林佳琦， 李燕培， 肖世祥， 馮 斗， 禤維言

(廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 南寧 530005 )

香蕉是芭蕉科的高大草本植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。香蕉產(chǎn)業(yè)是種植地區(qū)和國家的重要經(jīng)濟(jì)來源之一(Singh et al., 2016)，在我國華南地區(qū)香蕉產(chǎn)業(yè)是僅次于柑橘的第二大重要水果產(chǎn)業(yè)。在生產(chǎn)過程中，尤其是在沿海地區(qū)，由于香蕉植株高大、冠幅重、抗風(fēng)性能差，遭遇臺風(fēng)或熱帶風(fēng)暴危害時容易出現(xiàn)嚴(yán)重的倒伏現(xiàn)象，使香蕉產(chǎn)業(yè)遭受重大損失(舒海燕等，2016)。株高是影響作物抗倒伏和豐產(chǎn)性能的重要農(nóng)藝性狀，作物越高、冠幅越大其抗倒伏性能越差(張瑞茂等，2019)。因此，篩選和創(chuàng)制優(yōu)良的矮化新品種和新種質(zhì)是當(dāng)前育種的重要目標(biāo)。然而，目前由于香蕉的栽培品種和野生資源多數(shù)是三倍體或四倍體，高度不育，很難通過雜交技術(shù)改良矮化其株高性狀。但是，通過轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)可以改良或創(chuàng)制矮化的香蕉新品系或新種質(zhì)(崔霞和張率斌，2017；王福軍和趙開軍，2018；李樹磊等，2020)；而采用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)途徑進(jìn)行香蕉株高矮化方面的分子育種，首先必須研究清楚香蕉株高生長調(diào)控的機(jī)制和挖掘與香蕉矮化相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因。

植物的株高生長主要受內(nèi)源激素影響，其中赤霉素(gibberellin，GA)是植物生長發(fā)育過程中對株高伸長生長影響最大的激素(楊益善等，2015；范業(yè)賡等，2019)。目前，已鑒定的赤霉素有136種，其中具有生物活性的赤霉素有GA1、GA3、GA4、GA7(Hedden & Thomas, 2012)。這些具有生物活性的赤霉素在植物生長發(fā)育各個階段都發(fā)揮著重要作用，如葉片伸展、莖的伸長、果實發(fā)育等(Hu et al., 2018)。許多植物的株高受赤霉素(GAs)生物合成和代謝過程中相關(guān)酶基因的調(diào)控，如古巴焦磷酸合成酶基因(copay diphospate synthase，CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶基因(kaurene synthase，KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶基因(kaurene oxidase，KO)、GA3氧化酶基因(GA3 oxidation enzyme，GA3ox)和GA2氧化酶基因(GA2 oxidation enzyme，GA2ox)等(Hedden & Pnillips, 2000; Yamaguchi, 2008)。目前，大多數(shù)赤霉素合成途徑的關(guān)鍵酶基因在多種植物中已被研究和鑒定，如在擬南芥(Helliwel et al., 1998)、玉米(Chen et al., 2014)、水稻(Ashikari et al., 2002; Sasaki et al., 2002)和豌豆(Ait-Ali et al., 1997; Davidson et al., 2004)等植物中都發(fā)現(xiàn)了許多由于赤霉素合成途徑中代謝酶基因的變異導(dǎo)致矮化表型的相關(guān)植株。因此，赤霉素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的研究在植物矮化機(jī)制中十分重要。

GA3-氧化酶(GA3ox)是活性赤霉素代謝途徑中最后步驟的關(guān)鍵酶，是由多基因家族編碼的雙加氧酶，其功能是介導(dǎo)一個3β-羥基基團(tuán)到GA9和GA20上，將無生物活性的GA9和GA20催化形成具有生物活性的GA1、GA4和GAs(Yamaguchi, 2008；陳晶晶等，2014a)。若GA3ox基因發(fā)生突變，使植物不能合成具有活性的赤霉素，植物株高生長受到抑制，從而導(dǎo)致矮化表型出現(xiàn)。此外，在許多矮化突變體中發(fā)現(xiàn)植物株高性狀與GA3ox基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，當(dāng)GA3ox基因的表達(dá)水平受抑制時，植株會出現(xiàn)矮化性狀(Roumeliotis et al., 2013)。因此，研究GA3ox基因結(jié)構(gòu)變化及其表達(dá)特點與香蕉莖桿矮化的關(guān)系是揭示香蕉矮化變異分子機(jī)制的重要內(nèi)容，對于挖掘調(diào)控香蕉株高關(guān)鍵基因及其應(yīng)用具有重要的研究意義。在矮化變異的香蕉突變體苗期，其假莖GA1和GA3含量顯著低于野生型親本，并且外源GA3和吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic，IAA)能使其株高恢復(fù)到野生型高度(陳晶晶等，2014b)。但是，香蕉的矮化變異是否與GA3ox基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平改變有關(guān)，目前尚未見有研究報道。

