陳穎，王存琴，方蘭婷，姜新秀

(1.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241002；2.活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；3.安徽省皖南植物藥活性物質(zhì)篩選與再評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；4.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

大葉冬青(IlexlatifoliaThunb.)為冬青科(Aqulfoliaceae)冬青屬(Ilex)常綠喬木，多見于平原地區(qū)的灌木叢中，在浙江、江蘇、安徽及福建等地均有分布[1]。具有清熱解毒、消煩止渴、止痛的功效，常用于治療咽喉痛、感冒發(fā)熱、眼熱和痢疾等癥[2]，其主要包含三萜及其皂苷、黃酮和多酚類等化學(xué)成分[3-6]。其藥理活性研究結(jié)果表明大葉冬青具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎等作用[7-9]。在化學(xué)成分與藥理作用方面的研究成果顯示大葉冬青具有臨床藥用與資源開發(fā)的重要價(jià)值。目前關(guān)于大葉冬青化學(xué)成分含量測(cè)定方面的研究漸漸趨于成熟，但在中國(guó)藥典中還未建立大葉冬青的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了進(jìn)一步完善大葉冬青的質(zhì)量控制，對(duì)近年來(lái)大葉冬青化學(xué)成分的分析方法進(jìn)行了總結(jié)，以期為大葉冬青的化學(xué)成分研究和含量測(cè)定提供幫助。

1 高效液相色譜(HPLC)法

近代HPLC發(fā)展和普及速度飛快，儀器愈發(fā)先進(jìn)，已經(jīng)成為藥企、醫(yī)院、高校和研究所等單位的必備大型儀器。因其具有檢測(cè)便捷，樣品用量小，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床藥物實(shí)驗(yàn)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)化驗(yàn)、高校中藥檢測(cè)、環(huán)境衛(wèi)生檢測(cè)等分析領(lǐng)域最常用的分離分析技術(shù)。

1.1 三萜類成分

三萜類成分主要有五環(huán)三萜和四環(huán)三萜兩大結(jié)構(gòu)特征，在植物中，常以游離形式存在或與糖結(jié)合合成苷類或酯類，具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，因其各官能團(tuán)不同，表現(xiàn)出多種顯著的生物活性[10]，是大葉冬青定性或定量的主要指標(biāo)成分。

王存琴等[11]采集了22批不同批次的大葉冬青葉，選用高效液相色譜法檢測(cè)冬青葉中六種三萜類化合物的含量，在色譜條件中選用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為205 nm，流動(dòng)相采用乙腈-0.4%磷酸水溶液不同比例洗脫，同時(shí)對(duì)22批藥材進(jìn)行指紋圖譜分析。色譜圖結(jié)果顯示27-p-Coumaroyloxy ursolic acid、3β-Hydroxyurs-11-en-28，13β-olide、烏發(fā)醇等6種三萜類成分具有良好的分離性，不同批次大葉冬青中6種三萜類成分含量存在顯著差異。14批同源樣品指紋圖譜相似度較高，均大于0.9，結(jié)果一致性較好。 10批不同來(lái)源的樣品指紋圖譜相似度較低。所建立的方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為有效控制大葉冬青藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

熊果酸和齊墩果酸是極性相似的同分異構(gòu)體，這使得分離更加困難。楊新河等[12]使用Betasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相選用乙腈-水(95∶5)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm，可以很好的分離、測(cè)定苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的含量。黃浩等[13]使用 Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.03%磷酸(90∶10)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為215 nm，也可以很好的分離不同品種苦丁茶中的熊果酸和齊墩果酸。顧學(xué)方等[14]也采用HPLC法在色譜圖上使不同品種苦丁茶中的熊果酸及齊墩果酸分離度大于1.5，同時(shí)采用外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定，其色譜條件是選擇了Agilent HC- C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱，洗脫溶劑選用甲醇和磷酸水，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為215 nm。三種方法均能很好的分離檢測(cè)苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸，且含量測(cè)定結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)冬青科冬青屬的苦丁茶、大葉冬青質(zhì)量較好，隨著隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)，化學(xué)成分含量可能會(huì)有所下降，綜合以上方法，可以應(yīng)對(duì)各個(gè)品種苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的含量測(cè)定，為進(jìn)一步控制大葉冬青的質(zhì)量提供方法依據(jù)。

汪雷等[15]采用HPLC法分析了26批來(lái)自不同地方及不同采收時(shí)間的大葉冬青葉中中α-香樹脂素、羽扇豆醇、豆甾醇、和苦丁冬青苷 D 4種三萜類化合物的含量。其在色譜方法中選擇了YMC-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相等比例洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)定為205 nm。26批藥材中4種三萜類成分含量差異顯著，與采集月份密切相關(guān)，建立的方法準(zhǔn)確可行，重現(xiàn)性好。

