王坤麗，張夢潔

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南 鄭州 450046）

隨著“飼料端禁抗、養(yǎng)殖端限抗、產(chǎn)品端無抗”的全面推進，畜牧業(yè)替抗產(chǎn)品的研發(fā)成為熱點［1］，而發(fā)酵中藥被視為一種理想的藥物添加劑，具有安全性高、少副作用、低殘留、低耐藥性及功能廣泛等優(yōu)點，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)有較強的發(fā)展?jié)摿Γ?-3］。乳酸菌是一類可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱，在發(fā)酵中藥領(lǐng)域是首選菌種［4-5］。黃芪、當歸是經(jīng)典名方當歸補血湯的藥物組成，其方補氣養(yǎng)血、藥少力專而應(yīng)用廣泛，中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計顯示，含有當歸與黃芪藥對的方劑有2 632首［6］。試驗采用乳酸菌發(fā)酵歸芪粗體物制備發(fā)酵中藥，為畜牧業(yè)健康發(fā)展提供替抗產(chǎn)品和有效參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

屎腸球菌和植物乳桿菌菌種由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院發(fā)酵中藥實驗室提供；當歸、黃芪2 種中藥材購于河南順康中藥材有限公司，經(jīng)檢驗符合藥典標準；MRS培養(yǎng)基購自北京澳博星生物技術(shù)有限公司；無水乙醇購于山東禹王實業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器

試驗主要儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器設(shè)備表

2 試驗方法

2.1 菌種的活化

從-20 ℃冰箱取出凍存的屎腸球菌和植物乳桿菌半固體菌種，解凍后，分別接入已滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。然后將兩種菌分別以5%的接種量接種到已滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，鏡檢。等量混合即得發(fā)酵所用的混合液體菌種。

2.2 歸芪粗體物制備

按照2020版《中華人民共和國藥典》［7］當歸補血口服液處方，分別稱取當歸132 g 和黃芪330 g，第1 次10 倍水浸泡30 min 后煎煮1 h，第2 次8 倍水煎煮40 min，合并兩次濾液，濃縮至231 ml即得歸芪粗提取物。

2.3 歸芪粗提物添加量的確定

該試驗采用乳酸菌液體發(fā)酵，首先設(shè)歸芪粗提物添加量分別為20%、30%、40%、50%、60%的試驗組和不加歸芪粗提物的MRS 培養(yǎng)基為對照組。調(diào)節(jié)各組培養(yǎng)基pH 為7，121 ℃溫度下滅菌30 min，冷卻后按5%接種量接種，37 ℃條件厭氧培養(yǎng)36 h，測定各組乳酸菌活菌含量及pH值，以確定最適宜添加量。

2.4 歸芪粗提物發(fā)酵條件的確定

按最適宜添加量，采用單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，依此考查接種量1%、2%、3%、4%、5%的接種量；25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃和42 ℃溫度；發(fā)酵時間12 h、24 h、36 h、48 h、72 h，以活菌總數(shù)為主，以發(fā)酵液pH值為參考，確定發(fā)酵最佳條件；同時持續(xù)考察4 d、7 d、14 d的發(fā)酵液pH值和活菌總數(shù)以確定發(fā)酵狀態(tài)。

2.5 發(fā)酵罐優(yōu)化

采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，用5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，并測定活菌總數(shù)和pH值，以驗證工藝條件可行性。

2.6 乳酸菌活菌計數(shù)

采用活菌平板計數(shù)法進行，吸取1 ml樣品勻液注入裝有9 ml生理鹽水的無菌試管中，震蕩1～2 min，制成1∶10的樣品勻液。吸取1 ml樣品液于裝有9 ml生理鹽水的滅菌試管中，震蕩混勻制成1∶100的稀釋液，按上述操作依次倍比稀釋至合適濃度。

選擇2～3個合適稀釋度，用無菌移液管分別吸取每個稀釋度0.1 ml 到2 個MRS 瓊脂平板上。用涂布棒快速涂勻后蓋上平皿，稍放置后倒置于37 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h±2 h。然后根據(jù)每毫升樣品中菌落數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/平板中菌液添加量來計算發(fā)酵樣品菌數(shù)。

3 結(jié)果及分析

3.1 歸芪粗提物添加量的確定

試驗結(jié)果見表2和圖1。由表2和圖1可以看出乳酸菌可以在歸芪粗提物液體培養(yǎng)基中生長，并隨著歸芪粗提物添加量的增加，乳酸菌活菌數(shù)先升高后降低，當添加量為30%時，乳酸菌活菌數(shù)達到最高，達到22.72×108CFU/g。一定程度上可以說明，利用歸芪粗提物培養(yǎng)乳酸菌，添加量要適宜，過低乳酸菌數(shù)較少，過大時會抑制菌落生長。歸芪粗提物添加量對乳酸菌發(fā)酵液的pH值變化影響很大，pH 值在4.61～6.16 間變化，當粗提物添加量為30%時，pH值最低為3.95。結(jié)合乳酸菌數(shù)及pH 值變化情況，確定歸芪粗提物添加量為30%。