本研究以威廉斯B6矮化突變體及其野生型親本為材料，通過RT-PCR技術(shù)克隆得到矮化香蕉及其野生型親本GA3ox基因的全長cDNA序列，并利用qRT-PCR 技術(shù)對GA3ox基因在不同組織中的表達(dá)差異進(jìn)行分析。擬探討以下問題：(1)矮化香蕉和野生型香蕉GA3ox蛋白同源性、理化性質(zhì)分析；(2)矮化香蕉和野生型香蕉GA3ox氨基酸序列的結(jié)構(gòu)差異分析；(3)GA3ox基因在矮化香蕉及野生型香蕉不同組織中的表達(dá)水平差異分析。本研究結(jié)果旨在為揭示香蕉矮化突變的分子機(jī)制與篩選優(yōu)良矮化香蕉株系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以威廉斯B6矮化突變體及其野生型親本為試驗材料，均采自于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)科基地溫網(wǎng)室。選取長勢一致、無病蟲害的矮化突變體及其親本香蕉樹各2株，分別采集香蕉生長發(fā)育前期嫩葉、假莖樣品用于基因克隆及表達(dá)分析。所有材料采集后立即放入液氮中凍存，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1GA3ox基因克隆與測序 采用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，提取香蕉幼嫩葉片中的總RNA。按照M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書將完整度較好、純度較高的RNA反轉(zhuǎn)成cDNA第一鏈，以cDNA為模板，根據(jù)NCBI上發(fā)表的Musaacuminatasubsp.malaccensis的GA3ox編碼基因的ORF(XM_009398371.2)設(shè)計1對特異引物，此引物序列為GA3ox-F：5′-ATGAATCCCAATCCAACGAC-3′，GA3ox-R：5′-TTAACAACAAATCCCTTCG-3′。采用高保真taq酶進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒將目的片段回收純化，將回收產(chǎn)物與 PUCI-Blunt克隆載體相連接后，送至上海生工生物公司測序。

1.2.2GA3ox基因表達(dá)分析 利用qRT-PCR分析GA3ox基因在矮化突變體及野生型香蕉不同組織中的表達(dá)模式。分別采集矮化香蕉和野生型香蕉第10片、第15片、第20片、第25片葉齡期嫩葉及對應(yīng)時期的假莖，液氮速凍后提取RNA；利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并根據(jù)克隆得到的矮化香蕉和野生型香蕉的GA3ox全長cDNA序列設(shè)計特異性引物，此引物序列為GA3ox-qF：5′-CTGGATCACGCCCTCAAGCTC-3′和GA3ox-qR：5′-TCAACTGCAACACGGCGGACA-3′，擴(kuò)增片段長度為203 bp；以香蕉Actin作為內(nèi)參基因，在GenBank登錄號為AB022041，引物序列為Actin-F：5′-GCCATACAGTGCCAATCTACGAGG-3′和Actin-R：5′-ATGTCACGAACAATTTCCCGCTCA-3′，擴(kuò)增片段長度為157 bp，進(jìn)行基因的表達(dá)定量分析。采用2XUniversal SYBR GreenFast qPCR Mix染料說明書進(jìn)行操作，qRT-PCR流程第一步為95 ℃ 3 min；第二步為95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；第三步熔解曲線的繪制為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個反應(yīng)重復(fù)3次，結(jié)果采用2-△△CT方法計算基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 序列分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blastp進(jìn)行GA3ox氨基酸序列相似性分析；通過ExPASy在線軟件(https://web.expasy.org/protparam)對GA3ox蛋白的分子質(zhì)量、等電點、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測；利用 SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分析GA3ox氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉矮化突變體與野生型GA3ox基因的序列比對分析

