門德盈，代佳和,2,3，湯木果，劉俐彤，田 洋,2,3,4，陶 亮,2,3,4,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201；4.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南 昆明 650201）

核桃（Juglans regiaL.）又稱胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界“四大干果”[1]，其營養(yǎng)成分豐富，開發(fā)潛力巨大。中國已成為世界上最大的核桃種植和生產(chǎn)國，其中種植區(qū)域主要分布在我國的華北、華中、華南、華東地區(qū)以及西北、西南地區(qū)[2]，因其獨(dú)特的口味和豐富的營養(yǎng)價(jià)值備受世人喜愛[3-4]。研究表明，核桃的食用價(jià)值和保健功效顯著[5]。核桃中脂肪相對含量高達(dá)52%～74%[6]，可用于制備核桃油（主要含不飽和脂肪酸），深受消費(fèi)者喜愛且需求量不斷增加，核桃粕是核桃榨油的副產(chǎn)物，其富含優(yōu)質(zhì)植物蛋白，蛋白相對含量可達(dá)43.8%[7]。核桃粕蛋白含有20種氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸，是一種可為人體提供豐富氨基酸的植物源蛋白原料[8]。

核桃粕優(yōu)質(zhì)蛋白含量高，但常被當(dāng)作廢棄物直接丟棄或者生產(chǎn)低價(jià)值飼料，綜合利用率低。在一定程度上，核桃粕利用不充分既嚴(yán)重阻礙了核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展又造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。生物活性肽是對生物機(jī)體生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物，其分子質(zhì)量一般小于6 000 Da[9]，大多由兩個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸通過肽鍵組成[10]。因其具有多種生物學(xué)功能，在國際食品工業(yè)中，生物活性肽是最熱門的研究主題和最具發(fā)展?jié)摿Φ墓δ芤蜃又籟11]。因此，為了充分利用核桃粕資源，大量研究者基于核桃粕蛋白研究制備不同功效的核桃肽。核桃肽具有多種生物活性，如抗氧化[12]、益智[13]、增強(qiáng)免疫力[14]等，同時(shí)核桃肽可以解決食品開發(fā)中核桃蛋白溶解性差等的技術(shù)瓶頸，基于核桃肽開發(fā)個(gè)性化健康食品具有廣闊的市場前景。

目前，關(guān)于核桃肽的研究主要集中在蛋白肽的制備方法、活性研究等方面，研究者從不同的研究目標(biāo)、技術(shù)模式、功能作用等方面對核桃肽進(jìn)行了不同程度探索，核桃蛋白作為植物蛋白和堅(jiān)果類蛋白的典型代表，具有重要的研究價(jià)值，開展核桃肽資源基礎(chǔ)研究及技術(shù)開發(fā)可為同類植物資源的挖掘與應(yīng)用提供重要參考。為促進(jìn)開展核桃肽制備技術(shù)及功能活性作用機(jī)制方面的深入研究，本文梳理、總結(jié)前人在核桃肽的制備、分離純化、鑒定及生物活性方面的研究現(xiàn)狀，旨在為核桃粕蛋白資源的高值化利用及核桃肽的深入研究提供理論參考。

1 核桃肽的制備

從植物中制備生物活性肽主要有化學(xué)法、酶解法、發(fā)酵法等。其中，化學(xué)法是指在特定溫度條件下，通過化學(xué)試劑將連接氨基酸的肽鏈斷裂，使蛋白質(zhì)分子形成小分子肽的方法[15]，包括酸水解法和堿水解法。酸水解法的成本雖低，但會完全破壞色氨酸，使部分蛋氨酸消失，酰胺（谷氨酰胺、天冬酰胺）轉(zhuǎn)化為氨基酸；堿水解法具有廉價(jià)和色氨酸回收率高的優(yōu)點(diǎn)，但存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題[16]?；瘜W(xué)法雖具有易操作、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，但其提取率低、反應(yīng)過程不易控制、環(huán)境污染較為嚴(yán)重且經(jīng)濟(jì)效益低，因此其不適用于現(xiàn)代工業(yè)化核桃肽的生產(chǎn)。目前多采用酶解法和發(fā)酵法從核桃粕中制備生物活性肽。

