陳言博， 陳宗新， 夏快飛， 張明永， 王亞琴*

(1. 華南師范大學 生命科學學院， 廣州 510631； 2. 中國科學院華南植物園， 廣州 510650 )

鋅指蛋白是真核生物體內一類被廣泛研究的轉錄因子家族，根據(jù)半胱氨酸(C)和組氨酸(H)殘基的數(shù)目和位置可將其分為C2H2、C2HC、C2C2、C2C2C2C2等類型(Laity et al., 2001)。C2H2型鋅指蛋白是鋅指蛋白中最常見的一類，在許多代謝途徑以及植物的生長發(fā)育和非生物脅迫反應中起著至關重要的作用(Ballerini et al., 2020; Yin et al., 2020; Rodas et al., 2021; Zhang et al., 2021)。目前，在水稻和擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分別有189個和176個C2H2型鋅指蛋白，該類蛋白的鋅指結構域具有CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H(C為半胱氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，H為組氨酸，L為亮氨酸，X為任意氨基酸)特征序列(Englbrecht et al., 2004; Agarwal et al., 2007)。根據(jù)鋅指結構域的數(shù)目、序列和排列方式，擬南芥176個C2H2型鋅指蛋白可分為Set A、Set B和Set C，其中包含多個且離散的鋅指結構域的一類歸為Set C(Pabo et al., 2001; Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008)。根據(jù)鋅指特征序列中2個組氨酸之間的氨基酸數(shù)目，Set C可進一步分為C1、C2和C3，C1家族可進一步細分為C1-1i、C1-2i、C1-3i、C1-4i和C1-5i(Englbrecht et al., 2004)。有關C1家族的研究主要集中在C1-1i和C1-2i亞家族(Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008)。

雙子葉植物擬南芥C2H2型鋅指蛋白的C1-2i亞家族包括ZAT5～7、ZAT10～12、ZAT18和AZF1～3等，該亞家族含有2個鋅指結構，鋅指特征序列中2個組氨酸之間的氨基酸數(shù)目為3個，大部分成員具有核定位信號及EAR motif(ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression motif)，主要參與各種生物和非生物脅迫響應(Lippuner et al., 1996; Meissner et al., 1997; Englbrecht et al., 2004; Sakamoto et al., 2004; Mittler et al., 2006; Liu et al., 2013; Shi et al., 2014; Yin et al., 2017)。在擬南芥中，AtAZF2對鹽和干旱脅迫處理均響應強烈，而AtAZF1和AtAZF3的表達對非生物脅迫(鹽、干旱和冷)的響應較弱，只有AtAZF2能夠被ABA(abscisic acid)誘導，這可能是由于AtAZF2啟動子中含有ABA響應元件(Sakamoto et al., 2004)。過表達AtZAT18可以提高擬南芥的耐旱性，而突變AtZAT18則導致植物對干旱脅迫的耐受性降低(Yin et al., 2017)。組成型過表達AtZAT10的轉基因擬南芥生長受到抑制，并對干旱、鹽、高溫和滲透脅迫的耐受性增強，同時提高了ROS穩(wěn)態(tài)相關基因，如AtAPX1和AtAPX2的轉錄(Sakamoto et al., 2004; Mittler et al., 2006)。有趣的是，AtZAT10基因敲除植株和RNAi干涉植株也表現(xiàn)出對鹽和滲透脅迫的耐受性增加，但調控機制目前尚不清楚(Mittler et al., 2006)。除擬南芥外，其他雙子葉植物中也有關于C2H2轉錄因子的報道。豌豆St(Stipulesreduced)基因通過影響細胞分裂和細胞擴展調控豌豆托葉的大小(Moreau et al., 2018)。番茄基因H(hair)編碼C2H2型鋅指蛋白，過表達該基因后葉片毛狀體數(shù)量顯著增加(Chang et al., 2018)。苜蓿MtSUP(SUPERMAN)是C2H2鋅指蛋白，主要在分生組織、雄蕊、心皮邊緣等部位表達，在苜蓿中將該基因突變后影響花器官的數(shù)量和形態(tài)及果實發(fā)育(Rodas et al., 2021)。

