王 萌，楊超群，吳斯林，譚建兵，杜鑫澤，李振興，昝林森，楊武才

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

精液在冷凍的過程中，環(huán)境溫度的迅速降低導致精子產(chǎn)生應激，膜脂質被氧化，導致精子膜結構受損，這種氧化應激最終造成精子功能的改變[1]。且凍融的精子比新鮮的精子更容易被過氧化，冷凍解凍后精子活率、活力、功能膜完整性和線粒體活性以及抗氧化酶活性降低[2-3]。此外，在種公畜新鮮精液生產(chǎn)過程中，飼養(yǎng)種公畜環(huán)境溫度過高、活動空間小等都會造成動物氧化應激，影響雄性動物的精子質量，危害畜體健康[4-5]。研究表明，在精液稀釋液中添加抗氧化劑可以減少精子在冷凍過程中的氧化損傷，提高精液冷凍保存效果，而在種公畜日糧中添加抗氧化劑可以減少機體應激，提高種公畜繁殖性能[6-8]。

番茄紅素(lycopene，LYC)是主要的天然類胡蘿卜素，是一種高度不飽和的直鏈碳氫化合物，分子式為 C40H56，相對分子質量為 536.88，熔點 176 ℃，不溶于水，可溶于脂類和非極性溶劑，有13個碳-碳雙鍵，包括11個是共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵，這使它成為一種非常強大的抗氧化劑[9-10]。研究表明，在單線態(tài)氧的猝滅效率功效方面，番茄紅素是β-胡蘿卜素的兩倍多，比α-生育酚快十倍，更是維生素E的一百倍，且具有抗腫瘤、延緩衰老、保護心血管和增強免疫力的生物學功能[11-13]。近年來，番茄紅素在雄性生殖調(diào)控和保護方面的研究越來越多，番茄紅素對雄性動物繁殖性能有較好促進作用[14]，如在被診斷為特發(fā)性或抗體介導性不育癥的患者中，使用番茄紅素可以顯著改善精液品質參數(shù)[9, 15]；此外，在小鼠體內(nèi)的研究表明，番茄紅素可防止睪丸退行性改變，改善精子活力和形態(tài)，并穩(wěn)定暴露于藥物、有機污染物或真菌毒素的睪丸組織的抗氧化能力[16-17]；而在綿羊的日糧中添加番茄紅素，能夠顯著提高血漿和睪丸組織中睪酮含量，使睪丸重量增加，促進綿羊睪丸組織的發(fā)育[18]。番茄紅素在精液冷凍稀釋液中也有應用，精液稀釋液中添加適宜濃度的番茄紅素可以顯著提高人、豬和羊冷凍-解凍后精子運動性能和精子生理結構的完整性，保護精子DNA完整性，改善冷凍精液質量，從而提高精液冷凍保存效果[19-21]。

目前，雖然番茄紅素在牛精液冷凍保存中已有研究[22]，但是由于牛的品種、飼養(yǎng)氣候等因素，導致番茄紅素對牛精液冷凍保存效果存在很大的差異，且番茄紅素對牛新鮮精液品質的影響未見報道。因此，本研究基于番茄紅素的抗氧化生物學性質和具有為雄性生殖細胞提供抗氧化保護的前景，旨在探索番茄紅素在體外對秦川牛精液冷凍保存效果和體內(nèi)對秦川牛精液品質及機體抗氧化性能的影響。為優(yōu)化牛精液冷凍保存技術和提高動物機體抗氧化能力提供依據(jù)，有助于進一步開發(fā)成本較低效果較好的新型精液稀釋液添加劑和種公畜日糧添加劑，促進秦川牛的肉牛改良與保種工作。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

計算機輔助精液分析系統(tǒng)(SQA-Vb)，SQA-Vb精液采樣管，精子程序冷凍儀均購于澳大利亞Cryologic；精子冷凍細管灌裝機購于法國卡蘇；移液槍，電子天平，水浴鍋，倒置熒光顯微鏡均購于日本Olmpus公司；檸檬酸鈉(羅恩)；果糖、葡萄糖、甘油、TRIS、慶大霉素和鏈霉素、番茄紅素、羅丹明123均購自北京索萊寶科技有限公司；飼喂級番茄紅素購自陜西昂煦生物科技有限公司；試劑盒均購自南京建成工程研究所有限公司。