1.1 酶解法

由于蛋白酶具有特異性、高效性、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程易控制和營養(yǎng)損失少、無有害物質(zhì)產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，酶解法被廣泛應(yīng)用于制備核桃肽。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求，蛋白酶的選擇顯得尤為重要（來源廣泛、價(jià)格低廉等），目前制備核桃肽常用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等[17-18]。酶作為具有生理活性的特殊蛋白，具有不同的活性位點(diǎn)和專一性，相同的蛋白雖可被不同蛋白酶水解，但其水解效果具有一定差異。即使同一種蛋白酶水解相同的蛋白質(zhì)，在不同的反應(yīng)條件和水解程度下，其水解效果也存在差異，這主要是由蛋白酶的不同水解位點(diǎn)、酶活力差異造成的，同時(shí)也受到酶解條件的影響，如pH值、反應(yīng)時(shí)間、溫度、料液比、酶與底物濃度比等，研究和調(diào)控酶解條件對于制備核桃肽具有十分重要的意義。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，對常用蛋白酶的適宜酶解條件及作用位點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)（表1），可為酶解條件優(yōu)化及目標(biāo)肽的制備提供參考。

表1 常見水解酶的最適酶解條件及作用點(diǎn)[19-21]Table 1 Optimal reaction conditions and action sites of common hydrolases[19-21]

核桃蛋白因其具有立體結(jié)構(gòu)緊密、水解位點(diǎn)多位于蛋白質(zhì)內(nèi)部等特點(diǎn)，導(dǎo)致核桃蛋白溶解性差、水解率低，采用物理輔助酶解技術(shù)可取得較好的酶解效果，因此超聲波輔助酶解法受到廣泛的關(guān)注。研究表明，超聲波輔助酶解核桃蛋白在反應(yīng)特性和能量效率方面具有積極的影響，超聲波輔助酶解和超聲波預(yù)處理后酶解都能夠明顯提高核桃肽的水解度[22-23]。除超聲波輔助技術(shù)外，高壓均質(zhì)、微波等輔助酶解法已成功應(yīng)用于制備大豆[24]、茶樹[25]等植物源生物活性肽中，但在核桃粕制備生物活性肽的工藝中應(yīng)用較少，在未來的研究中可考察高壓均質(zhì)及微波輔助酶解對核桃肽水解度的影響。

1.2 發(fā)酵法

生物活性肽的發(fā)酵法制備是指利用微生物產(chǎn)生的酶水解蛋白質(zhì)，從而制備生物活性肽的一種方法[26]。目前，發(fā)酵法主要分為液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。液態(tài)發(fā)酵因發(fā)酵均勻、發(fā)酵條件（溫度、pH值、無菌條件）易于控制，長期以來受到人們的青睞；與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵則具有產(chǎn)量高、能耗小、來源廣泛、操作相對簡單等特點(diǎn)[27]。在固態(tài)發(fā)酵中，微生物處于野生狀態(tài)，具有產(chǎn)生液態(tài)發(fā)酵無法產(chǎn)生的酶及其他代謝產(chǎn)物的獨(dú)特優(yōu)勢[28]，因此逐漸受到人們的重視。實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵制備通常與酶解法結(jié)合使用制備生物活性肽，不僅可以降低活性肽的生產(chǎn)成本，也可在生產(chǎn)中起到原料解毒和脫苦的作用。發(fā)酵制備生物活性肽可有效促進(jìn)蛋白質(zhì)資源的高效利用和生物活性肽的安全生產(chǎn)。近幾年，眾多學(xué)者開展了發(fā)酵制備核桃肽的工藝研究。高瑞雄等[29]通過液態(tài)發(fā)酵利用納豆芽孢桿菌處理核桃粕制備核桃肽并進(jìn)行工藝優(yōu)化，所得最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間84 h、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、起始pH 8.0、接種量11%和發(fā)酵溫度33 ℃。此條件下，核桃肽的質(zhì)量濃度能夠達(dá)到2.58 mg/mL，水解度達(dá)到37.5%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌發(fā)酵效果顯著優(yōu)于黑曲霉和枯草芽孢桿菌，是液態(tài)發(fā)酵制備核桃肽的潛在優(yōu)勢菌。劉瀟等[30]通過固態(tài)發(fā)酵用黑曲霉和枯草芽孢桿菌處理核桃粕制備核桃肽，結(jié)果顯示黑曲霉和枯草芽孢桿菌的最佳工藝參數(shù)及產(chǎn)量存在差異，兩種菌發(fā)酵制備所得核桃肽的產(chǎn)量分別為158.61 mg/g和243.97 mg/g。對兩種菌制備核桃肽進(jìn)行分子質(zhì)量分布、肽及氨基酸含量差異比較分析，確定枯草芽孢桿菌更適合于固態(tài)發(fā)酵核桃粕制備高質(zhì)量核桃肽。雖然液態(tài)發(fā)酵相較固態(tài)發(fā)酵技術(shù)成熟，但是固態(tài)發(fā)酵卻具有更好的發(fā)酵過程、對環(huán)境更加友好以及成本效益更高等優(yōu)點(diǎn)[31]，在核桃肽制備方面可能具有更好的應(yīng)用前景。固態(tài)發(fā)酵制備過程基本如圖1所示。

