姬書會(huì)

（平頂山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河南 平頂山 467000）

豬大腸桿菌病是養(yǎng)豬場(chǎng)常見的細(xì)菌性傳染病，發(fā)病率在30%以上，臨床以敗血癥、腸炎為主要癥狀［1］。同時(shí)，由于該病通常繼發(fā)或者并發(fā)其他細(xì)菌性和病毒性疫病混合感染，給臨床診治帶來困難，危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。長(zhǎng)期以來，獸用抗生素被廣泛用于防治豬大腸桿菌病，起到了積極效果。但是，抗生素濫用導(dǎo)致的獸藥殘留超標(biāo)、耐藥菌株的增多以及耐藥性增強(qiáng)等諸多負(fù)面作用日益突出。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號(hào)公告，要求自2020年起，動(dòng)物飼料全面禁止添加抗生素，人們不斷關(guān)注中草藥在豬病防治的研究和開發(fā)應(yīng)用。中草藥具有抗菌消炎、提高機(jī)體免疫力和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，在畜禽細(xì)菌性疫病防控方面發(fā)揮了積極作用。有關(guān)中草藥防治動(dòng)物大腸桿菌病的研究報(bào)道較多，但是大腸桿菌血清型眾多，菌株致病力有差異，研究報(bào)道的體外抑菌效果也不一致。該試驗(yàn)選取蒲公英、黃連和連翹等12種中草藥提取液進(jìn)行豬大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)，觀察中草藥抑菌效果，為中草藥防治豬大腸桿菌病提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 中草藥

蒲公英、黃連、紫花地丁、連翹、黃芩、魚腥草、王不留行、穿心蓮、五味子、夏枯草。

1.2 菌株

豬大腸桿菌采集自平頂山市葉縣、魯山部分豬場(chǎng)臨床疑似仔豬黃白痢直腸拭子，經(jīng)分離純化、PCR檢測(cè)和血清型鑒定為O9、O45和O73，菌株于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 培養(yǎng)基

普通肉湯培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 中草藥液的煎制

采用水提法制備每種中草藥藥液，稱取蒲公英50 g中草藥裝入三角燒瓶，加入蒸餾水500 ml 浸泡1 h 后，加熱1 h，紗布過濾，再加入250 ml蒸餾水，加熱30 min，置入水浴鍋保持70 ℃至藥液50 ml，濃縮得到藥液濃度為1 g/ml，4 ℃保存?zhèn)溆?。其?種中草藥采用上述方法提取中草藥藥液。

2.2 菌懸液培養(yǎng)制備

將分離菌株無菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃、24 h 菌種復(fù)壯，再挑取菌液接種于普通肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、18 h，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為108CFU/ml。

2.3 中藥提取物對(duì)豬大腸桿菌抑菌圈的測(cè)定

取上述稀釋后的菌懸液100 μl置入含有LB固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，用無菌涂布棒涂勻，然后在每個(gè)平皿內(nèi)用直徑6 mm 的無菌打孔器均勻打5 個(gè)孔，每孔加入試驗(yàn)用中草藥提取物，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，測(cè)定抑菌圈直徑。結(jié)果判定：抑菌圈直徑≥15 mm 為高度敏感，10～15 mm 為中度敏感，≤10 mm 為耐藥。

2.4 中藥提取物對(duì)豬大腸桿菌MIC的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［2］采用二倍稀釋法配制成梯度濃度，微量移液器分別吸取每種中藥提取液100 μl，加入96孔V型板的第2孔至第11孔，然后每孔依次加入濃度為108CFU/ml菌懸液100 μl，第1 孔和第12 孔加入200 μl 蒸餾水，不加藥液。37 ℃，培養(yǎng)18 h，每孔再加入濃度為0.2 mg/μl碘硝基四唑紫指示劑20 ml，30 min后取出96孔V型板，觀察每孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，孔中混合液呈粉色渾濁表明有細(xì)菌生長(zhǎng)，而澄清透明藥物混合液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝有抑制作用，此濃度為最小抑菌濃度值（MIC）。無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