1.2 三萜皂苷類成分

三萜皂苷是三萜苷元與糖結(jié)合成苷，其水溶液振搖能產(chǎn)生肥皂樣泡沫。來(lái)源于多種中草藥植物中，如人參、桔梗、甘草、酸棗仁等[16-17]，具有調(diào)節(jié)生理代謝、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、化痰、降低膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血壓等作用[18-19]。關(guān)玥等[20]在大葉冬青化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，采用HPLC法測(cè)定了大葉冬青中大葉冬青皂苷F、大葉冬青皂苷C、苦丁冬青皂苷F等6種三萜皂苷的含量。在HPLC色譜條件中選擇了Wonda Cract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相選用乙腈和水不同比例洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm。含量測(cè)定結(jié)果表明大葉冬青中三萜皂苷的含量在不同產(chǎn)地排序從高到低分別為浙江、江西和安徽。該方法可以同期檢測(cè)大葉冬青中6種三萜皂苷成分的含量，能快速綜合的評(píng)價(jià)大葉冬青藥材質(zhì)量，促進(jìn)大葉冬青和苦丁茶藥材質(zhì)量控制的提升。楊滔[21]等采用采用高效液相色譜法測(cè)定苦丁茶7種三萜皂苷的含量，即大葉冬青苷G、苦丁冬青苷A、大葉冬青苷H和苦丁冬青苷G等。色譜條件中的色譜柱是YMC pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相是乙腈和水不同比例洗脫，在210 nm處設(shè)置紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。高效液相色譜圖可以看出在此條件下7種三萜皂苷分離度良好，旁邊無(wú)明顯干擾成分，從含量測(cè)定結(jié)果中得出，大葉冬青中三萜皂苷總量在廣東和廣西兩個(gè)地域相差不大。方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可作為苦丁茶藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。張俊清等[22]采用高效液相色譜法，色譜條件選用Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相選用乙腈-水(36∶64)，在紫外228 nm處設(shè)置苦丁苷A的檢測(cè)波長(zhǎng)，在紫外261 nm處設(shè)置苦丁苷D的檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定海南大葉冬青葉中苦丁苷A和D的含量，結(jié)果表明，大葉冬青中苦丁苷A和D的含量較高，推測(cè)其可以作為大葉冬青質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。倪帥帥等[23]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-蒸發(fā)光檢測(cè)器(HPLC-DAD-ELSD)法對(duì)綜合分析苦丁茶的指紋圖譜，確定苦丁茶黃酮和皂苷的分布特征。指紋圖譜分析結(jié)果表明10批苦丁茶的指紋圖譜相似度均大于0.90，表明該指紋圖譜方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，重復(fù)性佳，可促進(jìn)苦丁茶冬青藥材的質(zhì)量控制的發(fā)展。對(duì)苦丁茶HPLC-DAD和HPLC-ELSD指紋圖譜的比較分析表明，苦丁茶中黃酮類化合物的含量遠(yuǎn)低于苦丁茶皂苷類化合物的含量。

1.3 黃酮及多酚類成分

多酚物質(zhì)的種類復(fù)雜，主結(jié)構(gòu)特征明顯，按結(jié)構(gòu)大致可分為類黃酮、芪、酚酸和木脂素。黃酮類化合物的基本母核是2-苯基生色酮結(jié)構(gòu)，特征突出，但種類頗多，主要以游離形式存在于中草藥中。具有抗氧化、強(qiáng)化血管壁、抗動(dòng)脈粥樣硬化和降血脂等作用[24-25]。王存琴等[26]采用HPLC法同時(shí)檢測(cè)大葉冬青葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸等10種多酚類化學(xué)成分，分析從不同產(chǎn)區(qū)和不同收獲期采集大葉冬青葉中10種多酚類成分的含量是否存在差異，同時(shí)還選用體外抗氧化化學(xué)方法DPPH法評(píng)估其抗氧化活性。從含量測(cè)定結(jié)果分析得出大葉冬青葉中多酚類成分的總含量豐富，適合秋冬采收。從方法學(xué)實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果得出，該方法重復(fù)性好，方便快速，準(zhǔn)確度高，可為制定大葉冬青的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。尹禮國(guó)[27]采用HPLC法檢測(cè)2種川產(chǎn)苦丁茶中蘆丁的含量，其中女貞子的芽葉和老葉分別為(0.118±0.011)%，(0.083±0.012)%，粗壯女貞的芽葉、老葉(0.082±0.012)%，(0.065±0.008)%。田建平[28]等選擇超聲提取藥材中的綠原酸，采用RP-HPLC法檢測(cè)6種冬青屬苦丁茶中綠原酸的含量，其中苦丁茶采自不同的生長(zhǎng)階段、不同時(shí)期、不同區(qū)域等。對(duì)所有批次苦丁茶中綠原酸的含量分析結(jié)果顯示苦丁茶冬青、霍山冬青、大葉冬青中綠原酸含量較高，野生苦丁茶冬青老葉中綠原酸含量較高，其含量隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)有所下降。Yi H等[29]首次建立了一測(cè)多評(píng)多定量分析(QAMS)方法，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定苦丁茶中18種活性成分。以蘆丁、異綠原酸 A 和苦丁苷A作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，結(jié)果表明，在不同的色譜條件下，各化合物的相對(duì)校正因子具有良好的重現(xiàn)性。