圖1 制備核桃肽的固態(tài)發(fā)酵過程Fig. 1 Solid-state fermentation process for preparing walnut peptides

2 核桃肽的分離純化

采用酶解或發(fā)酵制備的核桃肽大多是由不同分子質(zhì)量的肽、大分子蛋白、不溶性底物及可溶性雜質(zhì)組成的復(fù)合物。目前，多采用超濾、色譜層析等技術(shù)進(jìn)行分離純化，以此獲得成分純度高的核桃肽。由于超濾和色譜層析各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究者通常會根據(jù)所需目標(biāo)肽的特性進(jìn)行聯(lián)用，分離純化第一步一般采用超濾技術(shù)，既可將大分子蛋白、蛋白酶及不溶性底物與肽分離還能通過不同孔徑的超濾膜將不同分子質(zhì)量的肽進(jìn)行分離。但超濾不能有效地將小分子質(zhì)量的肽和分子質(zhì)量十分相近的肽分離，需要通過色譜層析技術(shù)進(jìn)一步分離純化從而達(dá)到更好地分離純化效果。超濾與色譜層析技術(shù)聯(lián)用已在核桃肽分離純化的研究中成功運(yùn)用。Chen Yonghao等[32]通過超濾、Sephadex G-15柱層析技術(shù)從脫脂核桃粕中分離得到3種新型血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制肽。Feng Yanxia等[33]通過酶解隨后經(jīng)過超濾和Sephadex G-25柱層析分離純化制備酪氨酸酶抑制肽。Liu Mingchuan等[34]通過超濾技術(shù)以及色譜技術(shù)從核桃蛋白水解液中分離純化得到抗氧化肽。

在核桃肽的分離純化過程中，無論采用哪種技術(shù)都應(yīng)全面考慮目標(biāo)肽的各種特性，單一的分離純化技術(shù)可能不適用于目標(biāo)肽的分離純化。因此為了獲得更高質(zhì)量的核桃肽，未來可采用新的分離純化技術(shù)進(jìn)行核桃肽的分離純化，如等電聚焦電泳、毛細(xì)管電泳、分子印跡技術(shù)等；同時(shí)需全面優(yōu)化技術(shù)策略，考慮多種技術(shù)聯(lián)用。

