鄭秀娥 崔濤 郭金雙 楊陽 李國勇 王玉 夏文龍 山東省食品藥品審評查驗中心 （山東 濟南 250014）

內容提要： 環(huán)孢霉素和他克莫司檢測試劑作為風險比較高的第二類體外診斷試劑，在體外診斷中具有重要的臨床檢測意義?；谠擃愃幬餀z測試劑的特殊性，文章旨在通過對產(chǎn)品在注冊技術審評過程中的要點分析，對注冊申請人在產(chǎn)品的研發(fā)和注冊過程中提供一些思路和幫助。

環(huán)孢霉素和他克莫司作為常用的免疫抑制劑，主要用于抗器官移植排斥反應，還可應用于治療某些自身免疫性疾病，臨床應用較廣。由于環(huán)孢霉素和他克莫司生物利用度個體差異大，血藥濃度與療效及毒性密切相關，且血藥濃度易被多方面因素影響，定時對患者體內環(huán)孢霉素和他克莫司的血藥濃度監(jiān)測，制定個體化給藥方案，對提高器官移植的存活率，促進環(huán)孢霉素和他克莫司在臨床的合理應用具有重要的臨床意義。目前臨床檢測環(huán)孢霉素和他克莫司的常用方法包括化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、熒光免疫層析法、（超）高效液相色譜-串聯(lián)質譜法、免疫比濁法等。其中以高效液相色譜-串聯(lián)質譜法、化學發(fā)光法和熒光免疫層析法為主，不同方法學產(chǎn)品有各自的優(yōu)缺點，可以滿足不同等級醫(yī)療機構、不同應用環(huán)境下的臨床使用要求。據(jù)統(tǒng)計，全國范圍內，此類已批準上市的產(chǎn)品10余個，正在研發(fā)或者準備申報注冊的產(chǎn)品有很多，因此本文對注冊申請人在產(chǎn)品的研發(fā)和注冊申報具有非常重大的意義。

1.適用范圍及管理類別

本文所指環(huán)孢霉素和他克莫司檢測試劑是用于體外定量檢測人體全血中環(huán)孢霉素和他克莫司的含量。全血是與器官移植相關重要科研組在共識聲明中推薦使用的基質[1-4]。如使用其他基質進行檢測，則需要利用源于藥物治療患者的樣本進行研究證明與全血中分析物具有較強相關性。該產(chǎn)品在《體外診斷試劑分類規(guī)則》中屬于藥物及藥物代謝物檢測的試劑，管理類別為Ⅱ類，境內注冊人應向各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理部門申報該產(chǎn)品，境外注冊人應向國家藥品監(jiān)督管理局申報該產(chǎn)品，并應按照《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》的要求提交注冊申請資料。

2.非臨床部分

2.1 產(chǎn)品風險管理分析

目前尚不清楚環(huán)孢霉素和他克莫司產(chǎn)品對患者健康造成的直接風險，但無法正確進行測試或結果解釋存在錯誤可能對患者造成不當管理風險。錯誤地低報環(huán)孢霉素或他克莫司測定結果可能會作出將劑量升高到超出治療獲益劑量的決定，這可能會增加藥物毒性風險；而錯誤地高報環(huán)孢霉素或他克莫司測定結果則可能作出將劑量降低到免疫抑制所需劑量之下的決定，這可能增加植入器官排斥的風險。對于環(huán)孢霉素或他克莫司，目前尚無固定的治療范圍?；颊叩淖罴阎委煼秶Q于諸多因素，如移植物類型、患者敏感性、合并用藥和移植后的時間以及所采用具體商業(yè)化分析的代謝物交叉反應性。因此，根據(jù)測定結果來調整治療方案而不考慮其他臨床因素可能構成一定的風險。

進行風險分析時，應識別出產(chǎn)品的其他特定風險，并對風險分析方法進行描述。如果可以選擇使用其他方法來解決所識別出的特定風險，或已識別出不同于本指南中風險的其他風險，應提供詳細信息來支持所采用的、解決該風險的方法。

2.2 分析性能研究

該產(chǎn)品應在有效質量管理體系下生產(chǎn)且質量穩(wěn)定，其主要原材料、生產(chǎn)工藝經(jīng)過選擇和確認后才可進行性能研究及注冊申報。如果聲稱適用不同機型，則需要在不同機型上（酶標儀除外）分別進行性能研究。