表2 歸芪粗提物添加量對乳酸菌的生長及發(fā)酵液pH值的影響

圖1 歸芪粗提物添加量對乳酸菌的生長及pH值影響

3.2 接種量對乳酸菌活菌總量的影響

試驗結(jié)果如圖2所示?？梢娊臃N量從1%～5%，發(fā)酵36 h時，發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量隨著接種量增加先增加，到達峰值后維持數(shù)目基本不變，由結(jié)果可以看出，最佳接種量為3%。

圖2 接種量對乳酸菌生長的影響

3.3 溫度對乳酸菌活菌總量的影響

試驗結(jié)果如圖3 所示?？梢姕囟葘Πl(fā)酵影響較為顯著，在37 ℃時發(fā)酵液中乳酸菌總數(shù)最大，而溫度過高（42 ℃）或者過低（25 ℃、30 ℃）都會影響乳酸菌生長繁殖的性能，因此最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖3 溫度對乳酸菌生長的影響

3.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液pH及乳酸菌總量的影響

試驗結(jié)果如圖4 所示。可見乳酸菌總量隨著發(fā)酵時間的推移逐步增加，在36 h達到最高峰，并維持高水平4 d左右，之后逐步下降。其變化與乳酸菌的增值有關(guān)，即乳酸菌在0～12 h 處于蓄勢期或準備期增值緩慢，而在12 ～36 h 呈對數(shù)級快速繁殖，之后受環(huán)境pH 等影響處于逐步趨于水平增殖，在15 d后逐步凋亡活菌數(shù)降低。發(fā)酵制劑pH 值的變化也印證了乳酸菌活菌數(shù)的變化，即0～12 h 下降幅度較小，在12～36 h下降較快，36 h之后緩慢降低，直至15 d趨于恒定。根據(jù)活菌數(shù)和pH值變化，結(jié)合實際生產(chǎn)，確定發(fā)酵36 h達到高峰，7 d發(fā)酵完全。

圖4 時間對乳酸菌生長的影響

3.5 發(fā)酵罐歸芪粗提物乳酸菌發(fā)酵液pH及活菌數(shù)

試驗結(jié)果如表3所示，采用發(fā)酵罐發(fā)酵同樣在36 h時乳酸菌活菌總數(shù)最高，且基本持續(xù)至4 d，之后逐步降低；而發(fā)酵液pH 值則逐步降低，在3 d 后逐步降低至4.0 左右。證明此工藝條件可用作乳酸菌液體發(fā)酵歸芪粗體物制備發(fā)酵中藥。

4 討論

益生菌發(fā)酵中藥目前已成為中藥領(lǐng)域的研究熱點，而發(fā)酵條件如發(fā)酵培養(yǎng)基組分、菌種接種量、溫度、時間等對發(fā)酵產(chǎn)物的成分組成、含量甚至活性有影響。發(fā)酵條件的優(yōu)化能顯著提高發(fā)酵效果，提高發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)出，接種量優(yōu)化對于發(fā)酵影響較大，對發(fā)酵效果起著關(guān)鍵的作用。接種量過小，菌落生長繁殖非常慢，容易污染其他菌，同時影響發(fā)酵周期；而接種量過大時，菌落繁殖過快，營養(yǎng)迅速減少，容易造成發(fā)酵菌體老化，影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，影響發(fā)酵程度。越來越多的研究表明，中藥多糖類成分尤其是補益類中藥多糖成分對益生菌的生長有一定的促進作用［8］。該試驗所用歸芪粗體物主要成分為黃芪多糖和當歸多糖，試驗結(jié)果也顯示，其屎腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵具有互作效果。同時對發(fā)酵條件優(yōu)化后，可以制備出穩(wěn)定的并具有較好活性的發(fā)酵中藥制劑。發(fā)酵中藥在現(xiàn)代畜牧業(yè)健康養(yǎng)殖、高效養(yǎng)殖上具有廣闊的應(yīng)用前景［9］。

5 結(jié)論

該試驗通過單因素試驗優(yōu)化乳酸菌液體發(fā)酵歸芪粗體物，并采用發(fā)酵罐進行驗證，最終確定了最佳發(fā)酵條件為：歸芪粗提物最適宜添加量為30%，接種量3%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間36 h達最大活菌數(shù)，7 d及之后pH穩(wěn)定不變。研究為替抗發(fā)酵中藥研究提供了新思路，也為畜牧業(yè)健康養(yǎng)殖提供了更多可用飼料添加劑品種。