李韻穎，曹琴英，韓映雪，趙健，戶月，苗穗兵，甄亞麗，伊鳳蕊

1 河北醫(yī)科大學(xué)附屬石家莊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000；2 石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一類以排卵功能障礙、高雄激素血癥或超聲顯示多囊卵巢為特征的多因素、多系統(tǒng)性疾病，影響全球8%～13%的育齡婦女［1］。PCOS女性中不孕的發(fā)生率為72%［2］，盡管通過干預(yù)生活方式、降雄激素治療、促排卵藥物、IVF-ET技術(shù)的應(yīng)用，其妊娠率較前有了很大的提高，但仍達(dá)不到預(yù)期水平，而且發(fā)現(xiàn)其卵母細(xì)胞受精能力和胚胎著床率低、流產(chǎn)率高等問題，這與卵泡發(fā)育異常、卵母細(xì)胞質(zhì)量降低、子宮內(nèi)膜功能障礙等有關(guān)。卵巢顆粒細(xì)胞作為卵泡微環(huán)境中主要的體細(xì)胞，緊鄰卵母細(xì)胞，其異常的增殖、凋亡和氧化應(yīng)激等直接影響卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育［3］。微小RNAs（miRNAs）是一類由18～23個(gè)核苷酸組成內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過調(diào)控并降低下游靶基因的表達(dá)，參與機(jī)體細(xì)胞幾乎全部的生物學(xué)過程中。微小RNA-383-5p（miR-383-5p）在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，如鼻咽癌、乳腺癌、肺癌等，影響癌細(xì)胞的增殖能力及對(duì)放化療的敏感性，扮演“抑癌基因”的角色。研究［4］發(fā)現(xiàn)，miR-383-5p在PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)。2021年10月—2022年5月，我們觀察了miR-383-5p轉(zhuǎn)染對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞株KGN凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑KGN細(xì)胞（上海中喬新舟生物）。TriQuick總RNA提取試劑（北京索萊寶），miR-383-5p及U6引物和miRNAs RT-qPCR試劑盒（廣州銳博生物），DMEM/F-12培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（浙江四季青），胰蛋白酶-EDTA消化液和胰蛋白酶消化液（北京索萊寶），miR-383-5p mimics（上海吉瑪），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen），活性氧（ROS）檢測試劑盒（上海碧云天），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成），N-乙酰半胱氨酸（NAC）（上海碧云天），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海翊圣），RIPA裂解液（強(qiáng)），Bax鼠單克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體（武漢賽維爾），Bcl-2兔多克隆抗體和cleaved caspase 3鼠單克隆抗體（武漢三鷹），羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（Seracare），ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（上海翊圣）。

1.2 KGN細(xì)胞培養(yǎng) 將KGN細(xì)胞從液氮中取出，放置在37℃恒溫水浴箱內(nèi)快速復(fù)蘇，依據(jù)細(xì)胞密度種至合適的培養(yǎng)皿中，隔日更換1次培養(yǎng)基。

1.3 KGN細(xì)胞分組、miR-383-5p mimics轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率判定 采用qRT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化，按每孔3.5×105細(xì)胞接種于6孔板中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。當(dāng)細(xì)胞融合度在80%～90%時(shí)分組，并嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染150 pmol的miR-383-5p mimics。收集細(xì)胞加入TriQuick總RNA提取試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，Nanodrop One超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度。嚴(yán)格按照miRNAs RT-qPCR試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s（重復(fù)40個(gè)循環(huán)）；溶解曲線生成。U6作為miR-383-5p的內(nèi)參。采用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行計(jì)算。CT值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán) 數(shù)。Blank組、miR-383-5p mimics組、miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1、98.849±11.208、99.104±10.022，miR-383-5p mimics組和miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p表達(dá)較Blank組升高（P均＜0.05）。這一結(jié)果表明，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