由于患者樣本能真實反映游離藥物和結合藥物、代謝產(chǎn)物以及其他合并服用的藥物對產(chǎn)品檢測結果的影響，性能評估時應盡可能納入預期使用人群（即攝入環(huán)孢霉素或他克莫司的患者）的樣本進行評價。確需使用加標樣本進行研究時，應提供關于藥品純度、代謝產(chǎn)物或潛在干擾物質、樣品類型的信息等。添加分析物時，加入體積應盡可能少，并應確保在每項分析中都包含所有的分析步驟（如細胞裂解、提取和離心等）。

分析性能評估主要包括樣本穩(wěn)定性，適用的樣本類型，校準品的量值溯源和質控品的賦值，準確度/正確度，精密度，空白限、檢出限及定量限，分析特異性，高劑量鉤狀效應，測量區(qū)間及可報告區(qū)間，反應體系等項目的研究資料，應當采用多批產(chǎn)品進行性能評估。

2.2.1 樣本穩(wěn)定性

應充分考慮實際使用過程中樣本采集、處理、運輸及保存等各個階段的條件，對樣本的穩(wěn)定性進行評價并提交研究資料。內容包括建議的保存條件、允許的凍融周期、添加劑（如抗凝劑）和運輸條件（如涉及）等。

2.2.2 校準品的量值溯源和質控品的賦值

應明確申報產(chǎn)品適用的校準品和質控品。對試劑配套校準品的量值溯源進行研究（如溯源鏈及逐級傳遞過程），對質控品賦值及其質控范圍如何確定進行研究（應當提交在所有適用機型上進行賦值和驗證的資料）。同時，應對校準品的性能指標進行評估，如果校準品/質控品的基質不同于臨床常用樣本類型（血清、血漿、尿液等），還應提交基質效應的研究資料。

2.2.3 正確度

正確度指無窮多次重復測量所得量值的均值與參考量值的一致程度。正確度一般由系統(tǒng)測量誤差決定，用偏倚來表示，可采用方法學比對（與對比試劑、參考測量程序或診斷準確度標準比較）、參考物質檢測或回收試驗等方式。

使用參考物質的正確度評價是優(yōu)先推薦的方法，一般以相對偏差來表示，目前該產(chǎn)品無相應國家標準品發(fā)布，如有，則優(yōu)先采用國家標準品進行準確度研究。參考物質包括具有互換性的有證參考物質、公認的參考品、標準品，參考測量程序/參考方法賦值的臨床樣本等。

使用患者樣本的正確度評價時，應采用參考測量程序或臨床應用廣泛、質量得到普遍認可的已上市同類試劑進行比對，如條件允許，建議與具有相同溯源性的分析系統(tǒng)作比對。申報試劑和對比方法同時檢測患者樣本，通過比較兩種方法之間的系統(tǒng)誤差，對申報試劑進行正確度評價。應在多天進行檢測，患者樣本的濃度水平應覆蓋申報試劑的測量范圍并盡量均勻分布。

當采用回收實驗時，將已知量的環(huán)孢霉素或他克莫司添加到不含藥物或含有已知藥物濃度的臨床樣本中（包括向服用環(huán)孢霉素或他克莫司患者樣本中加標），配制成回收樣品，進行檢測。加標樣本的終濃度應覆蓋大部分的線性范圍。應當檢測至少三個水平的回收樣品，代表試劑測量范圍的高、中、低濃度，每個濃度重復檢測（至少3～5次重復）。

2.2.4 精密度

精密度反映的是多次測定結果之間接近的程度，由隨機測量誤差決定，通常用標準差、方差或變異系數(shù)表示，主要包括重復性、中間精密度和再現(xiàn)性。建議對檢測范圍內至少3個濃度水平的精密度進行評估。3個濃度分別為：①治療效果不佳范圍或可報告范圍下限；②在治療范圍內的濃度；③接近可報告范圍或毒性范圍的濃度。精密度研究可能涉及多天、多地點檢測，應確保樣本的穩(wěn)定性和一致性，可將樣本等分保存。具體研究方法建議參考相關文件等。