1.4 其他成分

馬應(yīng)丹等[30]首先提取純化了苦丁茶的總嘌呤堿，然后通過(guò)HPLC分離和測(cè)定嘌呤堿。 結(jié)果表明，這種苦丁茶不僅含有咖啡因、茶堿和可可堿，還含有苦丁茶特有的嘌呤堿成分苦丁堿。李宏楊[31]首次采用HPLC法測(cè)定建苦丁茶冬青中白樺酯酸的含量，分析條件為C18反相柱，流動(dòng)相選用甲醇-0.2%磷酸水溶液為84∶16，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm，含量測(cè)定結(jié)果顯示白樺酯酸的平均含量為0.28%，分析方法快速可靠，為大葉冬青的質(zhì)量控制方法的建立提供了基礎(chǔ)資料。

2 其他方法

Zhou J等[32]建立了超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-qTOF-MS/MS)，快速分離鑒定苦丁茶中的化學(xué)成分。通過(guò)UPLC-qTOF-MS/MS對(duì)苦丁茶進(jìn)行色譜分析，鑒定出53種化合物，其中確定已知化合物18種?？傮w數(shù)據(jù)結(jié)果顯示苦丁茶的主要成分是酚酸和三萜。該方法簡(jiǎn)潔有效，為接下來(lái)苦丁茶的全面質(zhì)量控制研究提供了一種潛在的方法。

馮琳琳等[33]首次在一測(cè)多評(píng)法(QAMS)的基礎(chǔ)上采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)苦丁茶冬青中山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、苦丁冬青皂苷 C、苦丁冬青皂苷 E和苦丁冬青皂苷 D等 6種成分的含量。選擇含量較高且穩(wěn)定的苦丁冬青皂苷C為內(nèi)標(biāo)物，測(cè)定和計(jì)算其它5種成分的相對(duì)校正因子，然后利用計(jì)算出的相對(duì)校正因子推算其它5種成分的含量。同時(shí)也用外標(biāo)法(ESM)計(jì)算出6種化學(xué)成分的含量，將QAMS與ESM計(jì)算出的含量進(jìn)行對(duì)比分析，分析結(jié)果提示兩者無(wú)明顯差別。說(shuō)明QAMS測(cè)定苦丁茶冬青中6種成分的方法快速準(zhǔn)確，且節(jié)約標(biāo)準(zhǔn)品，是苦丁茶冬青質(zhì)量控制的優(yōu)選方法。

Fan C等[34]建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-QTOF-MS)多組分測(cè)定與指紋圖譜分析相結(jié)合的方法，用于大葉冬青葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制。該方法具有快速、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可在13 min內(nèi)完成一次色譜多組分測(cè)定和指紋圖譜分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)的多成分測(cè)定和指紋圖譜分析相結(jié)合的策略是一種有效的快速分析藥物的方法，在產(chǎn)地鑒別、真?zhèn)舞b定和藥物質(zhì)量控制等方面具有廣闊的前景。曠春桃等[35]采用氯化鋁法和硝酸鋁-亞硝酸鈉法兩種化學(xué)方法測(cè)定大葉冬青葉中的總黃酮含量。2種方法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程各環(huán)節(jié)及原理對(duì)比表明氯化鋁法在大葉冬青葉提取液中總黃酮的含量測(cè)定穩(wěn)定性與可靠性優(yōu)于硝酸鋁-亞硝酸鈉法。王新等[36]以傳統(tǒng)方法水提醇沉法提取苦丁茶冬青葉多糖，為得到較好的顯色條件，選用了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化顯色條件。多糖的含量測(cè)定選用了經(jīng)典方法苯酚-硫酸法。此法為大葉冬青葉多糖成分的進(jìn)一步研究開發(fā)與應(yīng)用提供了參考依據(jù)。熊波等[37]結(jié)合乙醚超聲萃取和水蒸氣蒸餾兩種傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法提取苦丁茶冬青中的揮發(fā)油，然后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定出揮發(fā)油中的57個(gè)成分，鑒定結(jié)果表明揮發(fā)油中主要是醇、醛、酮、醚、脂肪酸、脂肪酸酯及含氧萜類等化合物。

3 討論

綜上所述，大葉冬青物產(chǎn)豐富，具有多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其主要的含量測(cè)定與質(zhì)量控制的分析方法是HPLC法。HPLC法因其簡(jiǎn)單易懂，且操作方便，深受研究者青睞，但其對(duì)化學(xué)成分含量要求較高，靈敏度次于UPLC和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。而目前采用UPLC、LC-MS方法研究大葉冬青化學(xué)成分含量的文章較少，這和儀器本身價(jià)格昂貴、操作較為復(fù)雜，原理理解有難度等因素有關(guān)。主要總結(jié)了大葉冬青含量測(cè)定與質(zhì)量控制的相關(guān)文章，為后續(xù)大葉冬青的化學(xué)成分研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一些幫助和理論依據(jù)，促進(jìn)其化學(xué)成分的提取與開發(fā)利用。