1.4 各組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的檢測 ①細(xì)胞凋亡率測算：采用流式細(xì)胞術(shù)。使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液常規(guī)消化收集細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷的1×PBS重懸洗滌兩次，4℃環(huán)境下 以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清。加入1×Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞/mL。將100 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至5 mL流式管內(nèi)，依次加入5 μL的Annexin V-PE和10 μL的7-AAD，避光，室溫反應(yīng)15 min。加入400 μL的1×Binding Buffer，輕彈流式管底混勻。于1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。使用FlowJo_V10軟件分析各組細(xì)胞的凋亡率。②細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3檢測：采用Western blot法。將細(xì)胞內(nèi)加入RIPA裂解液（強(qiáng)）冰上裂解30 min，后收集至離心管內(nèi)檢測蛋白濃度。95℃煮10 min使蛋白變性，室溫冷卻后備用。使用10%分離膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)60 min。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h后孵育一抗［Bax抗體（1∶1 000）；Bcl-2抗體（1∶3 000）；cleaved caspase 3抗體（1∶1 000）；β-actin抗體（1∶1 000））］，4℃過夜。室溫孵育二抗（1∶5 000）1 h后ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒顯色，拍照后對(duì)各組條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

1.5 各組細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測 ①細(xì)胞ROS檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)。將收集的細(xì)胞用1 mL的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸洗滌兩遍，以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清。加入1 mL的DCFH-DA稀釋液（1∶1 000），置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，每5 min顛倒混勻1次，以保證細(xì)胞和探針充分接觸。取出離心管，以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清。加入培養(yǎng)基重懸洗滌兩遍，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。500 μL的1×PBS重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至流式管。于1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，使用FlowJo_V10軟件分析各組細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。②細(xì)胞MDA檢測：將收集的細(xì)胞加入適量1×PBS重懸（1×106細(xì)胞加入0.3～0.5 mL的1×PBS）。使用超聲破碎儀提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，Nanodrop One超微量分光光度計(jì)檢測蛋白濃度。按照MDA測定試劑盒的說明書，將蛋白樣本和試劑依次加至離心管中，蓋好蓋子，渦旋儀混勻，放置恒溫水浴箱中95℃孵育80 min。取出離心管，流水冷卻后，4 000 g/min速度離心10 min。取上清200 μL加至96孔板。使用酶標(biāo)儀在532 nm波長處測定吸光度值。按照以下公式計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)MDA水平，MDA含量（nmol/mg）=（測定管-對(duì)照管）/（標(biāo)準(zhǔn)管-空白管）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷蛋白濃度（mg/mL）。③細(xì)胞SOD活性檢測：制備細(xì)胞蛋白樣本及檢測蛋白濃度同“1.5”。按照SOD活性測定試劑盒的說明書，將蛋白樣本和試劑依次加至96孔板中。將96孔板放置酶標(biāo)板上振蕩混勻后，37℃孵育20 min，在450 nm波長處測定吸光度值。按照以下公式計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)SOD活性，SOD抑制率（%）=×100%，SOD活性（U/mg）=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)÷蛋白濃度（mg/mL）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 相較于空白對(duì)照組，miR-383-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)凋亡率明顯升高，并且抑凋蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，促凋蛋白Bax和cleaved caspase 3的表達(dá)水平升高（P均＜0.05）。這說明miR-383-5p具有促進(jìn)KGN細(xì)胞凋亡的作用。再進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，NAC干預(yù)組細(xì)胞的凋亡率低于miR-383-5p mimics組（P＜0.05），同時(shí)Bax和cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），即抗氧化劑NAC逆轉(zhuǎn)了miR-383-5p促進(jìn)KGN細(xì)胞凋亡的作用。這一結(jié)果表明，miR-383-5p通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激從而引發(fā)了細(xì)胞的凋亡。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（）

表1 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（）

注：與Blank組比較，*P＜0.05；與miR-383-5p mimics組比較，△P＜0.05。

組別miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p mimics組Blank組凋亡率（%）5.347±0.698△8.013±1.252*1.650±0.886 Bax蛋白0.657±0.171△0.870±0.227*0.535±0.163 Bcl-2蛋白1.498±0.586△0.962±0.476*1.541±0.686 cleaved caspase 3蛋白1.504±1.009△2.136±1.259*1.239±1.321

2.2 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組ROS、MDA、SOD活性比較 相較于空白對(duì)照組，miR-383-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的水平升高，抗氧化物SOD水平下降（P＜0.05）。說明miR-383-5p誘導(dǎo)了KGN細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。然而，當(dāng)我們將100 μmol/L的抗氧化劑NAC添加至miR-383-5p mimics組作用24 h后，NAC干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的水平低于miR-383-5p mimics組，SOD水 平則較高，說明NAC抑制了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生（P＜0.05）。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（）