研究時應注意樣本類型（例如，患者樣品、加標樣本等）、時間（天數(shù)、運行次數(shù)）、儀器、運行/分析批、地點、環(huán)境條件（實驗室溫度、濕度、空氣質量、管理等條件）、校準（校準品批次，校準周期）、試劑批次、操作者等對研究結果的影響。

2.2.5 分析特異性

應評估分析待測樣本中和試劑使用過程中潛在的交叉反應和干擾物質，并對干擾和交叉的程度進行量化。

2.2.5.1交叉反應研究環(huán)孢霉素包含的代謝物有AM1，AM4n，AM9，AM19，AM1c，AM1c9。他克莫司包含的代謝物有MⅠ，MⅡ，MⅢ，M Ⅳ，M Ⅴ，M Ⅵ，M Ⅶ，M Ⅷ。應當盡可能對以上代謝物進行研究。這些研究涉及將代謝物加標到不含藥物的全血中，對加標樣品的重復性進行評估并對所用代謝物的濃度進行描述。

2.2.5.2干擾物質研究

干擾物質研究應當考慮常見的內源性干擾、外源性干擾和已有報道的干擾物質等對產(chǎn)品檢測結果的影響。

該類產(chǎn)品常見的干擾物包括但不限于以下物質：①常見的內源性干擾物質包括膽紅素、甘油三酯、膽固醇、尿酸、類風濕因子、血細胞容積率、白蛋白、丙種球蛋白、人抗鼠抗體等。②常見的外源性干擾物質包括樣本添加劑（抗凝劑或防腐劑），常見的合并用藥包括但不限于：環(huán)孢霉素、他克莫司、霉酚酸及其代謝物（MPAG）、雷帕霉素、一般非處方藥等。

注冊申請人除對添加干擾物的樣本進行研究外，亦可采用患者標本通過對比申報試劑與其他測量程序的檢測結果，進行干擾影響的評價。

2.2.6 線性區(qū)間

首先應通過對濃度已知的樣本進行評估以確定檢測的線性區(qū)間。選擇的樣本濃度應均勻分布在試驗的線性區(qū)間內，適當?shù)闹貜痛螖?shù)和濃度水平取決于檢測的可報告區(qū)間。建議選擇7～11 個不同濃度樣本（建議用高值和零濃度/低值濃度的樣本按比例精確配制），比預期線性區(qū)間寬20%～30%，每個濃度樣本檢測2～4次。逐漸減少濃度點，直到有可接受的線性區(qū)間。

對于跨越更寬濃度范圍的環(huán)孢霉素，應對額外濃度水平進行評估（例如，以50ng/mL為增量）。

如聲稱對超出線性區(qū)間濃度的樣本可以進行稀釋后再檢測，那么應研究適用的稀釋液和聲稱的稀釋倍數(shù)，從而確定試劑的可報告區(qū)間。

2.2.7 空白限（LoB）、檢出限（LoD）與定量限（LoQ）

應當包括建立和驗證兩部分內容。LoB，LoD，LoQ的研究需選擇多個樣本（空白樣本、低濃度水平樣本、已知濃度的低水平樣本），在多天內進行研究。定量限應考慮偏倚和精密度的要求，滿足預設準確度指標。

2.2.8 高劑量鉤狀效應（如適用）

一些免疫測定方法可能表現(xiàn)出“高劑量鉤狀效應”，即在高濃度時，待測物濃度與響應度呈現(xiàn)出與校準曲線相反的數(shù)量關系。在適用情況下（例如，雙位點或夾心免疫測定法），應將線性區(qū)間研究擴展到可報告區(qū)間之外，達到可能在臨床條件下遭遇的最高濃度，以評估該試劑是否存在高劑量鉤狀效應并提交研究資料。

2.3 穩(wěn)定性研究

一般應包含研究方案、報告和數(shù)據(jù)。

2.3.1 實時穩(wěn)定性（貨架有效期）

對至少三批產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的實時穩(wěn)定性進行研究。明確儲存的環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期。

2.3.2 使用穩(wěn)定性

對產(chǎn)品實際使用期間的穩(wěn)定性進行研究，包括所有組成成分的開封穩(wěn)定性，適用時還應對復溶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性及組分的凍融次數(shù)進行研究。如果涉及校準品，還應該提交校準頻率或校準穩(wěn)定性的研究資料。研究過程中需明確產(chǎn)品使用的溫度、濕度條件等。