1.2 精液稀釋液配制

100 mL基礎精液稀釋液中含有檸檬酸鈉1.354 g、TRIS 2.4224 g、葡萄糖1.1 g、甘油5.33 mL、卵黃20 mL、雙抗0.587 mL和雙蒸水68.82 mL，攪拌混勻后放入4 ℃冰箱中備用，使用時，根據(jù)試驗設計在基礎稀釋液中分別加入0、1、2、3、4 μmol·L-1的番茄紅素于37 ℃水浴鍋中預熱待用。

1.3 動物飼喂

選擇體重600 kg左右且新鮮精液品質相近并穩(wěn)定的秦川種公牛3頭，在日糧中添加15 mg·kg-1BW番茄紅素進行飼喂，預飼期15 d，正飼期45 d，飼喂番茄紅素前后種公?；A日糧不變，自由飲水。

1.4 精液的采集與處理

精液冷凍保存：選擇3頭秦川種公牛：年齡3～5歲，體況健壯且繁殖性能良好，在每周二、五早上09:00點利用假陰道法采精，選擇顏色乳白色或乳黃色的正常鮮精用儀器分析，活力≥65%，密度≥6×108個· mL-1，畸形率≤15%的精液采用一步法進行稀釋，即將預熱的牛精液稀釋液緩慢倒入新鮮精液中(新鮮精液在稀釋之前始終保持在37 ℃)，將稀釋后的精液利用細管灌裝封口一體機進行分裝并在4 ℃平衡3 h后，放入4 ℃冷凍箱中用程序化自動冷凍儀緩慢降溫至-145 ℃，迅速放入液氮中保存。7 d后用于檢測，迅速將0.25 mL細管從液氮中取出放入37 ℃水浴鍋中30 s解凍進行后續(xù)試驗。

1.5 血液采集與處理

秦川種公牛飼喂番茄紅素前后進行頸靜脈采血10 mL，血樣立即運回實驗室在離心機中以3 000 r ·min-1轉速離心10 min，吸取上清液血清，置于-80 ℃冰箱進行保存用于后期檢測。

1.6 精子質量的檢測

1.6.1 精子活力檢測 新鮮精液精子運動性能的檢測：預熱1支空的精子采樣管，將100 μL新鮮精液加入到預熱的2.0 mL Qwik CheckTM稀釋液(適用于動物新鮮精液)中，混勻樣本，用SQA-Vb精子采樣管吸取混合后的精液，將精子采樣管插入SQA-Vb測量倉進行檢測，每個新鮮精液檢測3次，保存結果，各種精子運動相關參數(shù)如下：活動精子率(%)、前向運動精子率(%)、前向運動精子平均速率(μm·s-1)、畸形率(%)。

冷凍-解凍后精子運動性能的檢測：在37 ℃水浴鍋中提前預熱500 μL Qwik CheckTM稀釋液(適用于冷凍動物精液)，將解凍后的200 μL精液加入其中混勻，用SQA-Vb精子采樣管吸取混合后的精液，將精子采樣管插入SQA-Vb測量倉進行檢測，每個處理組檢測3次，保存結果，各種精子運動相關參數(shù)如下：活動精子率(%)、前向運動精子率(%)、前向運動精子平均速率(μm·s-1)。

1.6.2 精子質膜完整性檢測 利用精子尾部低滲腫脹(hypo-osmotic swelling test，HOST)法檢測精子質膜完整性。按比例配制好低滲溶液，將100 μL解凍后的精液加入到提前預熱的等溫1 mL低滲溶液中，混勻孵育30 min，吸取10 μL制成玻片，在400×鏡下觀察，精子尾部呈角度彎曲為質膜完整，根據(jù)“精子彎尾率(%)=彎尾精子數(shù)/計數(shù)總精子數(shù)×100”計數(shù)彎尾率，每次至少計數(shù)200個精子，重復3次以上。

1.6.3 精子頂體完整率檢測 利用花生凝集素熒光標記(FITC-PNA)染色法檢測精子頂體完整性。吸30 μL解凍后的精液，在干凈的載玻片上涂抹均勻，自然風干后，用4%組織細胞固定液固定20 min，用10 μL FITC-PNA染液染色，37 ℃濕盒中避光孵育30 min，PBS沖洗3次，在熒光顯微鏡400×鏡下拍照，頭部呈綠色熒光的為頂體完整，即“精子頂體完整率(%)=頭部綠色熒光的精子數(shù)/計數(shù)總精子數(shù)×100”，每次至少計數(shù)200個，重復3次以上。