禾本科植物結縷草中的ZjZFN1基因，編碼C2H2型鋅指蛋白，其表達受鹽脅迫、冷和ABA誘導，在擬南芥中異源過表達ZjZFN1發(fā)現(xiàn)，該基因通過影響活性氧的積累及鹽脅迫響應基因的轉錄，提高擬南芥對鹽脅迫的抗性(Teng et al., 2018)。干旱脅迫誘導小麥TaZFP1B的表達，而過表達TaZFP1B的小麥對干旱脅迫的抗性顯著增加(Cheuk et al., 2020)。水稻中關于C2H2鋅指蛋白有一些文獻報道，如ZFP182、ZFP36、ZFP179、ZFP245和ZFP252等。過表達ZFP182能提高植物對鹽脅迫的耐受性(Zhang et al., 2012)。過表達ZFP36能夠提高抗氧化酶的活性，并增強水稻對干旱脅迫和氧化脅迫的耐受性；相反，ZFP36的RNAi干涉植株中抗氧化酶活性較低，對干旱脅迫和氧化脅迫更敏感(Zhang et al., 2014)。過表達ZFP179能夠提高水稻的耐鹽性，并且轉基因幼苗對外源ABA更加敏感(Sun et al., 2010)。過表達ZFP252的植株對鹽和干旱脅迫的耐受性增加，在鹽和干旱脅迫處理下，過表達ZFP252植株中OsDREB1A、OsP5CS和OsProT等非生物脅迫相關基因的表達量高于野生型和ZFP252沉默株系，說明OsDREB1A、OsP5CS和OsProT可能是ZFP252的下游基因(Xu et al., 2008)。

OsZAT12屬于C2H2鋅指蛋白的C1-2i亞家族，該類基因在許多代謝途徑以及植物的生長發(fā)育和非生物脅迫反應中起著至關重要的作用(Ballerini et al., 2020; Yin et al., 2020; Zhang et al., 2021; Rodas et al., 2021)，本實驗室前期(陳宗新等，2019)克隆了OsZAT12基因，該基因在水稻根中特異表達，定位于細胞核，異源過表達OsZAT12擬南芥植株矮小，根生長受到抑制。水稻為重要的糧食作物，生物/非生物脅迫、植物激素等均影響植株發(fā)育和形態(tài)建成，進而影響產(chǎn)量。然而，作為在植物生長發(fā)育和非生物脅迫中可能起著重要作用的OsZAT12，在水稻生長發(fā)育及非生物脅迫中的作用尚不清楚。因此，本文分析了OsZAT12的啟動子元件和轉錄活性，并采用qRT-PCR技術分析OsZAT12在非生物脅迫和植物激素處理下的響應模式，以期為進一步研究OsZAT12參與不同非生物脅迫應答的分子機制和參與ABA信號轉導途徑的調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻“中花11”(WT)，實驗室自存。雙元載體pCAMBIA1301來自本實驗室，CRISPR編輯相關載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-H、pYLgRNA-OsU6a/LacZ、pYLgRNA-OsU6a、pYLgRNA-OsU3/LacZ、pYLsgRNA-OsU3由華南農業(yè)大學劉耀光實驗室惠贈，大腸桿菌DH5a感受態(tài)菌種和根癌農桿菌EHA105感受態(tài)菌種由本實驗室保存。

1.2 OsZAT12及其同源基因的保守結構域分析

在NCBI和TAIR數(shù)據(jù)庫中查找擬南芥和水稻中的C1-2i亞家族成員，并導出這些基因的氨基酸序列。利用軟件ClusatlX 1.83進行多重序列比對，使用軟件DNAMAN 6.0輸出圖片。本研究中，進行多重序列比對的基因為AtAZF1(At5g67450)、AtAZF2(At3g19580)、AtAZF3(At5g43170)、AtZAT5(At2g28200)、AtZAT6(At5g04340)、AtZAT7(At3g46090)、AtZAT10(At1g27730)、AtZAT11(At2g37430)、AtZAT12(At5g59820)、AtZAT18(At3g53600)、OsZFP252(AAO46041.1)、OsZFP245(AAQ95583)、OsZFP182(NP001051718.1)、OsZFP179(AAL76091.1)、OsZFP36(AAP51130.1)。

1.3 OsZAT12轉錄活性分析

雙熒光素酶報告系統(tǒng)是螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，LUC)檢測系統(tǒng)和海腎熒光素酶(renilla luciferase，REN)檢測系統(tǒng)的組合，常用來分析轉錄因子的轉錄活性。本研究使用擬南芥原生質體瞬時表達系統(tǒng)進行雙熒光素酶實驗，其中擬南芥原生質體的提取參考Wu等(2009)的方法，雙熒光素酶活性的檢測根據(jù)Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒(Cat. No. E1910)中的說明書操作，并通過計算LUC/REN的比值分析OsZAT12的轉錄激活/抑制活性。

1.4 OsZAT12啟動子分析

以水稻OsZAT12基因的起始密碼子(ATG)上游2 000 bp 作為研究對象，利用在線啟動子分析工具PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，對OsZAT12的啟動子序列進行調控元件的預測和分析。

