賈菊艷，李寶軍，王 斌，余麗蓉，趙詩佳，畢 陽,*，Dov PRUSKY,2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.以色列農(nóng)業(yè)研究組織農(nóng)產(chǎn)品采后科學部，以色列 里雄萊錫安 7505101）

蘋果果實具有自我愈傷的能力，可通過在傷口處積累多酚及木質(zhì)素從而形成物理屏障來抑制病原菌侵染、減少水分蒸騰[1]。由于蘋果果實自然愈傷所需時間較長，因此可通過采取適當措施加速愈傷。前期研究發(fā)現(xiàn)，熱水處理可通過提高抗性酶的活性以及總酚和木質(zhì)素含量，從而促進蘋果果實愈傷[2]。同樣，季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）也可通過增加抗性酶活性以及總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量來促進蘋果果實愈傷[3]。

有報道表明，當植物受到逆境脅迫時，膜上不飽和脂肪酸的氧化改變了膜的通透性，使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，在Ca2+和鈣離子調(diào)節(jié)素（calmodulin，CaM）作用下，磷脂酶A2被激活，促使磷脂釋放亞麻酸（linolenic acid，LA）[4]。LA是重要的不飽和脂肪酸[5]，在植物響應逆境脅迫及調(diào)節(jié)生長發(fā)育方面具有重要作用[6]。LA處理可減輕由Phytophthora infestans引起的馬鈴薯葉片晚疫病[7]，并通過促進乙烯產(chǎn)生、提高過氧化物酶活性和木質(zhì)素含量來增強馬鈴薯塊莖對Phytophthora infestans的抗性[8]。LA處理還可通過增加不飽和脂肪酸含量來提高青椒果實的抗寒性[9]。此外，LA處理可通過提高α-淀粉酶活性來緩解干旱對水稻幼根和幼苗生長的抑制作用[10]，還可增加煙草葉片中的超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量來促進煙草生長[11]。

盡管已有LA增強作物對生物和非生物脅迫抗性及相關機制的報道，但LA處理是否影響蘋果果實愈傷尚鮮見報道。因此，本研究用1 mmol/L LA處理人工模擬損傷的‘富士’蘋果，測定愈傷期間損傷果實的質(zhì)量損失率和損傷接種果實的病情指數(shù)，分析果實傷口處苯丙烷代謝關鍵酶活力和代謝產(chǎn)物含量，以及H2O2含量和過氧化物酶活性，以評價LA處理對蘋果果實愈傷的作用效果。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

Penicillium expansum（T01）由中國科學院植物研究所田世平教授提供，于PDA培養(yǎng)基上保存待用。

‘富士’蘋果采自景泰縣商業(yè)果園，先將大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的果實單果套網(wǎng)袋后裝箱，當天運至本實驗室，在冷庫中（（4±2）℃、相對濕度55%～65%）貯藏待用，共用果實150個。

LA購自上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品（純度70%，相對分子質(zhì)量278.44），于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450型紫外-可見光分光光度計 日本島津儀器有限公司；MT201型電子秤 深圳市美孚電子有限公司；H-1850R型高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Centri Vap真空離心濃縮儀 美國Labconco公司；ACQUITY Arc四元梯度超高效液相色譜儀 美國Waters公司；1510-04087型酶標儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；A11 basic S025型研磨機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；CX21FS1C型正置萬能顯微鏡 日本Olympus公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LA溶液的制備

取0.560 mL LA，用1 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液溶解，將LA乳液超聲振蕩（頻率68 kHz、功率900 W）40 s至乳白色，然后加無菌水攪拌并定容至2 000 mL，按前期實驗篩選結果配制成1 mmol/L母液[9]。

1.3.2 蘋果果實人工損傷及愈傷處理

果實從冷庫中取出回溫24 h，進行預處理（自來水清洗，體積分數(shù)1%次氯酸鈉溶液消毒，自來水二次清洗，晾干），之后在果實赤道部位用刮皮刀刮出3個圓形傷口（直徑15 mm、深1 mm），5 min后用1 mmol/L LA溶液浸泡處理10 min，以含微量乙醇（1 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液）的無菌水浸泡為對照。處理和對照果實于常溫（20～25 ℃、相對濕度80%～85%）避光條件下進行愈傷[3]。

1.3.3 愈傷效果評價

1.3.3.1 質(zhì)量損失率的測定

分別在果實愈傷的第0、0.5、1、3、5、7天稱量單果質(zhì)量，質(zhì)量損失率按式（1）計算[12]。每個處理9個果實，重復3 次。

1.3.3.2 病情指數(shù)的測定

配制1×105個/mL的P. expansum孢子懸浮液。分別于果實愈傷第0、1、3、5、7天在傷口處接種20 μL孢子懸浮液，放入聚乙烯保鮮袋后，于常溫（20～25 ℃、相對濕度80%～85%）避光條件下培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病級別[13]。病情指數(shù)按式（2）計算。每個處理9個果實，重復3 次。