2.3.3 運輸穩(wěn)定性

對申報產(chǎn)品可在特定或者預期的條件下運輸進行研究，應說明產(chǎn)品正確運輸?shù)沫h(huán)境條件（如溫度、濕度、光照和機械保護等）。同時說明產(chǎn)品的包裝方式以及暴露的最差運輸條件。

試劑穩(wěn)定性內容的研究結果應在說明書“儲存條件及有效期”中進行詳細說明。

2.4 參考區(qū)間和治療范圍

對于正常未使用環(huán)孢霉素和他克莫司藥物的人群樣本中無可檢出的環(huán)孢霉素和他克莫司及其代謝產(chǎn)物，因此此類試劑不涉及參考區(qū)間的內容。

治療范圍濃度取決于所采用的方法學和個體患者的臨床狀態(tài)，無法確定環(huán)孢霉素和他克莫司具體的治療范圍。但應當結合權威文獻或研究內容說明缺少確定的治療范圍的警告性解釋，并就患者差異和測試差異進行討論。

例如：環(huán)孢霉素/他克莫司無確定的治療范圍。臨床狀態(tài)復雜程度、個體對于環(huán)孢霉素/他克莫司的免疫抑制和效應敏感性的差異、合并使用其他免疫抑制劑、移植物類型、移植后時間和許多其他因素導致對藥物最佳血液水平的要求不同。因此，不得將個體的數(shù)值作為變更治療方案的唯一指標，并且，在改變治療方案前，應對每名患者進行充分的臨床評估并根據(jù)臨床經(jīng)驗來確立自己的范圍。

2.5產(chǎn)品技術要求及檢驗報告

產(chǎn)品技術要求應按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》和編制要求的相關規(guī)定進行編寫。同時結合產(chǎn)品具體適用的指導原則或相關國家標準、行業(yè)標準以及產(chǎn)品的特點，明確保證產(chǎn)品安全、有效、質量可控的各項性能指標和檢驗方法。

2.5.1 適用的產(chǎn)品標準

產(chǎn)品應當執(zhí)行適用的強制性標準。對于強制性行業(yè)標準，若產(chǎn)品結構特征、技術原理、預期用途、使用方式等與強制性標準的適用范圍不一致，申請人應當提出不適用強制性標準的說明，并提供經(jīng)驗證的證明性資料。

2.5.2 產(chǎn)品技術要求

2.5.2.1主要性能指標

該產(chǎn)品主要包括以下性能指標：試劑的外觀、裝量、空白限、檢出限及定量限、準確度/正確度、線性區(qū)間、精密度、高劑量鉤狀效應、特異性、穩(wěn)定性等，校準品的性狀、裝量（液體適用）、水分含量（如適用）、賦值結果及其不確定度的表示方式、正確度、均勻性、穩(wěn)定性等，質控品的外觀、裝量、預期結果、均勻性、穩(wěn)定性等。具體產(chǎn)品的性能指標需結合方法學本身特性，確定其性能指標或者提供此指標不適用的說明。

2.5.2.2檢驗方法

產(chǎn)品的檢驗方法應根據(jù)性能指標設定，優(yōu)先采用公認的或已頒布的標準的檢驗方法；對于自建的檢驗方法，需提供相應的方法學依據(jù)及理論基礎，同時應保證檢驗方法具有可操作性和可重現(xiàn)性，必要時可附相應圖示進行說明，文本較大的可以附錄形式提供。

2.5.3 產(chǎn)品檢驗報告

在保證產(chǎn)品原材料和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可靠的基礎上，采用在符合醫(yī)療器械質量管理體系相關要求的條件下生產(chǎn)的產(chǎn)品進行檢驗。有適用的國家標準品的，應當使用國家標準品對產(chǎn)品進行檢驗?？商峤灰韵氯我恍问降臋z驗報告：①申請人出具的自檢報告。②委托有資質的醫(yī)療器械檢驗機構出具的檢驗報告。