1.5 OsZAT12基因在非生物脅迫和植物激素處理下的表達分析

1.5.1 水稻種子消毒及幼苗水培方法 水稻種子去殼后放入50 mL 離心管中，加75%乙醇表面消毒1 min，用2.5%次氯酸鈉消毒50 min，無菌水漂洗5次，將種子置于1/2 MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將以上培養(yǎng)5 d 的無菌苗移至96孔PCR塑料板(剪去管底)進行水培(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)，水稻營養(yǎng)液配方參照“國際水稻研究所水稻營養(yǎng)液”配制，5～6 d 換一次水培液。

1.5.2 非生物脅迫處理方法 取苗齡14 d 的水稻幼苗為材料進行非生物脅迫處理。具體如下：低溫脅迫，將水稻幼苗放置于4 ℃光照培養(yǎng)箱(16 h 光照/8 h 黑暗)中；滲透脅迫，將水稻幼苗置于含有20% PEG(polyethylene glycol)6 000的水稻營養(yǎng)液中；氧化脅迫，將水稻幼苗置于含有20 μmol·L-1甲基紫精(methyl viologen，MV)的水稻營養(yǎng)液中；鹽脅迫處理，將水稻幼苗置于含有100 mmol ·L-1NaCl的水稻營養(yǎng)液中。分別收取處理0、0.5、1、3、6、12、24、48 h 的整株幼苗，未處理材料同時取樣作為對照組，所有樣品于液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。除低溫處理外，其他脅迫處理均在植物培養(yǎng)室(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)進行。

1.5.3 植物激素處理方法 取苗齡14 d 的水稻幼苗作為材料，進行植物激素處理。在培養(yǎng)液中分別添加100 μmol ·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)，1 μmol ·L-12, 4-表蕓苔素內酯(2,4-epibrassinolide, 2,4-eBL)，1 μmol ·L-1吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，處理0、1、24、48 h 后取材(取整株幼苗)，未處理材料同時取樣作為對照組，所有樣品于液氮速凍后-80 ℃保存。激素處理的材料均放在植物培養(yǎng)室(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)。

1.5.4 水稻RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成 RNA提取根據(jù)華越洋超快型植物RNA提取試劑盒(Cat. No. 0416-50)的說明書進行。參照Toyobo反轉錄試劑盒(Cat. No. FSQ-301)說明書進行cDNA第一條鏈的合成。

1.5.5OsZAT12基因的qRT-PCR(quantitative real-time PCR)檢測 本研究中的qRT-PCR采用SYBR染料法(GenStar 2 × RealStar Green Fast Mixture, Cat. No. A301-10)。以水稻eEF-1a基因為內參(qPCR-eEF-1a-F: 5′-GCACGCTCTTCTTGCTTTC-3′;qPCR-eEF-1a-R: 5′-AGGGAATCTTGTCAGGGTTG-3′)，采用2-△△CT法計算(Livak & Schmittgen, 2001)OsZAT12基因的相對表達量(qPCR-OsZAT12-F: 5′-GACCTGAACCATCCACCCTG-3′; qPCR-OsZAT12-R: 5′-CGGTATCCAAGAACTGGTGGAA-3′)。

1.6 OsZAT12基因過表達載體和CRISPR/Cas9載體構建

由于OsZAT12在水稻根中特異表達(陳宗新等，2019)，因此以野生型水稻根的cDNA為模板，利用引物OsZAT12-F: 5′-CGGGATCCATGAAGAGGTTTGCA-3′(酶切位點BamHI)，OsZAT12-R: 5′-AACTGCAGCTAGTAGCCGACGCA-3′(酶切位點PstI)擴增OsZAT12基因，利用雙酶切法構建到pCAMBIA1301載體上，得到過表達載體pCAMBIA1301::35S::OsZAT12。

利用華南農業(yè)大學劉耀光實驗室設計的網(wǎng)站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)設計OsZAT12敲除靶點。為提高敲除效率，采用雙靶點載體的策略，以OsZAT12基因設計2個靶點，其中靶點5′-CATGAGGCGCCACCGCGCCA-3′以U6為啟動子，靶點5′-TGCGACGACATGAGCATCAG-3′以U3為啟動子，具體載體構建參考Ma等(2015)的方法。

1.7 OsZAT12基因遺傳轉化水稻及轉基因植株鑒定

將1.6中構建好的重組載體(過表達載體和CRISPR/Cas9載體)轉化至根癌農桿菌EHA105感受態(tài)細胞中。采用農桿菌介導的遺傳轉化法將重組載體轉進水稻愈傷組織中，具體參考李美茹和李洪清(2003)、王亞琴等(2011)的方法。