1.6.4 精子線粒體活性檢測 利用羅丹明(Rh123)熒光染料聯(lián)合染色來區(qū)分精子線粒體是否具有活性，因為Rh123能夠特異性地與功能良好的線粒體結合，使得精子尾部在熒光顯微鏡下發(fā)出綠光，因此，頭部不發(fā)光但尾部有綠色熒光的是有線粒體活性的精子。將200 μL解凍后的精液加入到500 μL提前預熱的等溫稀釋液中，將3 μL Rh123加入到預熱的200 μL PBS緩沖液中37 ℃避光孵育10 min形成染色液，在染色液中加入100 μL稀釋后的精液，37 ℃避光孵育30 min，吸取10 μL制成玻片，在熒光顯微鏡400×下觀察，計算線粒體活性，“精子線粒體活性(%)=尾部綠色熒光但頭部不發(fā)光精子數(shù)/計數(shù)總精子數(shù)×100”。每次至少計數(shù)200個精子，重復3次以上。

1.7 抗氧化性能檢測

MDA含量的變化和SOD、CAT及GSH-Px三種酶活性的變化表示抗氧化能力的強弱，這些抗氧化指標的檢測按照相應檢測試劑盒的說明書進行。

1.8 統(tǒng)計與分析

本試驗所有數(shù)據(jù)用 SPSS 軟件 25.0 進行單因素方差分析，所有結果以“平均值±標準差(Mean±S.D.)”表示，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子運動性能的影響

1 μmol·L-1番茄紅素對秦川牛精子活率和前向運動精子率有提高的作用，與對照組相比，前向運動精子率顯著提高(P<0.05)，但精子活率沒有顯著差異(P>0.05，表1)；當番茄紅素的濃度為2 μmol·L-1時，與對照組相比，冷凍-解凍后秦川牛精子的活率、前向運動精子率顯著提高(P<0.05)，并都達到最高，其中精子活率為60.10%，前向運動精子率為47.20%，而前向運動精子的平均速率有提高的趨勢，為39.33 μm·s-1，但沒有顯著差異(P>0.05，表1)；后隨著添加番茄紅素濃度的升高，冷凍-解凍后牛精子的活率、活力和前向運動精子的平均速率逐漸降低，添加3和4 μmol·L-1的番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子運動產(chǎn)生了抑制作用，與對照組相比，冷凍-解凍后精子的活率和前向運動精子率都顯著降低 (P<0.05)，前向運動精子平均速率有降低的趨勢，但沒有顯著差異(P>0.05，表1)。

表1 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子運動性能的影響

2.2 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子質膜完整性的影響

表2結果顯示，在精液冷凍稀釋液中添加番茄紅素濃度為1 μmol·L-1時，冷凍-解凍后秦川牛精子的質膜完整性與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；在精液稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的精子質膜完整性達到了55.92%，完整性顯著高于對照組(P<0.05)；精液稀釋液添加番茄紅素濃度為3和4 μmol·L-1時，對精子的質膜出現(xiàn)破壞作用，但3 μmol·L-1的精子質膜完整性與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，4 μmol·L-1的番茄紅素顯著抑制(P<0.05)了精子質膜狀態(tài)完整，圖1為精子質膜檢測的示意圖。

表2 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子質膜完整性的影響

“→”表示質膜完整的精子，“↓”表示質膜不完整的精子“→” indicate the sperm with integral membrane, “↓” indicate the sperm with damaged membrane圖1 精子質膜檢測的示意圖Fig.1 Images of sperm membrane

2.3 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子頂體完整率的影響

表3結果顯示，番茄紅素的濃度處于0～2 μmol·L-1范圍內(nèi)時，冷凍-解凍后精子頂體完整率與濃度呈正相關；但當濃度范圍處于2～4 μmol·L-1時，精子頂體結構的完整性與濃度呈負相關。精液稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的精子頂體完整率最高，為61.47%，顯著高于對照組(P<0.05，表3)；精液稀釋液中添加番茄紅素濃度為3 和4 μmol·L-1時，冷凍-解凍后精子頂體完整率與對照組相比均有顯著性降低(P<0.05，表3)，結果表明適宜濃度的番茄紅素對秦川牛精子頂體結構具有積極作用，圖2為精子頂體染色示意圖。

表3 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子頂體完整率的影響

“S1” 表示頂體完整的精子，“S2” 表示頂體損傷的精子“S1” indicate the sperm with integral acrosome, “S2” indicate the sperm with damaged acrosome圖2 精子頂體染色示意圖Fig.2 Images of sperm acrosome staining

