左 琳，李 圓，郭永強(qiáng)，孫 騰，曹濟(jì)民

(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001； 2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心)

蛙心灌流實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)生理學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，第一個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的發(fā)現(xiàn)就是通過蛙心灌流實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證的[1]。奧地利科學(xué)家奧托·勒維是該實(shí)驗(yàn)的操作者，他分別分離了兩只青蛙的心臟，一只保留了迷走神經(jīng)，而另一只去除了迷走神經(jīng)。當(dāng)刺激迷走神經(jīng)時(shí)，與之相連的心臟跳動(dòng)明顯減弱；將該心臟的“任氏液”灌流另一只切斷迷走神經(jīng)的青蛙心臟時(shí)，其跳動(dòng)也明顯受到抑制。這一結(jié)果提示：切斷迷走神經(jīng)的青蛙心臟受到的抑制效應(yīng)，應(yīng)該是來自灌流溶液中的某種化學(xué)物質(zhì)。奧托·勒維推測這種化學(xué)物質(zhì)可能是迷走神經(jīng)末梢釋放的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論支持了迷走神經(jīng)不是通過“電傳遞”，而是通過“化學(xué)傳遞”影響心臟功能的觀點(diǎn)。這一結(jié)論奠定了神經(jīng)興奮化學(xué)傳遞學(xué)說的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，奧托·勒維因此也獲得了1936年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。因此，該方法在生理學(xué)的發(fā)展史上有著里程碑的意義。

目前，許多醫(yī)學(xué)類高校的本科生培養(yǎng)中都采用了蛙心灌流實(shí)驗(yàn)，利用該實(shí)驗(yàn)可以觀察一些理化因素對(duì)于離體蛙心功能活動(dòng)的影響，在生理學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中有著不可替代的作用。但多年的一線教學(xué)讓我們發(fā)現(xiàn)，蛙心灌流實(shí)驗(yàn)的操作流程仍存在一些問題，有待于進(jìn)一步改進(jìn)：①學(xué)生在結(jié)扎入心的靜脈時(shí)，常因搞不清白線的位置而將靜脈竇誤扎，這一操作的直接后果將導(dǎo)致心跳驟停，實(shí)驗(yàn)宣告失敗。②在結(jié)扎入心的靜脈時(shí)，學(xué)生需要從兩個(gè)主動(dòng)脈干的下方進(jìn)行穿線，而有些學(xué)生誤將絲線從一個(gè)主動(dòng)脈干的下方穿過，而從另一個(gè)主動(dòng)脈干的上方穿過，這樣操作導(dǎo)致一側(cè)的主動(dòng)脈干和靜脈一起被結(jié)扎，進(jìn)而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。③傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)流程中，學(xué)生在右側(cè)主動(dòng)脈干結(jié)扎后，要繼續(xù)結(jié)扎左側(cè)的主動(dòng)脈干，然后在左主動(dòng)脈干上剪口，進(jìn)而做動(dòng)脈插管[2，3]。在這一系列的操作中，由于左右兩側(cè)主動(dòng)脈干都被結(jié)扎，血液流出心臟的通道被完全阻斷，心臟的后負(fù)荷無限增大。如果學(xué)生不及時(shí)在動(dòng)脈上剪口進(jìn)行壓力的釋放，心臟將由于長時(shí)間無法順利射血，進(jìn)而出現(xiàn)心功能下降、對(duì)理化物質(zhì)的反應(yīng)性減弱等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。④在進(jìn)行心室插管的過程中，插管尖端要在心室收縮期通過動(dòng)脈瓣進(jìn)入心室[4]，這一操作的技術(shù)難度較大。由于學(xué)生無法看到瓣膜的位置和開閉情況，因此，操作中往往因過度用力而導(dǎo)致瓣膜損傷，甚至心臟穿孔，這也將影響到離體心臟的功能及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)操作流程的改進(jìn)

1.1 牛蛙的抓取、毀髓、開胸、暴露心臟

牛蛙或蟾蜍的抓取及毀髓：教師用左手中指、無名指和小指分別固定動(dòng)物的前肢和后肢；上抬或下壓頭部來尋找枕骨大孔的位置(圖1A和1B)，位置確定后，用刺蛙針沿枕骨大孔垂直刺入，并向前進(jìn)入顱腔，搗毀腦組織；向后進(jìn)入椎管，旋轉(zhuǎn)向下刺入，動(dòng)物出現(xiàn)下頜呼吸運(yùn)動(dòng)消失、四肢肌張力消失時(shí)，說明此時(shí)毀髓成功。