轉基因植株的鑒定采用PCR方法。剪取T1代幼苗約2 cm 長的葉片，利用TPS溶液(100 mmol · L-1Tris-HCl, pH 8.0; 10 mmol · L-1EDTA-Na2, pH 8.0; 1 mol · L-1KCl)提取DNA。過表達OsZAT12的轉基因植株利用抗性篩選標記基因HptII(hygromycin phosphotransferase II) 設計引物Hyg-F: 5′-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3′, Hyg-R: 5′-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3′，以DNA為模板進行PCR擴增檢測。CRISPR植株采用引物CRISPR-F: 5′-TCAGACAACAGAGAGGTTGGT-3′和CRISPR-R: 5′-TAGTAGCCGACGCAGTCAAC-3′擴增OsZAT12包括靶位點在內的片段，經(jīng)測序后檢測突變位點。

1.8 轉基因水稻幼苗對外源ABA的敏感性分析

取野生型、過表達OsZAT12和敲除OsZAT12植株的種子，經(jīng)表面消毒后播種于含不同濃度ABA(0、1、5、10 μmol ·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基上，每個株系在不同ABA濃度培養(yǎng)基上播種30粒種子，在植物培養(yǎng)室(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)培養(yǎng)10 d 后拍照并統(tǒng)計株高和根長。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行3次生物學重復，每次重復中每個樣品設置3個技術重復。數(shù)據(jù)統(tǒng)計為平均值±標準偏差。利用軟件SPSS Statistics中的單因素方差分析進行數(shù)據(jù)的顯著性分析(*P<0.05；**P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 轉錄因子OsZAT12保守結構域的分析

OsZAT12(Os05g0114400)基因編碼區(qū)全長597 bp，該基因不含內含子，編碼198個氨基酸(陳宗新等，2019)。為進一步研究OsZAT12蛋白結構域的保守性及其序列特點，對擬南芥和水稻C1-2i亞家族中的部分成員進行多重序列比對，結果如圖1所示，OsZAT12的結構域與擬南芥和水稻中的同源蛋白一致，均含有2個包含QALGGH保守序列的鋅指結構域以及1個EAR motif(ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression motif)。蛋白C末端的EAR motif通常被認為具有抑制活性(Meissner & Michael, 1997; Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008)。以上結果說明，OsZAT12是一個典型的C2H2型鋅指蛋白，屬于C1-2i亞家族，可能具有轉錄抑制活性。

黑色部分表示相似性=100%，粉色部分表示相似性在75%～100%之間(不包括100%)，藍色部分表示相似性在50%～75%之間(不包括75%)，黃色部分表示相似性在33%～50%之間(不包括50%)，白色部分表示相似性低于33%。Black parts indicate similarities = 100%, pink parts indicate similarities between 75% and 100% (excluding 100%), blue parts indicate similarities between 50% and 75% (excluding 75%), yellow parts indicate similarities between 33% and 50% (excluding 50%), the white parts indicate similarities <33%.圖 1 水稻和擬南芥部分C2H2型鋅指蛋白氨基酸序列的多重比對Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences of partial C2H2 zinc finger proteins in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana

2.2 轉錄因子OsZAT12的轉錄活性分析

采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測OsZAT12的轉錄活性，將OsZAT12與包含GAL4 DNA結合結構域(GAL4 DNA binding domain，GALBD)的效應載體融合(圖2:A)，同時與攜帶熒光素酶基因的報告載體共同轉化擬南芥原生質體，檢測對照組和實驗組的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性并計算相對LUC/REN比值。實驗組的相對LUC/REN比值顯著低于對照組(圖2:B)，說明轉錄因子OsZAT12具有轉錄抑制活性。

A. 雙熒光素酶實驗載體構建示意圖，其中GALBE是GAL4結合元件，GALBD是GAL4 DNA結合結構域，35S mini啟動子是只含46 bp 的35S啟動子； B. 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測OsZAT12的轉錄活性，報告載體和效應空載體作為對照組，報告載體和連有OsZAT12的效應載體作為實驗組，實驗結果為3次生物學重復的平均值±標準偏差。對照組的LUC/REN比值設為1，**表示與對照組相比達到顯著水平(P<0.01)。A. Schematic structures of plasmids used in dual-luciferase assay, GALBE is GAL4 binding element, GALBD is GAL4 DNA binding domain, and 35S mini promoter indicates that 35S promoter only contains 46 bp; B. Dual luciferase reporter system detects the transcriptional activity of OsZAT12, the reporter and effector vectors serve as control group, the reporter vectors and the effector vector with OsZAT12 are used as the experimental group, values are ± s from three biological replicates. The LUC/REN ratio of control group is defined as 1, ** indicates significant difference compared with control group (P<0.01). 圖 2 OsZAT12的轉錄活性分析Fig. 2 Transcriptional activity analysis of OsZAT12