3 核桃肽的鑒定

為進(jìn)一步探究核桃肽的活性機(jī)制，往往要將分離純化后的核桃肽進(jìn)行鑒定。氨基酸序列是組成肽和蛋白質(zhì)的基本單元結(jié)構(gòu)，不同氨基酸及其序列組成對肽的理化特性及生理活性具有重要影響。因此，采用高效、快捷的方法明確肽的氨基酸組成及序列對核桃肽理化特性及功能特性研究顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的Edman技術(shù)雖可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)N端序列的準(zhǔn)確分析[35]，但其測序時(shí)間長且靈敏性差已經(jīng)無法適用于實(shí)際研究及生產(chǎn)，質(zhì)譜技術(shù)及其他技術(shù)的聯(lián)合使用可以彌補(bǔ)Edman技術(shù)的不足。例如，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[36]、反相高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（reversed-phase highperformance liquid chromatography-electrosprary ionization-mass spectrometry，RP-HPLC-ESI-MS）[37]、超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（ultra high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）[38]、飛行時(shí)間-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（time-of-flight-liquid chromatography-tandem mass spectrometer，TOF-LC/MS/MS）[39]、超高效液相色譜-電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography electrospray ionization coupled with quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）[40]、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS）[41]這些串聯(lián)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核桃肽測序中。Gu Mu等[36]通過UPLC-MS/MS技術(shù)在核桃蛋白中鑒定出具有高抗氧化活性肽。Chen Ning等[37]通過RP-HPLC-ESI-MS技術(shù)鑒定出氨基酸序列為Ala-Asp-Ala-Phe的抗氧化核桃肽。Wang Shuguang等[38]通過UPLCQTOF-MS/MS技術(shù)鑒定出具有抗氧化活性的GGW、VYY、LLPF 3種抗氧化肽。Ma Sihui等[39]通過TOF-LC/MS/MS技術(shù)鑒定出具有抗癌活性的CTLEW核桃肽。Wang Cong等[40]通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)鑒定出具有ACE抑制作用的EPNGLLLPQY肽。Liu Meng等[41]通過MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定出了氨基酸序列為WPERPQIP的ACE抑制核桃肽?；诖?lián)質(zhì)譜的肽測序主要途徑是蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索，必須通過已知數(shù)據(jù)庫檢索候選肽序列，在未知肽的研究中失去其優(yōu)勢[42]。近年來，為解決串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在未知肽中的劣勢，科研人員研究出一種新的測序技術(shù)——從頭測序（de novo）。從頭測序在核桃肽氨基酸序列分析顯現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢，能夠?qū)θ狈蚧虻鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫的核桃蛋白進(jìn)行表征，測定出未知核桃肽，并且具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏性[43]。采用多種酶對核桃蛋白進(jìn)行酶解時(shí)，會導(dǎo)致核桃蛋白切割點(diǎn)多樣化，普通的鑒定技術(shù)無法正常使用，而從頭測序可以彌補(bǔ)普通鑒定技術(shù)的不足[44]，所以在采用多種蛋白酶水解核桃蛋白和研究未知核桃肽時(shí)，可考慮使用從頭測序技術(shù)進(jìn)行鑒定。

4 核桃肽的生物活性

核桃屬于藥食兩用資源，研究表明，核桃肽具有抗氧化性、保護(hù)心血管、抗癌等多種生物活性[45]。近年來，核桃粕作為一種潛在植物蛋白源越來越受到人們的青睞，許多研究者已開展了基于核桃或核桃粕蛋白制備核桃肽的研究，且篩選了系列活性肽，并探究其功能作用機(jī)制，相關(guān)研究結(jié)果如表2所示。

4.1 抗氧化活性

氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起人體衰老等各方面疾病的重要原因[52]，因此抗氧化劑的篩選、制備及應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注?？寡趸瘎┓N類繁多，除在食品加工中用作抗氧化劑外，在保健食品、化妝品和藥物開發(fā)中也起到了一定的功能作用。由于部分化學(xué)合成的抗氧化劑具有一定的毒副作用，天然抗氧化劑憑借其安全性備受研究者的關(guān)注。

