的電子離域范圍大且ELUMO和EHOMO的能級差ΔE最小，因此其抗氧化活性最強，優(yōu)于活性肽II和對照分子VC。