陳 妍，費(fèi) 蘇，夏永軍，艾連中，王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心 上海 200093）

益生元是膳食補(bǔ)充劑之一，通常不能直接被機(jī)體消化吸收，然而，可以被腸道有益菌發(fā)酵利用刺激其生長繁殖或是激活代謝功能活性，從而改善宿主健康[1-3]。益生元主要包括功能性低聚糖類、多糖類、天然植物提取物以及多元醇等，目前最常見的低聚糖類益生元主要包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和低聚木糖[4-5]。大多數(shù)益生元為碳水化合物且結(jié)構(gòu)多樣、組成復(fù)雜，在人和動(dòng)物的飲食中普遍存在[6]。益生元從動(dòng)、植物中提取得到，由于存在多個(gè)單糖成分，因此更容易被益生菌吸收利用[7]。有大量研究發(fā)現(xiàn)益生元可以改善體內(nèi)菌群豐度，增強(qiáng)益生菌的腸道定植能力，減少有害微生物的代謝，增強(qiáng)機(jī)體免疫，調(diào)節(jié)便秘和腹瀉等[8-11]。合格的益生元應(yīng)具備在人體內(nèi)不被上消化道水解吸收，并且在胃酸的環(huán)境下保持穩(wěn)定，最終到達(dá)結(jié)腸，達(dá)到促進(jìn)腸道有益菌群的生長與繁殖，改善宿主健康的效果。王藝苑等[12]將不同劑量的低聚半乳糖添至初斷乳SD 大鼠飼料中，發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖可有效促進(jìn)大鼠體內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的繁殖，在大鼠糞便中的相對豐度也明顯增加。由于菌株之間具有差異性，各菌株的糖代謝途徑也有所不同，從而導(dǎo)致不同益生菌對益生元的吸收利用也有所不同[13]，亟需探究益生元對菌株的富集作用。

糞便是通過胃腸道代謝出來的生理產(chǎn)物，可以間接反映腸道環(huán)境以及腸道微生物的情況[14]。本研究以小鼠糞便為對象，探究小鼠糞便微生物生長所需限制性營養(yǎng)因子，并通過分析糞便微生物組成結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，得出不同益生元對糞便微生物生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

健康SPF 級雄性C57 BL/6J 小鼠，體質(zhì)量（20± 2）g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號碼：SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)溫度控制在（22 ± 2）℃，相對濕度控制在（50 ± 10）%，12 h 光照和12 h 黑暗交替循環(huán)，在整個(gè)飼養(yǎng)期間小鼠自由飲食飲水。所有涉及動(dòng)物的程序均嚴(yán)格按照中國有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)飼養(yǎng)規(guī)范和法律規(guī)定。

低聚果糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；rTaq Mix，上海生物工程股份有限公司；DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Stool DNA Kit），美國Omega Bio-Tek 公司；瓊脂糖（RA1011-Agarose LE-100G），上海捷瑞生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker，日本寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；酶標(biāo)儀，奧地利美谷分子公司；Ruskinn 低氧厭氧培養(yǎng)工作站，英國Ruskinn 公司；BPHG082 型精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Bioscreen C 全自動(dòng)生長曲線分析儀、Univeral Hood Ⅱ型凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；PCR 儀，上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠糞便樣品制備 10 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，用滅菌后的鑷子收取小鼠糞便，并用無菌水將小鼠糞便溶解成6 mg/mL糞便勻漿后分為5 組，每組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3組平行。5 組分別為：空白組、添加1% MRS 培養(yǎng)液組、添加1%胰蛋白胨組、添加1%低聚果糖組以及同時(shí)添加1%胰蛋白胨組和1%低聚果糖組，添加的益生元均經(jīng)過0.22 μm 水相過濾器過濾。

1.3.2 糞便微生物生長曲線的測定 將上述5 組糞便培養(yǎng)液分別取200 μL 放置Bio-screen 全自動(dòng)生長曲線分析儀的培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每組3 個(gè)平行，測定時(shí)間間隔為3 h。

1.3.3 糞便微生物的體外培養(yǎng) 將糞便培養(yǎng)液分別在添加1%胰蛋白胨低聚果糖和添加1% MRS培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第8 小時(shí)和第24 小時(shí)取出100 μL 并用0.86%生理鹽水稀釋1 000 倍，取100 μL 稀釋液在固體MRS 培養(yǎng)基上涂布，并放置在Ruskinn 低氧厭氧培養(yǎng)工作站中，37 ℃培養(yǎng)36 h 后進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)。

在固體MRS 培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化并挑出純化分離后的單菌落，將其接種于1 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后離心（5 000×g，15 min）收集菌體。用16S rRNA 通用引物27F（5’-RGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，執(zhí)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃維持10 min。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 產(chǎn)物寄送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，測序的結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行局部序列比對。