2.3 OsZAT12啟動子的序列分析

以水稻OsZAT12基因的起始密碼子(ATG)上游2 000 bp 為研究對象，使用啟動子在線分析網(wǎng)站對OsZAT12啟動子進行調控元件預測，結果顯示，OsZAT12啟動子上調控元件非常豐富，除了基本的核心啟動子元件(TATA box和CAAT box元件)以外，該段序列中還具有非生物脅迫和激素相關的順式作用元件。其中，與非生物脅迫相關的有2個MYB轉錄因子結合元件；與激素相關的元件包括3個GA響應元件、3個ABA響應元件、2個Auxin響應元件和1個JA響應元件等(圖3)。由此推測，OsZAT12基因的表達可能受非生物脅迫因子和多種激素的調節(jié)。

圖 3 OsZAT12啟動子的生物信息學分析Fig. 3 Bioinformatics analysis of OsZAT12 promoter

2.4 非生物脅迫處理下OsZAT12的表達分析

擬南芥ZAT12在活性氧以及非生物脅迫信號傳導中起著重要作用(Davletova et al., 2005)。水稻OsZAT12啟動子中含有非生物脅迫相關的元件(圖3)，推測其可能響應非生物脅迫。因此，進一步檢測了水稻幼苗在低溫(4 ℃)、滲透脅迫(20% PEG 6 000)、氧化脅迫(20 μmol·L-1MV)和鹽脅迫(100 mmol·L-1NaCl)處理下OsZAT12的表達。如圖4:A所示，低溫處理48 h 內，OsZAT12的表達均呈下調趨勢，其中在處理12 h時，OsZAT12的表達量降到最低，之后略微上調。在滲透脅迫處理下，OsZAT12表達量呈先下降后上升的趨勢，從3 h 上升一直到48 h，OsZAT12的表達量達到未處理時的2倍左右(圖4:B)。而在20 μmol·L-1MV和100 mmol·L-1NaCl的處理下，OsZAT12的表達量隨時間變化未出現(xiàn)明顯的上調或下調趨勢(圖4:C,D)。以上結果表明，OsZAT12基因的表達響應多種非生物脅迫，并隨脅迫時間的延長其表達量出現(xiàn)不同的變化趨勢。

A. OsZAT12在4 ℃脅迫處理下的表達量分析; B. OsZAT12在20% PEG脅迫處理下的表達量分析; C. OsZAT12在20 μmol ·L-1 MV脅迫處理下的表達量分析; D. OsZAT12在100 mmol ·L-1 NaCl脅迫處理下的表達量分析。每組處理0 h 的相對表達量分別設為1，下同。*表示與對0 h比達到顯著水平(P<0.05)。A. Expression level of OsZAT12 under 4 ℃ treatment; B. Expression level of OsZAT12 under 20% PEG treatment; C. Expression level of OsZAT12 under 20 μmol ·L-1 MV treatment; D. Expression level of OsZAT12 under 100 mmol·L-1 NaCl treatment. The relative expression level of 0 h after each treatment is defined as 1, the same below. * indicates significant differences compared with 0 h (P<0.05). 圖 4 不同非生物脅迫下OsZAT12的表達水平Fig. 4 Expression levels of OsZAT12 under different abiotic stresses

2.5 不同植物激素處理下OsZAT12的表達分析

植物激素作為植物內源信號分子，在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用。OsZAT12的啟動子中含有多個激素相關元件(圖3)，推測其可能響應激素水平的變化。植物激素處理實驗結果表明，外施ABA顯著下調OsZAT12的表達。處理1 h 時OsZAT12的表達量迅速下降，在24 h 降到最低，約為對照的1/10，48 h 時略有升高(圖5:A)。相反，外施1 μmol·L-1的2,4-eBL，在1 h 時OsZAT12 表達開始上調，一直持續(xù)到48 h 且達到最高，為對照的12倍(圖5:B)。此外，IAA處理也能上調OsZAT12的表達，其表達量在24 h 達到最高，一直持續(xù)到48 h(圖5:C)。以上結果表明，OsZAT12對不同植物激素的響應各異，可能參與不同植物激素信號對水稻生長發(fā)育的調控。

A. OsZAT12在100 μmol ·L-1 ABA處理下的表達量分析; B. OsZAT12在1 μmol ·L-1 24-eBL處理下的表達量分析; C. OsZAT12在1 μmol ·L-1 IAA處理下的表達量分析。*和**表示與0 h相比達到顯著水平(*P<0.05，**P<0.01)。A. Expression level of OsZAT12 under 100 μmol ·L-1 ABA treatment; B. Expression level of OsZAT12 under 1 μmol ·L-1 24-eBL treatment; C. Expression level of OsZAT12 under 1 μmol ·L-1 IAA treatment. * and ** indicate significant differences compared with the 0 h (*P<0.05，**P<0.01).圖 5 不同植物激素處理下OsZAT12的表達水平Fig. 5 Expression levels of OsZAT12 under different phytohormones treatments