以矮化香蕉和野生型香蕉嫩葉的cDNA為模板，利用primer 5.0軟件設(shè)計GA3ox基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，得到兩條1 000 bp左右的特異性條帶(圖1)，測序后這2個靶序列的全長均為1 096 bp，將獲得矮化突變體GA3ox基因命名為GA3ox-A、野生型香蕉GA3ox基因命名為GA3ox-G。通過測序得到GA3ox-A和GA3ox-G的全長序列均為1 096 bp，GA3ox-A和GA3ox-G的ORF均為864 bp，5′-UTR均為232 bp，均編碼287個氨基酸。

M. DL5000 Maker; A. GA3ox-A; B. GA3ox-G。圖 1 矮化香蕉與野生型香蕉 GA3ox基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 PCR amplification products of the GA3ox gene from dwarf banana and wild type banana

對GA3ox-A和GA3ox-G的氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，兩條氨基酸序列之間的同一性高達(dá)98.26%，存在5個位點的差異，分別位于第29位、第38位、第84位、第196位和第259位(圖2)。

圖 2 矮化香蕉與野生型香蕉GA3ox氨基酸序列比對分析Fig. 2 Comparison and analysis of GA3ox amino acid sequence from dwarf banana and wild type banana

2.2 香蕉矮化突變體與野生型GA3ox蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域分析

矮化突變體與野生型香蕉GA3ox氨基酸序列的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，GA3ox-A和GA3ox-G分子式分別為C1338H2152N402O395S17和C1332H2150N402O397S16，蛋白分子量分別為30 735.28 Da和30 661.14 Da，理論等電點均為9.78。其中，GA3ox-A和GA3ox-G蛋白負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)均為20個，正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)均為32個；GA3ox-A和GA3ox-G蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)分別為 67.46和68.79，均屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)分別為76.90和78.61；親水平均系數(shù)分別為-0.240和-0.236。根據(jù) NCBI 在線軟件對編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，GA3ox-G和GA3ox-A具有2-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶與Fe2+結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域，與其他植物的GA3ox蛋白相同。

2.3 香蕉矮化突變體與野生型GA3ox蛋白質(zhì)磷酸位點及其高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

蛋白磷酸位點分析結(jié)果顯示，GA3ox-A和GA3ox-G蛋白均含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3種氨基酸磷酸化位點，GA3ox-A和GA3ox-G分別含有絲氨酸22個和24個，蘇氨酸7個和8個，酪氨酸2個和4個?？缒そY(jié)構(gòu)分析顯示GA3ox-A和GA3ox-G氨基酸序列的期望值分別為0.037 29和0.028 98，均無跨膜區(qū)域。

利用SOPMA在線軟件對 GA3ox-A和GA3ox-G蛋白的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析結(jié)果顯示，GA3ox-G蛋白含有4種構(gòu)象，包括28.57%的α-螺旋、16.38%的延伸鏈、3.48%的β-轉(zhuǎn)角和51.57%的無規(guī)則卷曲(圖3)；GA3ox-A蛋白含有4種構(gòu)象，分別為26.13%的α-螺旋、17.42%的延伸鏈、3.48%的β-轉(zhuǎn)角和52.96%的無規(guī)則卷曲(圖4)。

紅色. 延伸鏈； 藍(lán)色. α-螺旋； 紫色. 無規(guī)則卷曲； 綠色. β-轉(zhuǎn)角。下同。Red. Extended chain; Blue. α-helix; Purple. Random coil; Green. β-turn. The same below.圖 3 GA3ox-G蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Secondary structure prediction of GA3ox-G protein

圖 4 GA3ox-A蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 Secondary structure prediction of GA3ox-A protein

2.4 香蕉矮化突變體與野生型GA3ox氨基酸序列同源性比對分析

利用NCBI中的Blastp分析矮化突變體與野生型香蕉GA3ox蛋白的氨基酸序列，同時與其他物種的氨基酸序列同源性比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，矮化香蕉GA3ox的氨基酸序列與油棕(XP_010915137.1)、海棗(XP_008811603.3)、椰子(ARI45601.1)的同源性最高，序列同源性分別為62.5%、62.5%和61.5%。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，香蕉矮化突變體及其野生型親本GA3ox的氨基酸序列在N末端比油棕、海棗和椰子3種植物的GA3ox少了63個氨基酸，C末端少了7個氨基酸(圖5)。