開胸暴露心臟：教師將毀髓成功的動(dòng)物仰臥位固定于蛙板上(圖1C)；沿劍突下緣做一橫切口，并沿胸骨正中線剪開胸骨、暴露心臟(圖1D)[4]。

圖1 牛蛙的抓取、毀髓及開胸過程

1.2 心室插管前血管的分離、結(jié)扎過程

教師分別在左主動(dòng)脈干和左右兩根主動(dòng)脈干的下方穿線(圖2A)，并結(jié)扎左主動(dòng)脈干(圖2B)。這一操作過程中，教師不再提前結(jié)扎右主動(dòng)脈干和入心的靜脈，這是區(qū)別于傳統(tǒng)方法的主要操作點(diǎn)之一。

圖2 心室插管前血管的分離及結(jié)扎

1.3 心室腔插管

教師左手牽拉左主動(dòng)脈干遠(yuǎn)心端結(jié)扎線，在左主動(dòng)脈干上剪一魚嘴型切口；將裝有任氏液的動(dòng)脈插管斜面向下插入左主動(dòng)脈干內(nèi)(圖3A)，至動(dòng)脈圓錐根部；此時(shí)，將心臟的縱軸方向調(diào)整至和插管相平行的位置，在心室收縮期，將插管向下后方插入心室腔內(nèi)(圖3B)；用預(yù)留的結(jié)扎線將左右主動(dòng)脈干及動(dòng)脈插管一同結(jié)扎，并在插管側(cè)面的小勾上打結(jié)進(jìn)行二次固定(圖3C)，防止心臟滑脫。

圖3 心室腔插管

1.4 游離心臟

教師在左主動(dòng)脈干遠(yuǎn)心端結(jié)扎線的遠(yuǎn)端剪斷血管；將心臟輕輕提起(圖4A)，在靜脈竇的遠(yuǎn)心端(白線遠(yuǎn)端/紫紅色跳動(dòng)區(qū)域遠(yuǎn)端)將心臟與機(jī)體分離(圖4B)，不再進(jìn)行靜脈的結(jié)扎。該方法不宜損傷靜脈竇，分離的心臟活性較好。剛游離的心腔中有大量血液，伴隨心臟的跳動(dòng)不斷射入插管中(圖4C)，教師用任氏液反復(fù)洗滌，直至液體清澈透明；將制備好的蛙心標(biāo)本固定于儀器架上，用蛙心夾在心室舒張期夾住心尖部，調(diào)整線的張力至合適的水平(圖4D)，即可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

圖4 牛蛙心臟標(biāo)本的游離

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的評(píng)估

我們通過對(duì)兩種手術(shù)操作方法進(jìn)行數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)：改進(jìn)方法的手術(shù)時(shí)間平均為(7.3±0.2)min，較傳統(tǒng)方法(14±1.1 min，P<0.01)明顯縮短；同時(shí)，術(shù)后牛蛙心臟的跳動(dòng)頻率在改進(jìn)方法組為(53.4±1.3)次/min，高于傳統(tǒng)方法的(33.8±5.7)次/min(P<0.05)，見圖5；而且，采用改進(jìn)方法分離的蛙心其存活時(shí)間最長可達(dá)24 h左右。因此，改進(jìn)后的方法可顯著縮短手術(shù)時(shí)間，提高術(shù)后牛蛙的心功能，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開展。

圖5 不同手術(shù)方法操作時(shí)間及牛蛙心功能的評(píng)估

3 不同實(shí)驗(yàn)操作方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較

眾所周知，蛙心灌流是醫(yī)學(xué)生理學(xué)研究中一個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[1，4]。自20世紀(jì)初創(chuàng)立以來，該方法一直被很多研究領(lǐng)域及醫(yī)學(xué)教學(xué)領(lǐng)域所采用[5-8]，如：研究一些藥物對(duì)離體心臟功能的影響及可能的機(jī)制、醫(yī)學(xué)本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)等。