抗氧化肽是一種具有抗氧化活性的生物活性肽，能夠有效消除人體內(nèi)因氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的ABTS陽離子自由基、羥自由基和DPPH自由基等以及過氧化物和活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的[53]。研究表明，肽的抗氧化活性與氨基酸類型、組成、分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等密切相關(guān)。含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸）對肽的抗氧化能力有較大的影響，堿性氨基酸（組氨酸、賴氨酸和精氨酸）的肽能抑制自由基引發(fā)的不飽和脂肪酸氧化[54]。分子質(zhì)量小于800 Da的核桃肽具有較多的疏水性氨基酸（Trp、Val、Phe、Leu、Ile、Ala、Met），抗氧化功效更好；此外，具有較高含量谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的肽，其抗氧化潛力更強(qiáng)[55]?，F(xiàn)階段，已有較多研究者從核桃蛋白水解產(chǎn)物中提取出高抗氧化活性的肽，探究和討論核桃肽的抗氧化作用及其分子機(jī)制，從而發(fā)掘其功能價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。Chen Huiping等[56]通過UPLC-ESI-MS/MS技術(shù)將核桃蛋白粕水解液進(jìn)行分離純化，并鑒定出77 條肽段，這些肽與還原型谷胱甘肽和腦溶素相比，具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力和ORAC，對H2O2損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，其中分離鑒定出肽WSREEQEREE和肽ADIYTEEAGR抗氧化能力最強(qiáng)。Gao Yawen等[57]研究核桃蛋白水解產(chǎn)物WEKPPVSH，通過測定目標(biāo)肽作用前后細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力變化，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)肽可以通過抑制脂多糖損傷細(xì)胞的ROS生成，提高CAT和SOD活力，從而發(fā)揮抗氧化作用。核桃肽的抗氧化機(jī)制目前并沒完全闡明，還需進(jìn)一步探究。圖2顯示了核桃肽部分抗氧化機(jī)制。

表2 核桃肽的提取工藝及生物活性Table 2 Extraction parameters and biological activity of walnut protein peptides

圖2 核桃肽的抗氧化機(jī)制Fig. 2 Antioxidant mechanisms of walnut peptides

4.2 心血管保護(hù)活性

食源性肽對心血管保護(hù)的活性主要體現(xiàn)在抗高血壓活性方面[58]。高血壓的特點(diǎn)是血壓升高，血管結(jié)構(gòu)和心臟功能發(fā)生異常，造成靶器官（心臟、腎臟、大腦、血管）進(jìn)一步損害，導(dǎo)致過早發(fā)病甚至死亡[59]。ACE通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein kinin system，KKS）在機(jī)體血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[40]。ACE抑制肽能夠抑制ACE活性，促進(jìn)血管舒張、減少血容量并降低血壓，在抗高血壓方面起到重要的生理作用，從核桃中提取的ACE抑制肽的作用機(jī)制如圖3所示。目前部分患者服用人工合成的ACE抑制藥物會產(chǎn)生干咳、味覺障礙以及皮疹等副作用[60]。食品源ACE抑制肽具有生物活性高、毒性低、在人體易于代謝等特點(diǎn)[61]，核桃蛋白ACE抑制肽是食物來源ACE抑制肽研發(fā)的潛在目標(biāo)對象。

圖3 核桃ACE抑制肽對RAS系統(tǒng)和KKS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制Fig. 3 Regulatory mechanisms of ACE-inhibiting peptide from walnut on RAS system and KKS system

Liu Dandan等[62]研究發(fā)現(xiàn)，混合核桃肽具有降壓作用，其機(jī)制是通過抑制組織中ACE活性和調(diào)節(jié)血清中內(nèi)皮源性血管收縮因子（endothelium-derived contracting factors，EDCFs）和舒張因子（endothelium-derived relaxing factors，EDRFs）的水平來調(diào)節(jié)RAS和KKS的平衡。據(jù)報(bào)道，核桃蛋白水解液能夠顯著降低高血壓小鼠的收縮壓，具有較強(qiáng)的ACE抑制活性和穩(wěn)定性[63]。Wang Fengjun等[63]用胃蛋白酶酶解核桃蛋白，分離純化后發(fā)現(xiàn)ACE抑制活性最強(qiáng)的核桃肽，其氨基酸序列為Tyr-Val-Pro-His-Trp-Asp-Leu，分子質(zhì)量為929 Da，可在胃腸消化時(shí)保持相對穩(wěn)定，研究結(jié)果表明，ACE抑制肽的鏈長、氨基酸組成、氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)對ACE抑制活性具有一定影響，長肽很難與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合，含有2～10個(gè)氨基酸的短肽具有更強(qiáng)的ACE抑制活性[64]。在許多情況下，氨基酸組成和序列對ACE抑制肽活性的影響比肽鏈長度更重要，ACE抑制肽普遍含有脯氨酸、賴氨酸或芳香族氨基酸殘基，ACE抑制肽活性會受到C端序列的強(qiáng)烈影響，而C端的疏水性氨基酸會使它的抑制活性更高[64]。以上研究對從核桃蛋白水解產(chǎn)物中篩選潛在高效ACE抑制肽具有重要的指導(dǎo)意義。