2.4 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子線粒體活性的影響

表4顯示，番茄紅素濃度為1 μmol·L-1時的冷凍-解凍后精子線粒體活性與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；在精液稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的精子線粒體活性最高，為49.30%，顯著高于對照組(P<0.05)；精液稀釋液添加番茄紅素濃度為3 和4 μmol·L-1時，對精子的線粒體膜出現(xiàn)破壞作用，與對照組相比，顯著降低(P<0.05)了冷凍-解凍后線粒體活性，圖3為精子線粒體染色的示意圖。

表4 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子線粒體活性的影響

2.5 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子抗氧化能力的影響

表5結果顯示，當添加番茄紅素濃度為1 μmol·L-1時，冷凍-解凍后精子細胞內(nèi)CAT和GSH-Px的酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，但精子細胞內(nèi)MDA的含量與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；而在稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的抗氧化效果最好，與對照組相比，能夠顯著提高冷凍-解凍后精子細胞內(nèi)CAT和GSH-Px的酶活性(P<0.05)，并顯著降低精子細胞中MDA的含量(P<0.05)；后隨著精液稀釋液中番茄紅素濃度的增加，冷凍-解凍后精子抗氧化性能逐漸降低，添加番茄紅素的濃度為3和4 μmol·L-1時，與2 μmol·L-1相比，CAT和GSH-Px的酶活性顯著降低(P< 0.05)，精子細胞中MDA含量顯著增加(P<0.05)。

“M1”表示具有線粒體活性的精子，“M2”表示不具有線粒體活性的精子“M1” indicate the sperm with mitochondrial activity, “M2” indicate the sperm without mitochondrial activity圖3 精子線粒體染色示意圖Fig.3 Images of sperm mitochondrial staining

表5 番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子抗氧化能力的影響

2.6 日糧中添加番茄紅素對秦川牛精液品質的影響

種公牛日糧中添加番茄紅素對秦川牛精液品質的影響見表6，在種公牛日糧中添加番茄紅素對秦川牛精液品質有著積極的影響，在飼喂番茄紅素60 d后與飼喂之前相比，秦川種公?；顒泳勇屎颓跋蜻\動精子率都有著顯著提高(P<0.05)，精子畸形率顯著降低(P<0.05)，其中，飼喂番茄紅素后活動精子率提高了13.20%，前向運動精子率提高了13.74%，精子畸形率下降了9.01%，這說明日糧中添加番茄紅素能夠提高秦川種公牛的繁殖性能。

表6 番茄紅素對秦川牛精液品質的影響

2.7 日糧中添加番茄紅素對秦川牛機體抗氧化性能的影響

表7顯示，日糧中添加番茄紅素對秦川種公牛血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性及MDA含量有顯著影響(P<0.05)。與日糧中添加番茄紅素飼喂之前相比較，飼喂后種公牛血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著增強(P<0.05)，血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)；日糧中添加番茄紅素能夠提高種公牛的抗氧化性能，對機體起到很好的保護作用。

表7 番茄紅素對秦川牛血清抗氧化性能的影響

3 討 論

精液冷凍過程會造成精子氧化應激，精子細胞中所有的成分，包括脂類、蛋白質、核酸和糖，都是氧化應激的潛在目標[23]。氧化應激引起改變的比例取決于活性氧(ROS)的性質和濃度、暴露于ROS的時間，但也取決于細胞外因素，如溫度、氧氣和環(huán)境組成(離子、蛋白質、ROS清除劑)[24]。在冷凍解凍的精液中，質膜和頂體外膜對低溫最敏感，氧化應激通常會導致精子活力喪失、質膜腫脹和頂體膜起泡，并改變精子質膜的通透性。在凍融過程中，當ROS大量產(chǎn)生時，質膜的結構損傷增加了對脂質過氧化的敏感性。精漿中含有大量的抗壞血酸、α-生育酚、丙酮酸、谷胱甘肽、?；撬岬确敲割惪寡趸瘎@些都是精子細胞用來抵御ROS攻擊的最重要的保護元素，但這些元素有限，不足以保護精子在冷凍過程中的損傷[25-26]。天然抗氧化劑在精液稀釋和冷凍中作為介質，如α-生育酚和抗壞血酸，對冷凍保存的牛精子細胞的代謝活性和細胞活力具有保護作用[27-28]。