如產(chǎn)品提交自檢報告，還需按照《醫(yī)療器械注冊自檢管理規(guī)定》的要求提交相應資料。

3.臨床評價部分

環(huán)孢霉素和他克莫司測定試劑已經(jīng)列入《關于發(fā)布免于臨床試驗體外診斷試劑目錄的通告》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第70號）中目錄中。根據(jù)體外診斷試劑臨床評價的相關要求，申請人可按照《免于臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價技術指導原則》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第74號）要求進行臨床評價。

申請人也可通過臨床試驗的方式對產(chǎn)品進行臨床評價，臨床試驗的倫理、方案的制定以及報告的撰寫等臨床試驗資料均應符合《國家藥監(jiān)局 國家衛(wèi)生健康委關于發(fā)布《醫(yī)療器械臨床試驗質量管理規(guī)范》的公告（2022年第28號）》《關于發(fā)布體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則的通告》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號）對臨床評價資料的規(guī)定。

下面僅對該產(chǎn)品臨床評價中的重點問題進行闡述。

3.1 樣本要求

應選擇濃度覆蓋線性/測量區(qū)間的預期適用人群樣本和干擾樣本進行研究，并注意測量區(qū)間內的各個濃度水平均應包含一定數(shù)量的樣本。

樣本采集方式及穩(wěn)定性應符合待評價試劑和對比試劑說明書有關要求。原則上，應采用臨床真實樣本進行研究。當真實樣本濃度無法覆蓋檢測范圍時，應充分闡述無法獲得的依據(jù)，可適當采用稀釋或者經(jīng)處理去除環(huán)孢霉素或他克莫司獲得低濃度樣本、添加環(huán)孢霉素或他克莫司獲得高濃度樣本等人工制備樣本。人工制備樣本應充分考慮樣本的背景信息，基質效應等影響因素。

充分考慮不同治療方案（移植物等）、人群選擇、地域選擇、年齡范圍、移植后的時間和抽血時間（谷濃度及其他與給藥相關的時間點等）等與給藥相關的因素等內容，所采用的樣本應能充分評價產(chǎn)品臨床使用的安全性、有效性和質量可控性。

3.2 方法學比對

3.2.1 與已上市同類試劑的比對

應選擇境內已經(jīng)取得上市許可、目前臨床普遍認為質量較好的產(chǎn)品作為對比試劑，同時應充分了解對比試劑的技術信息，包括臨床預期用途、基本原理、性能指標等。建議企業(yè)盡量選擇方法學相同、線性區(qū)間及精密度等性能接近的同類試劑作為參比試劑[7]。如免疫試驗法，可利用與新器械具有相似免疫分析技術的等同器械進行比較研究。

3.2.2 與參考方法的比對

鑒于與已上市同類試劑的比對所能提供的性能信息較為有限，且抗體對待檢藥物/化合物的反應性不同，以及考慮到交叉反應等因素，可利用高效液相色譜法、隨訪信息在內的臨床信息等作為參考測量程序或診斷準確度標準[7]。應根據(jù)待測化合物特性選擇適宜的參考方法。

3.3統(tǒng)計學分析

在完成數(shù)據(jù)收集后，應先繪制散點圖和差異圖，對數(shù)據(jù)進行分析和審查，觀察數(shù)據(jù)是否覆蓋了線性/測量區(qū)間以及是否存在離群值，并初步了解待評價試劑和對比試劑測量值之間的潛在變異特征，確定如何更好地表征這些差異。

然后根據(jù)散點圖和差異圖判斷數(shù)據(jù)是否滿足相應的假設前提，并據(jù)此確定最佳的回歸分析方法。常見的回歸分析方法包括Deming回歸、Passing-Bablok回歸分析和最小二乘回歸等，并對其進行假設檢驗以評價二者偏倚。

4.小結

本文基于現(xiàn)行法規(guī)和注冊申報資料的要求，總結分析了環(huán)孢霉素和他克莫司檢測試劑注冊申報中相關技術文件的審評要點。對非臨床部分的風險分析、分析性能研究、穩(wěn)定性研究、參考區(qū)間研究、產(chǎn)品技術要求、檢驗報告及臨床評價部分等方面作一概述，希望能夠為注冊申請人在環(huán)孢霉素和他克莫司檢測試劑產(chǎn)品的研發(fā)和注冊過程中提供一定的參考和幫助，同時也為醫(yī)療器械監(jiān)督管理部門對注冊申報資料的審評提供技術參考。