4.3 抗癌活性

目前臨床上使用的抗癌藥物普遍具有嚴(yán)重的副作用，而抗癌肽因其分子質(zhì)量小、靶向性好等諸多優(yōu)勢，為癌癥治療提供了一種新思路[65]。抗癌肽可通過多種途徑發(fā)揮其抗癌作用（圖4）。科學(xué)研究已證實(shí)核桃成分的細(xì)胞毒性在對抗人類癌癥細(xì)胞中發(fā)揮一定作用，如核桃酚提取物[66]、核桃的氯仿提取物[67]等，核桃肽抗癌活性的相關(guān)報(bào)道也在逐年增加。

圖4 核桃抗腫瘤肽潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制Fig. 4 Potential regulatory mechanisms of antitumor peptides from walnut

Ma Sihui等[39]用胃蛋白酶、色素酶pp、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶這5種酶對核桃蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶獲得的水解物在質(zhì)量濃度25 μg/mL時(shí)對癌細(xì)胞UACC62（黑色素瘤）具有抑制作用，胃蛋白酶和色素酶pp的水解物在質(zhì)量濃度0～25 μg/mL范圍內(nèi)以劑量依賴性方式對抗癌細(xì)胞UACC62，風(fēng)味蛋白酶獲得的水解物在質(zhì)量濃度167 μg/mL時(shí)對癌細(xì)胞U251（SNC）具有抑制作用。Wilman等[68]通過酶解核桃蛋白制備核桃肽，并經(jīng)分離純化確定氨基酸序列為Cys-Thr-Leu-Glu-Trp的肽具有較好的抗癌潛質(zhì)。有學(xué)者研究核桃肽與鋅復(fù)合物的抗癌活性，通過鋅-氮（Zn-N）和鋅-氧（Zn-O）共價(jià)鍵使核桃肽與鋅離子結(jié)合，結(jié)果表明鋅離子與核桃肽具有協(xié)同抗癌作用，核桃肽-鋅復(fù)合物通過ROS觸發(fā)線粒體和細(xì)胞表面受體參與途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡[69]。核桃蛋白與姜黃素復(fù)合物[70]、功能化硒納米顆粒雜化物[71]能夠增強(qiáng)核桃肽的抗癌活性。這種新方式也為核桃肽抗癌活性的研究開辟了新思路，同時(shí)拓寬了核桃肽的利用價(jià)值。

4.4 改善記憶

記憶力下降主要是由β-淀粉樣肽（Aβ）積淀、膽堿能系統(tǒng)功能紊亂、谷氨酸含量過高、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)引起[72]。研究表明，改善記憶肽的低分子質(zhì)量肽和疏水性肽都表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護(hù)活性[38,73]。核桃肽具有良好的改善記憶活性，Wang Shuguang等[73]研究核桃水解產(chǎn)物對東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知和記憶障礙小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果表明，核桃蛋白水解產(chǎn)物可顯著改善認(rèn)知和記憶障礙小鼠的行為，使小鼠腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)紊亂和氧化應(yīng)激水平恢復(fù)正常，隨后對水解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)肽FY和SGFDAE具有最強(qiáng)的保護(hù)活性。核桃中含量較高的精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸（具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，劑量過高則表現(xiàn)出抑制作用）能夠增強(qiáng)核桃肽的改善記憶功效[74]。此外，核桃中的強(qiáng)抗氧化肽也對記憶改善有積極作用，Zou Juan等[75]研究發(fā)現(xiàn)，核桃肽通過對抗氧化應(yīng)激和減輕炎癥反應(yīng)，對Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙起到保護(hù)作用，核桃衍生肽PW5也可改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知障礙[76]。核桃肽具有一定的神經(jīng)保護(hù)功能，未來可針對阿爾茨海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病以及改善記憶等問題進(jìn)行深入研究，以開發(fā)高效、低副作用或無副作用的記憶改善性核桃肽產(chǎn)品。