3 結(jié)果

3.1 10種中草藥提取液對(duì)豬大腸桿菌抑菌圈的測(cè)定

10 種中草藥提取液對(duì)豬大腸桿菌抑菌效果各不相同，其中，穿心蓮、魚腥草、紫花地丁和連翹對(duì)豬大腸桿菌抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑均大于10 mm，其他中草藥提取液抑菌效果無顯著差別。

3.2 10種中草藥提取液對(duì)豬大腸桿菌最小抑菌濃度

10 種中草藥對(duì)豬大腸桿菌最小抑菌濃度介于7.82～125 mg/ml，其中黃連、黃芩MIC最高，均為125.0 mg/ml，魚腥草、穿心蓮MIC最低，均為7.82 mg/ml，見表1。

表1 10種中草藥提取液對(duì)豬大腸桿菌抑菌效果

4 討論

大腸桿菌是動(dòng)物體內(nèi)腸道正常菌群，在腸道內(nèi)環(huán)境菌群平衡狀態(tài)下多數(shù)大腸桿菌一般不表現(xiàn)致病性，但是在機(jī)體免疫力下降、外界溫度等環(huán)境變化大的情況下，致病性大腸桿菌產(chǎn)生多種腸毒素、內(nèi)毒素，通常引起仔豬黃痢、白痢和水腫病，誘發(fā)多種細(xì)菌性疫病，危害生豬健康。疫苗免疫和抗生素、化學(xué)抗菌藥物是預(yù)防和治療該病常用技術(shù)手段，但是由于大腸桿菌血清型眾多，疫苗免疫難以交叉保護(hù)，抗生素藥物不合理使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性增強(qiáng)，豬場(chǎng)大腸桿菌病依然成為防疫重中之重。

天然中草藥中的多糖類、有機(jī)酸類、生物堿類和揮發(fā)油類有增強(qiáng)免疫的作用［3］，這些均屬于抑菌活性成分。該試驗(yàn)選用的中草藥含有不同成分的抑菌活性物質(zhì)，體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，10 種中草藥提取液對(duì)豬大腸桿菌抑菌效果各不相同，穿心蓮、王不留行、紫花地丁和連翹對(duì)豬大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑均大于10 mm。王鐵良［4］等研究報(bào)道，連翹對(duì)血清型O5和O8大腸桿菌抑菌效果較好，體外抑菌試驗(yàn)中的抑菌圈直徑分別為18.40 mm和22.15 mm，優(yōu)于該試驗(yàn)抑菌效果。這可能與試驗(yàn)選用藥材成分濃度、提取工藝和菌株不同有關(guān)，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。豆思遠(yuǎn)［5］等選用黃連、黃芩提取物對(duì)仔豬致病性大腸桿菌菌株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，兩種中草藥對(duì)仔豬致病性大腸桿菌均有較好的抑菌效果，與該試驗(yàn)結(jié)果相近。魚腥草化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括揮黃酮類、發(fā)油、生物堿等多種功能性成分，體外抑菌試驗(yàn)顯示魚腥草提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、卡他球菌、大腸桿菌、肺炎球菌等多種細(xì)菌具有比較廣泛的抑菌作用［6］。紫花地丁主要含有黃酮和香豆素等天然的抗菌消炎化學(xué)成分［7］?？祽雅d［8］研究報(bào)道，紫花地丁提取物的MIC為0.469 mg/ml，顯示了紫花地丁較好的抑菌效果，在臨床抗菌消炎方面具有極大優(yōu)勢(shì)，與該試驗(yàn)結(jié)果紫花地丁顯著的抑菌效果一致。

此外，相同的中草藥對(duì)于豬大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)效果受試驗(yàn)者主觀因素、藥材成分、提取方法以及菌株不同等影響，抑菌效果存在差異。體外抑菌只是中草藥抑菌作用的參考，與體內(nèi)抗菌機(jī)理差別較大，因此，在中草藥體外抑菌試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，需要結(jié)合臨床應(yīng)用跟蹤監(jiān)測(cè)各種中草藥抑菌數(shù)據(jù)和效果，才能得出準(zhǔn)確可靠的結(jié)論。