黑色陰影和其他陰影框分別表示相同和相似氨基酸。Black shaded and other shaded boxes show identical and similar amino acids.圖 5 矮化香蕉和野生型香蕉GA3ox與其他植物同源蛋白的序列比對分析Fig. 5 Sequence comparison and analysis of dwarf banana and wild type banana GA3ox with other plants homologous proteins

2.5 香蕉矮化突變體與野生型GA3ox基因的表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)研究GA3ox基因在矮化突變體及野生型香蕉莖稈生長的不同葉齡期的表達(dá)情況。由圖6可知，GA3ox基因在矮化突變體及野生型香蕉不同葉齡期的葉片中表達(dá)水平不同。在第10葉和第15葉齡期GA3ox在野生型香蕉葉片中的相對表達(dá)量均高于矮化香蕉，但在第20葉和第25葉葉齡期時野生型香蕉葉片中的相對表達(dá)量均顯著低于矮化香蕉。在野生型香蕉葉片中，GA3ox在第15葉葉齡期表達(dá)水平最高，其次是第10葉葉齡期，而在第20葉和第25葉葉齡期時表達(dá)水平較低，第10葉和第15葉葉齡期的表達(dá)水平極顯著高于第20葉和第25葉葉齡期，而在第20葉和第25葉葉齡期中的表達(dá)差異不顯著； 在矮化突變體中，GA3ox在第15葉和第25葉葉齡期時表達(dá)水平顯著或極顯著高于第10葉和第20葉葉齡期時的表達(dá)水平，而在第10葉和第20葉葉齡期之間的表達(dá)差異不顯著。

小寫和大寫字母分別表示0.01和0.05水平的顯著性差異。下同。Lowercase and uppercase letters indicate significant differences at the 0.01 and 0.05 levels. The same below.圖 6 GA3ox在矮化香蕉和野生型香蕉葉片中的表達(dá)水平Fig. 6 Expression levels of GA3ox in dwarf banana and wild type banana leaves

在香蕉假莖中，GA3ox基因在矮化突變體及野生型香蕉不同葉齡期的表達(dá)水平不同。在野生型香蕉莖稈中，GA3ox在第20葉葉齡期時表達(dá)水平最高，第25葉葉齡期是其次，在第10葉和第15葉葉齡期中的相對表達(dá)量次之，并且在第20葉葉齡期的表達(dá)水平顯著或極顯著高于其他葉齡期；在矮化突變體中，GA3ox在第25葉葉齡期表達(dá)水平最高，第20葉葉齡期是其次，在第20葉和第25葉葉齡期時表達(dá)水平顯著或極顯著高于第10葉和第15葉葉齡期時的表達(dá)水平，而在第10葉和第15葉葉齡期之間的表達(dá)差異不顯著。同時，GA3ox在矮化植株莖稈中的表達(dá)量均顯著或極顯著低于野生型，其中在第10葉葉齡期時野生型莖稈中GA3ox的表達(dá)量是矮化型的32倍，在第15葉葉齡期野生型莖稈中GA3ox的表達(dá)水平是矮化型的7倍，在第20葉葉齡期時野生型植株莖桿中GA3ox的表達(dá)水平達(dá)最高，其表達(dá)水平是矮化型的2.2倍(圖7)。

圖 7 GA3ox在矮化香蕉和野生型香蕉假莖中的表達(dá)水平Fig. 7 Expression levels of GA3ox in dwarf banana and wild type banana pseudo stems