4.5 抗菌活性

某些天然肽具有高效殺菌特性，這些抗菌肽通過與細(xì)胞穿透肽偶聯(lián)對細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，從而達(dá)到更好的殺菌效果（圖5），同時(shí)抗菌肽-細(xì)胞穿透肽偶聯(lián)可以抵抗微生物攻擊[77]，因此能夠極大程度地降低細(xì)菌耐藥性[78]。目前，在核桃蛋白水解產(chǎn)物中已提取出具有抗菌活性的肽，如劉東偉等[21]制備的核桃蛋白胃蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解產(chǎn)物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌都具有一定的抑菌性，其中胃蛋白酶水解產(chǎn)物的抑菌圈直徑大于0.7 mm，表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌活性。隨后通過超濾處理胃蛋白酶水解液，并獲得4個(gè)不同分子質(zhì)量范圍的濾液，其中分子質(zhì)量3～10 kDa的酶解粗肽對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為11 mm，大腸桿菌為10.5 mm，金黃色葡萄球菌為13 mm，優(yōu)于其他3個(gè)分子質(zhì)量范圍粗肽的抑菌效果。抑菌性核桃肽的篩選和特性研究可為新型抗生素替代品以及食品級抗菌劑研發(fā)提供新思路。

圖5 偶聯(lián)細(xì)胞穿透肽提高抗菌肽功效[79]Fig. 5 Coupling to cell-penetrating peptides (CPP) enhances the efficacy of antimicrobial peptides (AMP)[79]

5 其他活性

5.1 調(diào)節(jié)代謝異常

Li Qingyong等[50]發(fā)現(xiàn)核桃肽在尿酸代謝中具有積極作用，在核桃蛋白水解產(chǎn)物中分離純化得到肽WPPKN（640.8 Da）和肽ADIYTE（710.7 Da）能夠降低血清尿酸，具有作為治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的功能性食品成分的潛力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含色氨酸的核桃活性肽能有效抑制黃嘌呤氧化酶，且色氨酸含量與核桃活性肽的抑制活性呈線性相關(guān)。在脂代謝中，有研究表明核桃肽可以降低肝臟和附睪脂肪質(zhì)量（高脂飲食誘導(dǎo)）的增加，并降低血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇及肝臟中膽固醇和甘油三酯的含量，減少肝脂肪變性，并且能夠降低體質(zhì)量并改善脂質(zhì)代謝紊亂以及肝臟脂肪積累所帶來的危害[20]。李麗等[80]通過釀酒酵母模型和2型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核桃肽具有一定的降糖功效，并且核桃肽的降糖功效優(yōu)于核桃蛋白。在骨代謝中，Dai Jiahe等[81]研究發(fā)現(xiàn)核桃肽與鈣的螯合物可通過調(diào)節(jié)TRPV6信號通路促進(jìn)鈣的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，核桃肽與鈣螯合應(yīng)用可有效提高骨密度，促進(jìn)骨形成，從而達(dá)到更好地預(yù)防缺鈣和保持骨代謝平衡的功效。

5.2 促進(jìn)人體防御反應(yīng)