在不斷的教學(xué)及科研實(shí)踐過程中，我們逐漸發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的蛙心灌流實(shí)驗(yàn)流程存在一些不足之處：①結(jié)扎入心的靜脈時(shí)需要兩人配合操作，一人用棉球?qū)⑿呐K輕輕推起，另一人要完成入心靜脈的結(jié)扎，該步驟單人無法完成；同時(shí)，如果兩人配合不佳，極易導(dǎo)致靜脈竇被結(jié)扎，心臟會(huì)瞬間停跳。即使我們將線結(jié)順利打開，也會(huì)因?yàn)殪o脈竇受損，而導(dǎo)致心功能的異常，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；②右主動(dòng)脈干和左主動(dòng)脈干結(jié)扎后，經(jīng)常由于操作者操作不熟練、不能及時(shí)在左主動(dòng)脈干上剪口并進(jìn)行插管，那么，高后負(fù)荷的長期作用可導(dǎo)致心臟功能下降、心跳頻率減慢，進(jìn)而對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響；③還有一部分不熟練的操作者，在從兩根主動(dòng)脈干的下方進(jìn)行穿線時(shí)，有時(shí)誤將一根穿在主動(dòng)脈干下方，另一根穿在主動(dòng)脈干上方，這將導(dǎo)致結(jié)扎靜脈時(shí)一根主動(dòng)脈干也被結(jié)扎；同時(shí)，該操作中結(jié)扎線不容易拉到白線下方，使靜脈竇被扎的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高。

針對(duì)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的一系列問題，我們進(jìn)行了大膽嘗試，對(duì)該流程中容易出錯(cuò)的環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化。①操作者不再結(jié)扎靜脈竇。靜脈竇是蛙類心臟的正常起搏點(diǎn)，與人體竇房結(jié)的功能一致。操作者如果在實(shí)驗(yàn)操作中不小心結(jié)扎，將可能導(dǎo)致心跳停止，因此，這是蛙心灌流操作中相對(duì)比較重要的步驟之一。通過實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，操作者不再進(jìn)行靜脈竇的結(jié)扎，在蛙心插管完成后，直接從靜脈竇遠(yuǎn)端游離心臟，這一操作比結(jié)扎相對(duì)容易，可一人完成；且靜脈中血液向心方向回流，直接剪斷不會(huì)引發(fā)出血。②操作者不提前結(jié)扎右主動(dòng)脈干。傳統(tǒng)方法是操作者在插管前要結(jié)扎出入心的所有血管，這一操作可導(dǎo)致心臟的后負(fù)荷驟然增加，心功能急劇下降；為了避免出現(xiàn)上述的問題，改進(jìn)后的流程只結(jié)扎左主動(dòng)脈干遠(yuǎn)心端，然后在主動(dòng)脈干上剪口、插管，最后將左右主動(dòng)脈干連同插管一同結(jié)扎。此操作的優(yōu)點(diǎn)在于插管時(shí)，右主動(dòng)脈干的血流依然暢通，因此，心臟后負(fù)荷的變化不大，操作對(duì)蛙心功能的影響很小，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行[8]。③操作者調(diào)整插管的角度和心臟縱軸相平行。蛙心插管是該實(shí)驗(yàn)的核心步驟，也是多數(shù)操作者失敗的關(guān)鍵步驟。通過多年實(shí)驗(yàn)的摸索，我們發(fā)現(xiàn)：將蛙心插管的尖端調(diào)整至朝向心尖的方向，在心臟射血的同時(shí)向下后方輕挑，即可將插管送入心室內(nèi)。借助這一小的技巧，插管的成功率極大提升。④通過以上幾個(gè)關(guān)鍵步驟的改進(jìn)，操作者極大縮短了蛙心插管流程的操作時(shí)間，提高了操作的穩(wěn)定性，減少了失誤率。分離的心臟功能活動(dòng)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法分離的心臟。同時(shí)，該流程只需要兩根棉線，使流程簡便的同時(shí)也節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

雖然改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)流程從操作性、穩(wěn)定性、成功率等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)方法，但是也有不足。實(shí)驗(yàn)中，操作者由于沒有結(jié)扎入心的靜脈，因此，在操作過程中，仍有血液向心回流，導(dǎo)致心腔中的血液比較多；在插管完成、心臟游離后，需要對(duì)心腔的血液進(jìn)行多次沖洗，直至血液被完全去除，才可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，通過以上流程的改進(jìn)，醫(yī)學(xué)本科生在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，可以快速、準(zhǔn)確地掌握蛙心灌流的基本步驟，成功分離出活性較高、反應(yīng)性良好的心臟標(biāo)本[8]。本文建立了一套較為完善可靠的插管方法，不僅有助于蛙心灌流實(shí)驗(yàn)教學(xué)的順利進(jìn)行，同時(shí)對(duì)相關(guān)科學(xué)研究也有一定的參考價(jià)值。