式中：發(fā)病級別0、1、2、3、4、5級標準分別對應傷口表面0、0～25%、25%～50%、50%～75%、75%～100%和100%發(fā)病。

1.3.4 生化指標測定前取樣

在果實愈傷第0、0.5、1、3、5、7天用滅菌手術刀取傷口下2～3 mm厚的組織，液氮冷凍后用研樣機研磨，粉末裝入離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆肹3]。每個處理15個果實，重復3 次。

1.3.5 苯丙烷代謝關鍵酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活力的測定參照季悅等[14]的方法，以每分鐘OD290nm變化0.01為1個酶活力單位，PAL活力單位為U/gmf。肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力的測定參照王斌等[15]的方法，以每分鐘OD340nm變化0.01為1個酶活力單位，C4H活力單位為U/gmf。4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活力的測定參照Liu Yaoyao等[16]的方法，以每分鐘OD333nm變化0.01為1個酶活力單位，4CL活力單位為U/gmf。肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的測定參照Goffner等[17]的方法，以每分鐘OD340nm變化0.01為1個酶活力單位，CAD活力單位為U/gmf。過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照Venisse等[18]的方法，以每分鐘OD470nm變化0.01為1個酶活力單位，POD活力單位為U/gmf。

1.3.6 4種酚酸和3種木質(zhì)素單體的含量測定

參照Gruz等[19]的方法。取1.0 g冷凍粉末，加3 mL體積分數(shù)70%甲醇溶液，常溫40 Hz超聲提取30 min，8 000×g離心20 min，上清液經(jīng)濃縮儀濃縮，1 mL甲醇復溶后過膜（0.22 μm微孔濾膜），將濾液移至自動進樣瓶，用Symmetry?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行四元梯度超高效液相色譜儀分析。液相色譜條件：以100%甲醇（A）和體積分數(shù)1%乙酸溶液（B）為流動相。按0～10 min 30% A、70% B，10～12 min 45% A、55% B，12～15 min 65% A、35% B，15～18 min 30% A、70% B，18～20 min 30% A、70% B，18～20 min 30% A、70% B以0.8 mL/min流速、5 μL進樣量進行梯度洗脫。根據(jù)325 nm波長處吸光度檢測芥子酸和咖啡酸，276 nm波長處吸光度檢測肉桂酸，322 nm波長處吸光度檢測阿魏酸，273 nm波長處吸光度檢測肉桂醇和芥子醇，263 nm波長處吸光度檢測松柏醇。通過對比標準化合物的保留時間進行定性。以標準曲線計算樣品中各酚酸和木質(zhì)素單體的質(zhì)量濃度，4種酚酸和3種木質(zhì)素單體含量均以μg/gmf表示。

1.3.7 總酚和類黃酮含量的測定

參照Scalbert[20]和Cvek[21]等的分光光度法，分別在760 nm和510 nm波長處測定吸光度并計算總酚含量和類黃酮含量。其中，總酚含量的計算：以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線方程計算，結果以每100 g樣品所含沒食子酸質(zhì)量計，單位為mg/100 gmf；類黃酮含量的計算：以兒茶素為標準品繪制標準曲線，通過標準曲線方程計算，結果以每100 g樣品所含兒茶素質(zhì)量計，單位為mg/100 gmf。

1.3.8 木質(zhì)素和H2O2含量的測定

木質(zhì)素含量參照Morrisson等[22]的方法進行測定，單位為OD280nm/gmf。H2O2含量參照Prochazkova等[23]的方法進行測定，單位為μmol/gmf。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各項指標測定至少重復3 次。全部數(shù)據(jù)用Excel 2019軟件計算平均值±標準差，用SPSS 21.0軟件進行t檢驗（以P＜0.05表示差異顯著）及皮爾遜相關性分析，用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 LA處理對愈傷期間蘋果果實質(zhì)量損失率和病情指數(shù)的影響

LA處理顯著抑制了愈傷期間損傷果實的質(zhì)量損失（P＜0.05），第3天時低于對照組32.48%（圖1A）。LA處理還顯著降低了損傷接種果實的病情指數(shù)（P＜0.05），第3天時低于對照組39.58%（圖1B）。上述結果表明，LA處理促進了蘋果果實的愈傷。