Xu Defeng等[82]研究發(fā)現(xiàn)核桃蛋白水解產(chǎn)物中肽WSREQREE和ADIYTEEAGR具有改善皮膚光老化的活性，其潛在機(jī)制可能是通過逆轉(zhuǎn)炎癥失衡、抑制核因子κB信號通路激活、刺激I型前膠原合成和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性協(xié)同調(diào)節(jié)。研究表明，核桃小分子寡肽具有胃保護(hù)活性，通過降低胃潰瘍指數(shù)、增強(qiáng)前列腺素E2表達(dá)和抗氧化能力、抑制髓過氧化物酶活力和促炎因子的表達(dá)，從而減輕乙醇對胃黏膜的損傷[83]。核桃肽在免疫調(diào)節(jié)方面具有一定的研發(fā)潛質(zhì)，如楊勝杰等[84]通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，核桃肽通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10和IL-17A這兩種炎癥因子表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用；Li Jing等[85]研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白水解產(chǎn)物對小鼠的免疫系統(tǒng)具有增強(qiáng)作用，并且以劑量依賴的方式發(fā)揮潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，中等劑量的核桃蛋白水解肽即可實(shí)現(xiàn)持續(xù)性的免疫調(diào)節(jié)。

5.3 抗癲癇

Raheleh等[86]研究發(fā)現(xiàn)核桃肽以劑量依賴性方式對戊四唑和化學(xué)點(diǎn)燃誘發(fā)的癲癇閾值具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其功效機(jī)制是通過調(diào)節(jié)苯二氮卓受體發(fā)揮其抗癲癇作用。

5.4 潤腸通便

張亭等[87]研究鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘小鼠模型發(fā)現(xiàn)，核桃肽具有潤腸通便的功效，其功效機(jī)制可能與核桃肽促進(jìn)小鼠血清中胃腸激素（內(nèi)毒素、胃動(dòng)素）和抑制生長激素釋放，進(jìn)而抑制激素表達(dá)有關(guān)。

6 結(jié) 語

基于核桃粕制備核桃功能肽已引起世界各國科研人員及政府的高度關(guān)注，核桃肽的制備方法、分離純化、鑒定及功效作用的研究得到快速發(fā)展，眾多核桃肽被開發(fā)，核桃肽的功能保健作用機(jī)制（抗氧化、心血管保護(hù)、抗癌、記憶改善等）也逐漸清晰。部分核桃肽已用于保健食品的開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。

然而，核桃肽的研究還處于發(fā)展階段，還有許多研究工作需要開展。核桃肽的制備以及分離純化工藝，影響其最終加工產(chǎn)品的性能及功效，在制備工藝等方面的研究需更加精細(xì)化，可為準(zhǔn)確生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)核桃肽產(chǎn)品提供基礎(chǔ)保障。核桃肽的活性研究較多，但只有少部分核桃肽的生物活性研究較為深入，距離產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用較遠(yuǎn)。核桃肽生物活性研究主要體現(xiàn)在其提取制備工藝、肽氨基酸組成及序列、相對分子質(zhì)量、生物活性作用機(jī)制等方面?？寡趸⑿难鼙Ｗo(hù)、輔助改善記憶等較為成熟的生物活性研究也僅是停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，后期需要加強(qiáng)臨床實(shí)驗(yàn)研究，明確核桃肽在人體代謝與作用情況。在核桃肽保健食品、特膳食品、特醫(yī)食品的開發(fā)中，過度的關(guān)注了其功能作用及潛在的健康、醫(yī)學(xué)價(jià)值，與實(shí)際的產(chǎn)品研發(fā)存在一定的脫節(jié)，在核桃活性蛋白肽的高效提取制備、定量獲取、活性改造、靶向吸收代謝、生物利用度等方面缺乏研究，同時(shí)忽略了加工的可操作性及成本對產(chǎn)品研發(fā)及市場推廣的重要指導(dǎo)意義，導(dǎo)致絕大部分產(chǎn)品仍停留在研究階段或者實(shí)驗(yàn)階段，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。隨著現(xiàn)代食品技術(shù)的飛速發(fā)展，著眼于核桃肽功能營養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化的研究將不斷深入，核桃肽產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用必將助推核桃產(chǎn)業(yè)的綜合利用技術(shù)發(fā)展及實(shí)現(xiàn)核桃的高值化利用。