1.3.4 糞便微生物的多樣性檢測 參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法，采用E.Z.N.A.soil 試劑盒使用說明書對小鼠糞便的總DNA 進(jìn)行提取，利用NanoDrop2000 對DNA 濃度和純度進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取的質(zhì)量。以16S rDNA 的中V3-V4 可變區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[16-17]，引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3'），使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒切膠回收純化，Tris-HCl 洗脫并采用2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST 進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300 的文庫。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對本實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營養(yǎng)物質(zhì)對糞便微生物生長的影響

按照1.3.1 節(jié)所述的方法添加相應(yīng)的益生元，利用Bio-screen 全自動(dòng)生長曲線分析儀測定OD600nm，反應(yīng)糞便微生物生長情況。如圖1 所示，糞便微生物在無額外添加（空白組）以及添加了1%低聚果糖組中無生長，而添加1% MRS 組迅速進(jìn)入對數(shù)生長期并在6 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，表明其對糞便微生物的生長具有明顯的促進(jìn)作用。添加1%胰蛋白胨組的糞便微生物在前9 h 內(nèi)無明顯生長，隨后生長迅速，而與MRS 組相比生長緩慢；添加1%胰蛋白胨+1%低聚果糖組在第3 小時(shí)開始進(jìn)入對數(shù)生長期并在15 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD 值介于添加1% MRS 組和添加1%胰蛋白胨組之間。這些結(jié)果表明小鼠糞便中自身的物質(zhì)無法提供糞便微生物生長所需的營養(yǎng)，而單獨(dú)添加氮源時(shí)，糞便微生物顯著生長，單獨(dú)添加碳源時(shí)，糞便微生物不生長，這說明氮源是糞便微生物生長的限制性因子，也證實(shí)了氮源是微生物生長中不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)之一[18]。同時(shí)添加碳源和氮源組與添加1% MRS 組生長情況相似，具有經(jīng)典的延滯期、指數(shù)生長期以及穩(wěn)定期，這些結(jié)果表明MRS中的其它營養(yǎng)物質(zhì)不是影響糞菌生長的重要限制性因子，也說明糞便本身也能夠提供這些營養(yǎng)物質(zhì)。

圖1 不同C 源、N 源添加組糞便微生物生長曲線Fig.1 Growth curves of fecal microorganisms with different carbon source and nitrogen source

2.2 不同方式富集糞便微生物后體外培養(yǎng)及鑒定研究

在只添加氮源體外培養(yǎng)時(shí)，篩選結(jié)果主要集中在致病菌鎵腸球菌等，而乳桿菌數(shù)量很少，表明單獨(dú)添加氮源不適合用于腸道乳桿菌的篩選（圖1），因此沒有對其進(jìn)一步的研究。對比1%胰蛋白胨+1%低聚果糖組和1% MRS 組，可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至8 h 時(shí)，這兩組的乳桿菌數(shù)量和種類相似，而在培養(yǎng)24 h 后，約氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的數(shù)量顯著增加，表明富集培養(yǎng)后乳桿菌的數(shù)量增加，尤其是添加MRS 組，約氏乳桿菌占主導(dǎo)地位。

表1 糞便微生物體外培養(yǎng)鑒定結(jié)果Table 1 Results of in vitro culture and identification of fecal microorganisms

2.3 不同方式富集后糞便微生物的多樣性研究

2.3.1 16S rRNA 測序質(zhì)量評估 稀釋曲線可評估樣本的測序量是否足夠且合理，同時(shí)也可以間接反映不同樣本的物種豐富度[19]。依據(jù)送測的數(shù)據(jù)量以及分類水平下的物種量進(jìn)行作圖，得到稀釋性曲線如圖2 所示，所選的指數(shù)為sobs 指數(shù)和Shannon 指數(shù)。

由圖2 可知，sobs 指數(shù)顯示隨著抽取樣品的測序量增多，觀測到的物種數(shù)量也在不斷增加；Shannon 指數(shù)表現(xiàn)出曲線隨樣品序列數(shù)目的增加趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)量趨于飽和，表明本次測序數(shù)量飽和，質(zhì)控較好，測序結(jié)果能夠反映糞便微生物中菌群的多樣性信息以便滿足后續(xù)分析的要求。

圖2 各組糞便樣品測序的稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of fecal sample in each group

2.3.2 基于門、屬分類水平的分析 根據(jù)微生物物種組成分析可知樣本在各分類水平上的比對情況[20]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，能夠觀察到樣本在門、綱、目、科、屬這5 個(gè)水平的群落結(jié)構(gòu)[21]。為了進(jìn)一步分析糞便微生物菌的群落組成結(jié)構(gòu)，對不同分類水平上優(yōu)勢菌的相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本文重點(diǎn)分析了糞便微生物在門水平和屬水平的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 糞便微生物在門水平與屬水平的群落組成Fig.3 The community structure of fecal microorganisms at the phylum level and genus level