圖1 LA處理后損傷果實質(zhì)量損失率（A）和損傷接種果實病情指數(shù)（B）的變化Fig. 1 Changes in mass loss (A) of wounded fruit and disease index (B)of inoculated fruit after treated with LA

2.2 LA處理對愈傷期間果實傷口處PAL、C4H、4CL和CAD活力的影響

苯丙烷代謝關鍵酶活力決定酚類物質(zhì)的合成水平。愈傷期間，LA處理顯著提高了果實傷口處的PAL活力（P＜0.05），第5天時LA處理果實的PAL活力高出對照87.39%（圖2A）。LA處理顯著提高了果實傷口處的C4H活力（P＜0.05），第0.5天時高出對照57.21%（圖2B）。LA處理還顯著提高了4CL和CAD活力（P＜0.05），4CL活力在第3天時高出對照3.84%（圖2C），CAD活力在第3天時高出對照50.24%（圖2D）。上述結果表明，LA處理提高了果實傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD活性。

圖2 LA處理后果實傷口處PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）的活力變化Fig. 2 Changes in PAL (A), C4H (B), 4CL (C) and CAD (D) activities at wounds of fruit treated with LA

2.3 LA處理對愈傷期間果實傷口處4種酚酸以及總酚和類黃酮含量的影響

酚酸、總酚及類黃酮是苯丙烷代謝的重要產(chǎn)物。LA處理提高了愈傷期間果實傷口處的芥子酸、阿魏酸、肉桂酸和咖啡酸含量，分別在第5、3、7天和第0.5天時高出對照23.08%、22.24%、7.13%和21.17%（圖3A～D），處理果實傷口處的總酚和類黃酮含量也顯著高于對照（P＜0.05），第5天時分別高出對照7.06%和27.99%（圖3E、F）。上述結果表明，LA處理促進了果實傷口處芥子酸、阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、總酚和類黃酮的合成。

圖3 LA處理后果實傷口處芥子酸（A）、阿魏酸（B）、肉桂酸（C）、咖啡酸（D）、總酚（E）和類黃酮（F）含量的變化Fig. 3 Changes in contents of erucic acid (A), ferulic acid (B), cinnamic acid (C), caffeic acid (D), total phenols (E) and flavonoids (F) at wounds of fruit treated with LA

2.4 LA處理對愈傷期間果實傷口處松柏醇、肉桂醇、芥子醇和木質(zhì)素含量的影響

LA處理提高了果實傷口處的松柏醇含量，第7天時高出對照18.98%（圖4A）。LA處理顯著提高了果實傷口處的肉桂醇和芥子醇含量（P＜0.05），第7天時分別高出對照16.47%（圖4B）和30.43%（圖4C）。LA處理還提高了果實傷口處的木質(zhì)素含量，第5天時高出對照1.00%（圖4D）。上述結果表明，LA處理促進了果實傷口處松柏醇、肉桂醇和芥子醇以及木質(zhì)素的合成。

圖4 LA處理后果實傷口處松柏醇（A）、肉桂醇（B）、芥子醇（C）和木質(zhì)素（D）含量的變化Fig. 4 Changes in coniferyl alcohol (A), cinnamyl alcohol (B), sinapyl alcohol (C) and lignin (D) contents at wounds of fruit treated with LA

2.5 LA處理對愈傷期間果實傷口處H2O2含量和POD活力的影響

愈傷期間，LA處理果實傷口處的H2O2含量先升高后降低再升高，第1天時LA處理果實傷口處H2O2含量高出對照28.29%（圖5A）。愈傷期間，LA處理顯著提高了果實傷口處的POD活力（P＜0.05），第5天時LA處理果實傷口處的POD活力高出對照86.19%（圖5B）。上述結果表明，LA處理提高了果實傷口處的H2O2含量以及POD活力。

圖5 LA處理后果實傷口處H2O2含量（A）和POD活力（B）的變化Fig. 5 Changes in H2O2 content (A) and POD activity (B) at wounds of fruit treated with LA

2.6 木質(zhì)素含量與質(zhì)量損失率和病情指數(shù)間的相關性分析結果

由表1可知，木質(zhì)素含量與質(zhì)量損失率之間具有顯著正相關性（r＝0.802），木質(zhì)素含量與病情指數(shù)之間具有極顯著負相關性（r＝-0.866）。上述結果表明，LA處理主要通過促進愈傷期間果實傷口處木質(zhì)素的沉積來降低蘋果果實的質(zhì)量損失率和病情指數(shù)。

表1 木質(zhì)素含量與質(zhì)量損失率和病情指數(shù)間的相關性Table 1 Correlation among mass loss, disease index and lignin content