本研究的體外試驗中，在精液冷凍保存之前，通過在牛精液冷凍稀釋液中添加0、1、2、3、4 μmol·L-1濃度的番茄紅素，探究其對冷凍-解凍后秦川種公牛精子的活力、線粒體活性、生理結構狀態(tài)(質膜、頂體)及精子抗氧化能力的影響。結果發(fā)現(xiàn)，LYC能夠顯著提高冷凍-解凍后秦川種公牛精子的運動性能、生理結構的完整性和抗氧化能力，且LYC的最適添加濃度為2 μmol·L-1。這與戴小凡[29]在人的精液冷凍保存中發(fā)現(xiàn)的番茄紅素能夠改善冷凍-解凍后精液質量的結果是一致的；王艷華等[26]在山羊的精液冷凍保存中添加1 μmol·L-1的番茄紅素對山羊精液具有顯著的保護作用，可以提高山羊凍精品質；王捷[19]在豬的精液冷凍保存中添加2 μmol·L-1的番茄紅素能夠顯著提高冷凍-解凍后豬精子的運動性能和生理結構的完整性，進而達到提高豬精液冷凍保存效果的目的，且通過在豬胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)液中添加番茄紅素的研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能夠影響豬胚胎發(fā)育能力和線粒體依賴性細胞凋亡途徑，在整個體外授精期間補充番茄紅素可通過調(diào)節(jié)氧化應激和線粒體依賴性細胞凋亡來增強豬的胚胎發(fā)育[30]。同時，本研究獲得的番茄紅素對冷凍-解凍后秦川牛精子活力、生理結構和精子抗氧化能力的提高作用的結果與之前報道的冷凍-解凍后其他品種和地區(qū)牛的結果相同[22, 31]，這表明牛的品種和飼養(yǎng)氣候可能不影響番茄紅素對精液冷凍保存的提高作用。但番茄紅素濃度過高，會顯著抑制冷凍-解凍后精子的運動性能和精子生理結構的完整性，并對冷凍-解凍后精子的抗氧化性能有影響，究其原因可能是高濃度的番茄紅素具有一定的毒害作用，高濃度的番茄紅素會導致其抗氧化活性作用轉變?yōu)榇傺趸钚訹32]。

同時，隨著現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽集約化程度不斷提高，氧化應激對畜禽生產(chǎn)的危害越來越嚴重，造成動物機體免疫力、生理機能、生產(chǎn)性能和繁殖性能降低，引發(fā)群體病變，甚至死亡[33-34]。大量研究證實了抗氧化劑作為畜禽日糧添加劑在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中的重要性，這些抗氧化物質可以有效調(diào)控動物機體由于氧化應激產(chǎn)生的危害，從而保障動物機體細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和生理機能的正常運行[35]。研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雞和肉仔雞飼糧中外源添加抗氧化劑叔丁基對苯二酚、茶多酚、維生素 E、吡咯喹啉醌、葡萄原花青素、硫辛酸、乙酰肉堿和肌肽可以改善和提高肉品質，并通過提高血漿中的抗氧化酶活性來提高動物機體的抗氧化能力[36-37]，且在肉雞飲水中添加0.5 g·L-1番茄紅素對精液質量、受精率和免疫力都有積極的作用[38]；而在大鼠靜脈曲張引起不育癥的研究中顯示，精索靜脈曲張組給予10 mg·kg-1的番茄紅素可以通過增加抗氧化活性和減少活性氧來保護精子免受活性氧和精子DNA損傷，可防止氧化應激引起的大鼠睪丸組織結構和功能損害以及精子質量降低[39]；通過飼喂5.0% 的番茄渣可提高豬肉的氧化穩(wěn)定性，靳天宇等[40-41]在綿羊的日糧中添加抗氧化劑亞硝酸鈉后發(fā)現(xiàn)綿羊的精子活力、運動速度和線粒體活性都得到提升，提高了綿羊的精液品質。本研究發(fā)現(xiàn)，在秦川種公牛日糧中添加15 mg·kg-1BW番茄紅素后能夠顯著提高種公牛的精子活率和精子活力，降低精子畸形率，并對機體血清中的抗氧化性能有顯著的提高作用。這些均說明了番茄紅素可以作為日糧添加劑來改善精液品質，提高繁殖性能。

4 結 論

番茄紅素對秦川種公牛精液冷凍保存和鮮精精液品質具有積極的作用。其中在秦川牛精液冷凍保存過程中添加適量的番茄紅素可以顯著提高冷凍-解凍后精子的活力、生理結構完整性(頂體、質膜和線粒體)以及抗氧化酶(CAT和GSH-Px)活性，顯著降低精子中MDA含量，且最適添加濃度為2 μmol·L-1；飼喂15 mg·kg-1BW 番茄紅素后，秦川種公牛的精子活力顯著提高，精子畸形率顯著降低，血清中MDA含量顯著降低，3種抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性顯著增加，表明番茄紅素改善精液品質和提高種公畜的繁殖性能可能是通過提高機體的抗氧化能力來實現(xiàn)的。