表2 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（）

注：與Blank組比較，*P＜0.05；與miR-383-5p mimics組比較，△P＜0.05。

組別miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p mimics組Blank組ROS（%）27.133±13.931△56.167±19.610*23.583±19.440 MDA（nmol/mg）0.610±0.155△0.755±0.121*0.586±0.073 SOD（U/mg）48.016±4.223△38.259±4.774*47.351±3.608

3 討論

大量研究表明，PCOS患者卵母細(xì)胞不成熟、質(zhì)量差及胚胎發(fā)育能力低歸因于其卵巢顆粒細(xì)胞異常的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等。而卵巢顆粒細(xì)胞的功能和生物學(xué)行為受激素、炎癥因子等影響。隨著生物學(xué)信息和測序技術(shù)的發(fā)展，miRNAs作為一種新型調(diào)控分子，參與卵巢顆粒細(xì)胞的生物學(xué)過程。miR-383-5p是一種位于染色體8p22的內(nèi)含子miRNA，其宿主基因?yàn)镾GCZ。該基因編碼ζ-肌聚糖，后者屬于跨膜蛋白家族。研究報(bào)道，miR-383-5p在PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)，但其對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及凋亡的影響和其內(nèi)在機(jī)制尚不明確。

眾所周知，機(jī)體內(nèi)存在一套完善的抗氧化體系，可以將ROS等自由基維持在一個(gè)相對(duì)低水平，有利于細(xì)胞的正常功能。但當(dāng)自由基的產(chǎn)生與抗氧化體系的清除能力失衡時(shí)，就會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是人類多種疾病的主要病理生理機(jī)制［5］。過多的ROS導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分損傷，觸發(fā)線粒體膜上通透孔的開放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PCOS女性卵巢組織中上調(diào)的miR-21通過抑制程序性細(xì)胞死亡因子4/ROS軸促進(jìn)胰島素處理的小鼠顆粒細(xì)胞增殖［6］。ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是卵母細(xì)胞質(zhì)量差的原因［7］。先前報(bào)道稱，miR-383-5p可以通過靶向抑制過氧化物酶3—一種維持內(nèi)源性氧化還原穩(wěn)態(tài)的抗氧化蛋白［8］，誘導(dǎo)糖尿病性視網(wǎng)膜病變組織中ROS產(chǎn)生、凋亡、自噬等［9］。鑒于人卵巢顆粒瘤來源的KGN細(xì)胞株具有類似人卵巢顆粒細(xì)胞的功能。本研究中我們將miR-383-5p轉(zhuǎn)染至KGN細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-383-5p可導(dǎo)致ROS和MDA升高，SOD降低。提示miR-383-5p可激活人卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

細(xì)胞凋亡是一種在生理或者病理狀態(tài)下發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡，其中Bcl-2家族蛋白起著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族包括以Bcl-2為代表的抑制凋亡的蛋白和以Bax為代表的促進(jìn)凋亡的蛋白。經(jīng)證實(shí)，miR-16等多種miRNAs均可通過調(diào)控PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞凋亡影響其功能。miR-383-5p在胃癌組織中的表達(dá)相較于鄰近非腫瘤組織中偏低，與Bcl-2的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，并且兩者都與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-383-5p可以靶向調(diào)控Bcl-2的表達(dá)升高細(xì)胞凋亡率［10］。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，將KGN細(xì)胞過表達(dá)miR-383-5p后，細(xì)胞的凋亡率升高，并且凋亡相關(guān)蛋白也隨之改變。提示miR-383-5p可以促進(jìn)人卵巢顆粒細(xì)胞株KGN的凋亡。

如前所述，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探究miR-383-5p誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡之間的關(guān)系。我們將抗氧化劑NAC添加至過表達(dá)miR-383-5p的KGN細(xì)胞內(nèi)，可見細(xì)胞的凋亡率和促凋蛋白Bax、cleaved caspase 3表達(dá)水平降低，抑凋蛋白Bcl-2表達(dá)水平升高。本研究結(jié)果提示，miR-383-5p促進(jìn)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的功能可能是通過激活氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)的。

總之，miR-383-5p可以通過激活人卵巢顆粒細(xì)胞株KGN中氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這為PCOS的病理生理機(jī)制提供了理論依據(jù)，為PCOS的診斷和治療提供了新思路。