2.6 OsZAT12轉基因植株的獲得

2.6.1OsZAT12敲除植株的篩選 使用特異檢測引物(CRISPR-F和CRISPR-R)先對OsZAT12敲除植株的基因組DNA進行PCR擴增，再對得到的單一PCR片段產(chǎn)物進行測序，結果得到了3個敲除OsZAT12的純合株系，其中oszat12-12-3和oszat12-8-15株系均為單堿基插入，而oszat12-10-10株系則是缺失一段序列(圖6)。

圖 6 不同OsZAT12敲除株系的測序結果Fig. 6 Sequencing results of different OsZAT12 knockout lines

2.6.2OsZAT12過表達植株的表達量檢測 獲得4個過表達OsZAT12純合株系，并分別命名為OE8、OE3、OE9和OE5。qRT-PCR結果(圖7)顯示，與野生型相比，過表達株系OE8、OE3和OE5的表達量顯著提高，OE9的表達量雖有所提高但與野生型無顯著差異。因此，本研究選取OE8和OE3用于后續(xù)研究。

WT中OsZAT12基因的相對表達量設為1。*表示與WT相比達到顯著水平(P<0.05)。Relative expression level of OsZAT12 in WT is defined as 1. * indicates significant differences compared with WT (P<0.05).圖 7 qRT-PCR分析轉基因植株中OsZAT12的表達量Fig. 7 qRT-PCR analysis of OsZAT12 expression in transgenic plants

2.7 OsZAT12轉基因水稻對ABA的敏感性分析

ABA作為脅迫激素，是植物響應生物/非生物脅迫的重要調控因子(Chen et al., 2020; Bharath et al., 2021)。OsZAT12啟動子序列中包含3個ABA響應元件(圖3)，并且ABA有抑制OsZAT12表達的作用(圖5:A)。在獲得過表達OsZAT12和敲除OsZAT12的植株后，進一步檢測其對ABA的敏感性，結果表明，ABA抑制了野生型和OsZAT12超表達幼苗的生長，并隨著ABA濃度的升高抑制程度越大，而OsZAT12過表達株系的株高、根長都顯著高于野生型(圖8)。OsZAT12敲除植株的株高在5 μmol ·L-1ABA處理下顯著低于野生型；在低濃度ABA(1 μmol ·L-1)處理下，其根長顯著高于野生型；但在較高濃度ABA(10 μmol ·L-1)處理下，根長與野生型無顯著差異(圖8)。以上結果表明，過表達OsZAT12會降低水稻對ABA的敏感性，而敲除OsZAT12則在合適的ABA濃度下才會增強水稻對ABA的敏感性。

OsZAT12轉基因水稻在不同濃度外源ABA處理下的表型 (A)、株高 (B)和根長 (C)，標尺=2 cm。OE8、OE3為OsZAT12過表達植株；oszat12-10-10為OsZAT12敲除植株。*和**表示與WT相比達到顯著水平(*P <0.05，**P<0.01)， n=30。下同。Phenotype (A), shoot length (B) and root length (C) of OsZAT12 transgenic rice under different concentrations of exogenous ABA treatment, scale bar=2 cm. OE8 and OE3 are OsZAT12 overexpression plants; oszat12-12-3, oszat12-10-10 and oszat12-8-15 are OsZAT12 knockout plants. * and ** indicate significant differences compared with WT (*P <0.05，**P<0.01), n=30. The same below.圖 8 OsZAT12轉基因水稻幼苗對ABA的敏感性分析Fig. 8 Sensitivity analysis of OsZAT12 transgenic rice seedlings to ABA

2.8 OsZAT12轉基因植株農藝性狀的觀察與統(tǒng)計

農藝性狀的統(tǒng)計分析結果表明，在分蘗期、抽穗期、成熟期這3個時期中，OsZAT12過表達水稻的株高均顯著低于野生型，而OsZAT12敲除植株則與野生型沒有顯著差異(圖9:A,B,D,F)； 根長和分蘗數(shù)這2個指標，無論是OsZAT12過表達還是敲除植株，均與野生型無顯著差異(圖9:C,E,G)。OsZAT12敲除植株的每株穗數(shù)和結實率均顯著低于野生型， 而OsZAT12過表達株系與野生型則無顯著差異(圖9:H,I)。以上結果表明，OsZAT12影響水稻的株高、每株穗數(shù)和結實率。