圖3a 顯示糞便微生物在門水平上的群落組成，與正常小鼠的糞便組成相比，其它4 組的擬桿菌（Bacterodietes）的百分比均表現(xiàn)出明顯下降。添加了1%胰蛋白胨組和添加1% MRS 組在門水平上的群組成較為相似，而與正常小鼠糞便群落結(jié)構(gòu)相比，厚壁菌門（Firmicutes）的豐度明顯升高，從54.90%上升至89.24%和89.38%，其它菌的比例均有不同程度的下降。添加了1%胰蛋白胨組和空白組的變形菌門（Proteobacteria）明顯上升并成為主導(dǎo)菌門，物種百分比從0.34%上升至59.55%和76.05%，而厚壁菌門的豐度下降，從54.90%下降到24.25%和15.97%。

圖3b 顯示糞便微生物在屬水平上的群落組成，與正常小鼠糞便組成相比，在屬水平上，空白組與添加1%胰蛋白胨組的大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Esherichia-Shigella）明顯上升成為主導(dǎo)菌屬，占比分別為66.98%和59.09%，而另外兩組下降到0.01%；梭桿菌屬（Feacalibacterium）由32.53%分別下降至4.38%，3.22%，5.88%和2.37%，說明4種處理方式均不利于梭桿菌屬的生長繁殖。雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）由9.46%分別下降至1.13%，0.62%，1.34%和3.14%。乳桿菌屬（Lactobacillus）由10.92%變?yōu)?.87%，7.59%，79.63%和86.07%，這些結(jié)果有力地證實(shí)了乳桿菌屬的生長同時(shí)需要碳源和氮源。綜上可得，小鼠腸道內(nèi)的乳酸菌的生長需要同時(shí)添加碳源和氮源。

2.3.3 糞便樣品主成分分析 對小鼠分均樣品進(jìn)行主成分分析，通過圖中的樣品點(diǎn)的距離可以判斷個(gè)體或群體之間的差異，點(diǎn)距離越近說明樣品間微生物群落組成越相似，距離越遠(yuǎn)說明樣品間微生物群落組成差異越大，其結(jié)果如圖4 所示。

如圖4 所示，其它4 組在PC1 和PC2 坐標(biāo)上均與正常小鼠糞便F 組有一定的距離，說明不同的處理方式，對糞菌組成影響較大，空白組K 與添加1%胰蛋白胨組A 相似度極高，緊密處于主坐標(biāo)的左下角，證明兩組樣品的菌落組成相似。添加1%胰蛋白胨+1%低聚果糖組與添加1% MRS 組，在坐標(biāo)軸的同一位置說明這兩組組成相似，然而，與空白組、添加1%胰蛋白胨組相比，群落組成發(fā)生了明顯的變化。

圖4 小鼠糞便微生物樣品的主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal component analysis of microorganism in the mice feces

2.3.4 不同培養(yǎng)時(shí)間后糞便微生物變化分析 組間重疊部分的Venn 圖的能夠直觀的觀察到每組小鼠糞便樣品中所共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目，從而直觀地反映不同樣品微生物群落的相似程度[22]。

如圖5 所示，4 組樣品共有的OTU 數(shù)目為193，獨(dú)有的數(shù)目B1 組為18，B2 組為16，M1 組為12，M2 組為5，這表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長，不同水平的糞菌逐漸得到富集，因此，兩種處理方式獨(dú)有的微生物會(huì)減少。比較8 h 和24 h 兩種處理方案的OTU 數(shù)目，B 組OTU 從315 下降到303，M組OTU 從272 下降到255，均呈現(xiàn)下降趨勢，也證實(shí)了同種處理方式，隨時(shí)間的加長，糞菌相似性增加特有的微生物減少，因此培養(yǎng)8 h 后進(jìn)行菌株分析較為合適，否則優(yōu)勢菌株將占絕對優(yōu)勢，減少多樣性。M 組整體上OTU 的數(shù)目比B 組要低，說明MRS 的富集效果比只添加低聚果糖和胰蛋白胨的富集效果更為顯著，而且由于富集顯著減少了菌群多樣性，因此用胰蛋白胨和低聚果糖處理更加合適。

圖5 樣品中OTU 的數(shù)目Fig.5 The number of OTU in sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對小鼠糞便處理，通過添加胰蛋白胨，低聚果糖等來探究小鼠糞便微生物生長所需限制性營養(yǎng)因子，在糞菌的生長過程中，可以看出依賴自身的營養(yǎng)物質(zhì)是無法生長的，而添加了氮元素的糞菌得到明顯生長，表明氮元素是糞菌生長的限制性營養(yǎng)因子，MRS 培養(yǎng)基中除了碳源和氮源之外的其它物質(zhì)雖會(huì)對乳酸菌的生長有一定的有益作用，但不起決定性作用。糞便微生物的體外篩菌的結(jié)果表明，單獨(dú)氮源并不適合糞便微生物的微生物篩選，MRS 雖能有效富集腸道菌群，但是優(yōu)勢菌株占明顯優(yōu)勢，尤其是培養(yǎng)24 h 后，菌群多樣性明顯降低。同時(shí)添加低聚果糖和胰蛋白胨培養(yǎng)8 h 后，物種豐度和多樣性均較好，此時(shí)最適合糞便微生物的體外篩選。