3 討論與結(jié)論

赤霉素是影響植物生長發(fā)育的重要植物激素之一，植物體內(nèi)活性赤霉素含量的減少會導(dǎo)致植物矮化，GA3-氧化酶(GA3ox)是赤霉素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，GA3ox的重要功能是將無生物活性的GA9和GA20催化形成具有生物活性的GA1和GA4(Yamaguchi，2008)。目前，已在擬南芥(Helliwell et al., 1998)、水稻(Sasaki et al., 2002)、豌豆(Reinecke et al., 2013)等植株中鑒定得到GA3-氧化酶對植物莖稈的矮化具有重要的調(diào)控作用。為進(jìn)一步探究GA3ox對香蕉矮化的分子調(diào)控機(jī)制，本研究克隆得到矮化香蕉及野生型香蕉的GA3ox的全長cDNA序列并對其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，GA3ox-A和GA3ox-G蛋白均屬于不穩(wěn)定蛋白，具有親水性，并且GA3ox-A和GA3ox-G蛋白的二級結(jié)構(gòu)均具有4種構(gòu)象，蛋白磷酸位點分析顯示GA3ox-A和GA3ox-G蛋白均含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸 3 種氨基酸磷酸化位點，本研究結(jié)果與水稻(殷小林等，2019)、甘蔗(閆海鋒等，2020)的GA3ox蛋白分析結(jié)果一致。氨基酸同源比對分析發(fā)現(xiàn)，矮化香蕉及其野生型GA3ox的氨基酸序列與油棕、海棗、椰子的同源性最高。

在水稻(李金華等，2007)、馬鈴薯(Roumeliotis et al., 2013)、紫花苜蓿(Dalmadi et al., 2008)和西瓜(Sun et al., 2020)等作物中研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GA3ox基因發(fā)生突變時會導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物的功能缺失，植物體內(nèi)GA1和GA4含量降低，導(dǎo)致植株表現(xiàn)出矮化表型。在水稻矮化突變體d18中由于OsGA3ox2基因第2個外顯子中的一個鳥嘌呤(G)的缺失改變了閱讀框，導(dǎo)致OsGA3ox2功能的缺失，使得植株表現(xiàn)出矮化特性(李金華等，2007)；在馬鈴薯中由于StGA3ox2基因的突變，造成植株節(jié)間變短(Roumeliotis et al., 2013)，從而產(chǎn)生矮化表型；紫花苜蓿矮化突變體由于MsGA3ox氨基酸序列發(fā)生突變，損害MsGA3ox的功能并導(dǎo)致植株矮化(Dalmadi et al., 2008)；在西瓜中由于GA3ox功能的缺失阻斷了GA4的合成，導(dǎo)致植物赤霉素含量降低，植株表現(xiàn)出矮化性狀(Sun et al., 2020)。本研究對威廉斯B6矮化突變體及其野生型親本GA3ox的cDNA序列的比對分析發(fā)現(xiàn)，矮化突變體的GA3ox和野生型GA3ox的cds長度相同，但其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列中存在5個位點的差異。因此，推測GA3ox結(jié)構(gòu)差異可能是引起香蕉莖稈矮化變異重要的因素。

GA3ox基因的表達(dá)異常對植物株高發(fā)育有較大的影響，目前已在馬鈴薯(Roumeliotis et al., 2013)、山核桃(魏廣利等，2021)和豌豆(Reinecke et al., 2013)等作物中發(fā)現(xiàn)，GA3ox表達(dá)量的變化影響了植物株高性狀。在馬鈴薯中，由于StGA3ox2的表達(dá)下調(diào)，因此突變體植株表現(xiàn)出矮小、節(jié)間較短等表型(Roumeliotis et al., 2013)；在山核桃中，過量表達(dá)CcGA3ox基因使得植株變高(魏廣利等，2021)；豌豆PsGA3ox1的過量表達(dá)導(dǎo)致GA1含量增加，從而促進(jìn)了豌豆節(jié)間的伸長(Reinecke et al., 2013)。本研究發(fā)現(xiàn)，GA3ox在香蕉矮化突變體莖稈中的表達(dá)水平顯著低于野生型，這與馬鈴薯、豌豆、山核桃等植物的表達(dá)模式相似，說明GA3ox基因的表達(dá)量會影響植物株高，當(dāng)GA3ox表達(dá)量下調(diào)時植株表現(xiàn)出節(jié)間縮短和矮化等表型。

綜上所述，推測矮化香蕉表型的變異原因可能是GA3ox的序列發(fā)生突變導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物GA3ox的功能發(fā)生改變；或是其表達(dá)水平降低導(dǎo)致GA3ox的酶活性功能降低，使香蕉的內(nèi)源GA1/GA4含量下降，從而影響了莖稈和其他器官的伸長生長。這表明GA3ox基因的突變和表達(dá)水平的變化對于香蕉莖稈的矮化變異可能具有重要的調(diào)控作用。但是，GA3ox的突變和表達(dá)水平降低是否引起香蕉莖稈矮化變異，還需要進(jìn)一步驗證GA3ox基因的功能來確定。