A. OsZAT12轉基因水稻分蘗期、抽穗期和成熟期的表型，標尺=5 cm; B-C. OsZAT12轉基因水稻分蘗期的株高和根長; D-E. OsZAT12轉基因水稻抽穗期的株高和分蘗數(shù); F-I. OsZAT12轉基因水稻成熟期的株高、分蘗數(shù)、每株穗數(shù)和結實率。OE8和OE3為OsZAT12過表達植株; oszat12-12-3、oszat12-10-10和oszat12-8-15為OsZAT12敲除植株。A. Phenotype of OsZAT12 transgenic rice at tillering stage, heading stage and maturity stage, scale bar = 5 cm; B-C. Plant height and root length of OsZAT12 transgenic rice at tillering stage; D-E. Plant height and and tiller number of OsZAT12 transgenic rice at heading stage; F-I. Plant height, tiller number, panicle number per plant and seed-setting rate of OsZAT12 transgenic rice at maturity stage. OE8 and OE3 are OsZAT12 overexpression plants; oszat12-12-3, oszat12-10-10 and oszat12-8-15 are OsZAT12 knockout plants. 圖 9 野生型和OsZAT12轉基因水稻的農藝性狀Fig. 9 Agronomic traits of wide type and OsZAT12 transgenic rice

3 討論與結論

鋅指蛋白是真核生物體內一類重要的轉錄調控因子家族，其中C2H2型鋅指蛋白是最常見的一類(Takatsuji, 1999)。C2H2型鋅指蛋白通常包含1～6個鋅指結構域，并在鋅指結構的α-螺旋中含有QALGGH保守序列(Sakamoto et al., 2000; Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008; Wang et al., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsZAT12具有2個典型的C2H2鋅指結構和1個EAR motif，并與擬南芥ZAT12有較高的同源性，說明OsZAT12屬于水稻C2H2鋅指蛋白家族成員。大多數(shù)含有EAR motif的鋅指蛋白都表現(xiàn)出轉錄抑制活性(Ohta et al., 2001)，如矮牽牛ZPT2-3的瞬時表達分析表明其起著阻遏物的作用(Sugano et al., 2003)，而含有EAR motif like的擬南芥ZAT12，在響應冷脅迫時可能作為AtCBF轉錄因子的抑制子起作用(Vogel et al., 2005)。本研究結果表明，水稻OsZAT12蛋白具有轉錄抑制活性，是一個有功能的轉錄抑制因子。

植物C2H2型鋅指蛋白作為一類重要的轉錄因子，是目前研究較為深入的一類鋅指蛋白。該類轉錄因子在植物生長發(fā)育和響應非生物脅迫中具有重要調控作用(Sakamoto et al., 2004; Davletova et al., 2005; Mittler et al., 2006; Rossel et al., 2007; Xie et al., 2012; Shi et al., 2014; Chen et al., 2016; Yin et al., 2017; Ballerini et al., 2020; Yin et al., 2020; Zhang et al., 2021; Rodas et al., 2021)。油菜BnLATE(LATE FLOWERING)通過限制油菜角果中木質素的聚合減少角果的破裂(Tao et al., 2017)。水稻NSG1基因編碼C2H2型鋅指蛋白，與擬南芥SUP(SUPERMAN)、JAG(JAGGED)和NUB(NUBBIN)及水稻SL1(STAMENLESS1)的功能類似，參與調控水稻花發(fā)育(Dinneny et al., 2004; Ohno et al., 2004; Xiao et al., 2009; Zhuang et al., 2020)。組成型過表達AtZAT10的轉基因擬南芥表現(xiàn)為生長阻滯(Sakamoto et al., 2004; Mittler et al., 2006)。本實驗室前期研究(陳宗新等，2019)發(fā)現(xiàn)，異源過表達OsZAT12擬南芥植株矮小，根生長受到抑制。與異源轉化OsZAT12的擬南芥表型相似，該研究也發(fā)現(xiàn)過表達OsZAT12水稻植株在分蘗期、抽穗期和成熟期的株高均顯著降低。該類表型都類似于擬南芥或水稻等植株遭遇脅迫后或過表達脅迫相關轉錄因子如DREB1植株的表型(Kasuga et al., 1999)，說明OsZAT12可能為脅迫相關基因。