3 討 論

苯丙烷代謝既可為愈傷組織的形成提供底物，又可產(chǎn)生具有抗菌和抗氧化活性的酚類物質(zhì)[24]。PAL催化苯丙烷代謝的第一步反應，將L-苯丙氨酸脫氨轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸[25]。反式肉桂酸在C4H的催化下可生成多種酚酸[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，LA處理激活了愈傷期間蘋果果實傷口處的PAL和C4H活性（圖2），增加了4種酚酸的含量（圖3）。該結果與LA處理提高馬鈴薯塊莖PAL活性以及酚類物質(zhì)含量的結果[27]類似。4CL是苯丙烷代謝過程中控制形成不同木質(zhì)素單體的酶，能夠調(diào)控木質(zhì)素單體的合成[28]。4CL以C4H的催化產(chǎn)物酚酸類物質(zhì)為底物，生成相應的酚酸-輔酶A，這些酚酸-輔酶A在肉桂酰輔酶A還原酶的催化下形成松柏醛、肉桂醛和芥子醛，通過CAD將相應的醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為松柏醇、肉桂醇和芥子醇等木質(zhì)素單體[29]。本研究還發(fā)現(xiàn)，LA處理提高了愈傷期間果實傷口處的4CL和CAD活性（圖2），增加了松柏醇、肉桂醇和芥子醇的含量（圖4）。有研究表明，LA是植物體內(nèi)脂氧合酶途徑的底物[30]。當植物受到逆境脅迫時，磷脂酶A2被激活，水解磷脂釋放LA，LA經(jīng)十八烷酸途徑進一步合成茉莉酸（jasmonate，JA）[31-32]。有研究發(fā)現(xiàn)，LA處理可提高葡萄果實內(nèi)源JA和脫落酸含量[33]；也有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的JA可誘導PAL、幾丁質(zhì)酶等的表達[34]；此外，JA還可促進煙草植株中酚類化合物的積累[35]。因此推測，LA可能先參與了果實傷口處JA的合成，然后JA作為信號分子激活了苯丙烷代謝。

木質(zhì)素主要由松柏醇、芥子醇和香豆醇3種單體通過碳-碳鍵、醚鍵和酯鍵聚合而成[36]，該過程需要H2O2和POD的參與[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，LA處理提高了果實傷口處的H2O2含量和POD活性（圖5），促進了木質(zhì)素合成（圖4）。愈傷期間的H2O2主要來源于NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX），NOX通過轉(zhuǎn)移NADPH的電子給O2產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子在超氧化物歧化酶作用下很快歧化成H2O2[38]。有報道表明，JA可提高擬南芥葉片中H2O2的含量[39]。據(jù)此推測，LA可通過調(diào)控內(nèi)源JA的生成來促進H2O2產(chǎn)生，至于LA如何調(diào)控H2O2的積累有待進一步研究。

木質(zhì)素是果實傷口處愈傷組織的主要成分，具有強化細胞壁、增加機械強度、維持植物細胞壁結構完整性、形成物理屏障以阻隔病原菌的作用[40]。相關性分析結果表明，LA處理果實傷口處的木質(zhì)素含量與質(zhì)量損失率和病情指數(shù)分別呈顯著正相關和極顯著負相關（r＝0.802，r＝-0.866），因此認為，LA處理主要通過促進果實傷口處木質(zhì)素的沉積來降低愈傷期間果實的質(zhì)量損失率和病情指數(shù)。此外，處理果實病情指數(shù)的降低還與傷口處總酚和類黃酮含量的增加有關（圖3E、F），這些酚類化合物具有抗菌活性[22]，對真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長具有明顯的抑制效果[41]。由于LA處理對P. expansum的菌落生長無顯著影響，故可知處理果實病情指數(shù)的降低是LA激活苯丙烷代謝導致酚酸和類黃酮積累的結果。

4 結 論

LA處理提高了蘋果果實傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD活力，促進了芥子酸、阿魏酸、肉桂酸和咖啡酸以及松柏醇、肉桂醇和芥子醇的合成，增加了總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量。此外，LA處理還提高了果實傷口處的H2O2含量和POD活力。上述木質(zhì)素單體在H2O2和POD的共同作用下聚合成木質(zhì)素在傷口處沉積，從而顯著降低了愈傷期間損傷果實的質(zhì)量損失率和損傷接種果實的病情指數(shù)，促進了蘋果果實愈傷。鑒于LA處理對蘋果果實愈傷的良好促進效果，可考慮將其作為一種果實促愈劑進行開發(fā)。由于LA促進果實愈傷的機理涉及多種代謝及傷口處的組織結構變化，尚需進一步深入研究。