植物對非生物脅迫的耐受性，主要依賴于激活植物體內與脅迫相關的分子調控網(wǎng)絡，包括信號刺激的應答、激素信號轉導途徑、誘導信號通路基因的表達等(Dansana et al., 2014; Lima et al., 2015)。冷脅迫會對植物造成損傷，嚴重時可使植物死亡(Wang et al., 2017)。C2H2鋅指蛋白可通過直接調控下游冷脅迫相關基因來增強植物的抗寒能力(Han et al., 2020)。番茄SlCZFP1基因通過誘導COR(cold-regulated)或冷響應相關基因的組成型表達，增強轉基因擬南芥和水稻的耐寒性(Zhang et al., 2011)。大豆GmZF1通過結合COR6.6啟動子區(qū)并上調該基因的表達，調節(jié)轉基因擬南芥對冷脅迫的抗性(Yu et al., 2014)。在香蕉中，過表達MaC2H2-2和MaC2H2-3顯著抑制MaICE1(inducer of CBF expression，冷信號傳導途徑的一個關鍵組成部分)的轉錄。因此，MaC2H2s可能通過抑制MaICE1的轉錄來增強香蕉的抗寒性(Han & Fu, 2019)。低溫處理上調擬南芥ZAT12的表達(Davletova et al., 2005)，過表達該基因則下調CBF(C-repeat/DREBindingFactor)基因的表達，表明ZAT12負調控擬南芥對冷脅迫的適應(Vogel et al., 2005)。本研究表明，4 ℃下調OsZAT12的表達，說明ZAT12在擬南芥和水稻中對低溫脅迫的響應模式不同，暗示兩者的功能可能不同。許多非生物脅迫(如鹽、冷和干旱)，可誘發(fā)植物產(chǎn)生滲透脅迫(Han et al., 2020)。滲透脅迫導致植物生理干旱、離子失衡、氧化損傷和生長抑制(Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki, 2006)。擬南芥ZAT10在滲透脅迫處理后表達顯著上調，尤其是在葉片中；過表達ZAT10擬南芥和zat10突變體均表現(xiàn)出對滲透脅迫的耐受性增強(Mittler et al., 2006)。在擬南芥中，ZAT10被認為是滲透脅迫的正調控因子并受MAP激酶的調控(Nguyen et al., 2016)。楊樹中鑒定出16個C1-2i亞家族成員，其中6個成員參與了滲透脅迫(Gourcilleau et al., 2011)。在擬南芥中異源過表達大豆GmZAT4，該基因可通過ABA途徑提高擬南芥對20% PEG 6 000的耐受性(Sun et al., 2019)。在水稻中，20% PEG 6 000處理后RZF71的表達顯著上調，表明該基因在滲透脅迫反應中發(fā)揮重要作用(Guo et al., 2007)。與擬南芥ZAT10和水稻RZF71的表達模式不同，本研究發(fā)現(xiàn)，在20% PEG 6 000的滲透脅迫處理過程中，OsZAT12的表達先下降，隨后逐漸轉變?yōu)樯险{趨勢。綜合以上結果表明，OsZAT12的表達受到非生物脅迫(如低溫或滲透脅迫)的調控，因此推測OsZAT12參與了水稻響應非生物脅迫的過程。

本研究對水稻OsZAT12啟動子分析發(fā)現(xiàn)其中含有激素相關元件，OsZAT12的表達在2，4-eBL、IAA處理后上調，推測OsZAT12參與了不同激素信號途徑。ABA是植物非生物脅迫中一個重要的調控因子，由于其廣泛在干旱、寒冷、高溫、 鹽脅迫和水澇等逆境中具有重要作用，因此被稱為脅迫激素(Chen et al., 2020; Bharath et al., 2021)。水稻C1-2i亞家族成員的ZFP179，ABA處理3 h 后其表達上調，隨后下調，至24 h 時達到最高(Sun et al., 2010)，而本研究卻發(fā)現(xiàn)，ABA顯著下調OsZAT12的表達，說明兩者在ABA信號傳導途徑中的功能可能存在不同。過表達ZFP179基因的水稻幼苗表現(xiàn)增加對ABA的敏感性(Sun et al., 2010)，而本研究則發(fā)現(xiàn)過表達OsZAT12降低了水稻對ABA處理的敏感性。過表達OsZAT12水稻幼苗和過表達ZFP179水稻幼苗對外源ABA敏感性的差異可能與這兩個基因對ABA的響應模式不同有關。此外，OsZAT12敲除植株的株高只有在5 μmol ·L-1ABA處理下顯著低于野生型；在正常條件及低濃度ABA(1 μmol ·L-1)處理下，根長顯著高于野生型；在較高濃度ABA(10 μmol ·L-1)處理下，根長與野生型無顯著差異。我們推測，敲除OsZAT12后可能會降低植株內源ABA含量，只有在外施合適濃度的ABA時，敲除OsZAT12植株才會表現(xiàn)出對ABA的敏感性增強，這與osbglu33水稻突變體及過表達ZmWRKY114的水稻植株對外源ABA的響應方式相似(Ren et al., 2019; Bo et al., 2020)。結合OsZAT12對非生物脅迫(低溫脅迫和滲透脅迫)及脅迫激素ABA的響應模式，推測OsZAT12參與調節(jié)非生物脅迫及激素信號途徑，進而影響了水稻株型的發(fā)育，并在水稻穗型及結實中具有重要調控作用。本文進一步深入研究了OsZAT12參與植物不同非生物脅迫應答的分子機制和ABA信號轉導途徑的調控，將為利用OsZAT12進行水稻耐逆穩(wěn)產(chǎn)分子設計育種提供實驗依據(jù)。