夏翠萍 張 可 王金宇 王中新

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥市 230032，電子郵箱：13155233015@163.com)

【提要】 氟康唑耐藥率和致死率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，受到學(xué)者們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。光滑假絲酵母菌是臨床念珠菌血癥重要的致病菌種，多效耐藥1(PDR1)基因功能獲得性突變導(dǎo)致外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)，在光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但目前對(duì)PDR1調(diào)節(jié)機(jī)制及突變情況的了解并不全面。本文從光滑假絲酵母菌PDR1基因介導(dǎo)的氟康唑耐藥機(jī)制、PDR1的調(diào)控機(jī)制及PDR1功能獲得性突變對(duì)菌株毒力的影響三個(gè)方面，闡述光滑假絲酵母菌PDR1基因介導(dǎo)的氟康唑耐藥機(jī)制。

白色假絲酵母菌是臨床侵襲性真菌感染的最主要病原體，但近年來，非白色假絲酵母菌感染率逐漸上升，其中光滑假絲酵母菌成為僅次于白色假絲酵母菌的常見致病性酵母菌[1]。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤、糖尿病和需要腸外營養(yǎng)支持等患者中，光滑假絲酵母菌的感染率已超過白色假絲酵母菌[2-3]。臨床上抗真菌藥物種類少，三唑類藥物是臨床最常用的抗真菌藥物，其中氟康唑具有口服效果好、毒性弱、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，成為臨床治療真菌感染的一線藥物。光滑假絲酵母菌是口腔黏膜的正常菌群，其具有對(duì)三唑類藥物敏感性低及耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)，因而耐藥率更高，這導(dǎo)致光滑假絲酵母菌感染患者的臨床預(yù)后較差。近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的大量應(yīng)用，光滑假絲酵母菌對(duì)三唑類藥物的耐藥率逐漸增加[4-5]，導(dǎo)致棘白菌素類藥物成為治療光滑假絲酵母菌的主要抗真菌藥。但最近的研究表明，光滑假絲酵母菌對(duì)棘白菌素類藥物的耐藥率也逐漸上升，并且棘白菌素類耐藥菌株同時(shí)也對(duì)三唑類耐藥[6-7]。因此，進(jìn)一步研究光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的耐藥機(jī)制，探索抑制耐藥的新靶點(diǎn)，是當(dāng)前亟須解決的問題。本文從光滑假絲酵母菌多效耐藥(pleiotropic drug resistance,PDR)1基因介導(dǎo)的氟康唑耐藥機(jī)制、PDR1基因的多種調(diào)控機(jī)制及PDR1基因功能獲得性突變對(duì)毒力的影響三個(gè)方面，闡述光滑假絲酵母菌PDR1基因調(diào)節(jié)氟康唑的耐藥機(jī)制。

1 PDR1基因介導(dǎo)的耐藥機(jī)制

光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥的主要機(jī)制是PDR1基因發(fā)生功能獲得性突變，從而導(dǎo)致外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)[8]。外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括CDR1p、CDR2p和SNQ2p，其編碼基因分別為CDR1、CDR2和SNQ2，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的耐藥中發(fā)揮主要作用[9]。PDR5基因是PDR1基因與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的結(jié)合位點(diǎn)，PDR1基因可激活PDR5基因介導(dǎo)光滑假絲酵母菌對(duì)多種藥物耐藥。CgPdr1p為鋅簇DNA結(jié)合區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子，參與下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，PDR反應(yīng)元件(PDR response elements，PDRE)包括PDRE1和PDRE2，位于PDR1基因序列的上游，在調(diào)節(jié)PDR1基因介導(dǎo)的耐藥方面，PDRE2作用大于PDRE1[10]。CDR1、CDR2、SNQ2基因序列同樣包含PDRE，啟動(dòng)子通過結(jié)合CDR1、CDR2、SNQ2基因序列上的PDRE介導(dǎo)氟康唑的外排作用。敲除PDRE可增加光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性[10]。PDR1基因通過激活下游靶基因CDR1、CDR2、SNQ2過表達(dá)介導(dǎo)外排泵耐藥，其中CDR1在外排泵耐藥中起主要作用，CDR2的作用次之，SNQ2的作用較小[11-12]。Whaley等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與敲除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的CDR1、CDR2、SNQ2基因相比，敲除PDR1基因后光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性更高，提示PDR1基因不僅可以通過功能獲得性突變介導(dǎo)下游外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因CDR1、CDR2、SNQ2過表達(dá)，從而引起病原體發(fā)生耐藥。PDR1基因還可能通過其他途徑介導(dǎo)氟康唑耐藥機(jī)制，但需進(jìn)一步研究。

2 PDR1基因的調(diào)控機(jī)制

PDR1基因是光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥的中心調(diào)控因子，主要通過以下3個(gè)方面發(fā)揮作用：(1)與氟康唑直接結(jié)合[14]，即PDR1基因可以直接與氟康唑結(jié)合，導(dǎo)致光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥；(2)引起光滑假絲酵母菌的線粒體編碼基因缺失，使得線粒體功能障礙，導(dǎo)致ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào)[15]；(3)PDR1基因發(fā)生功能獲得性突變。PDR1基因功能獲得性突變介導(dǎo)的外排泵蛋白過表達(dá)是光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥的主要原因。PDR1基因功能獲得性突變產(chǎn)生的氨基酸替代性突變上調(diào)下游靶基因，是CDR1過表達(dá)介導(dǎo)耐藥的主要機(jī)制之一。光滑假絲酵母菌PDR1基因與釀酒酵母菌PDR1基因、PDR3基因的同源性很高[16]，雖然與釀酒酵母菌PDR3基因同源性更高，但是其調(diào)控功能(為自動(dòng)調(diào)控)更接近于釀酒酵母菌PDR1。PDR1基因的功能區(qū)域主要有3個(gè)部分：羧基末端(即激活區(qū))、中間同源區(qū)(middle homology region，MHR)和DNA結(jié)合區(qū)。PDR1基因的功能獲得性突變主要發(fā)生在羧基末端和MHR[17]，轉(zhuǎn)錄共激活因子MedA15通過激酶誘導(dǎo)結(jié)合域與PDR1羧基末端結(jié)合，在PDR1基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羧基末端三倍體進(jìn)行修飾可以提高光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性，而對(duì)羧基末端一倍體和PDR1氨基端進(jìn)行修飾則降低了光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性[18]，可能原因是羧基末端三倍體修飾改變了PDR1的細(xì)胞定位，使PDR1基因從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿，從而使PDR1基因的自動(dòng)調(diào)控功能降低。敲除MHR會(huì)使光滑假絲酵母菌處于一種高毒性的狀態(tài)[17]，在這種情況下光滑假絲酵母菌可因不能耐受自身毒性而死亡。說明光滑假絲酵母菌的PDR1基因即使在發(fā)生功能獲得性突變后仍存在負(fù)調(diào)控，否則光滑假絲酵母菌會(huì)產(chǎn)生毒性導(dǎo)致自身死亡，而這種功能獲得性突變超過了PDR1正常的負(fù)調(diào)控或者改變了具有負(fù)調(diào)控功能的蛋白的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。PDR1的功能獲得性突變主要是通過激活下游靶基因CDR1介導(dǎo)耐藥的發(fā)生，但Simonicova等[19]發(fā)現(xiàn)PDR1基因的羧基末端發(fā)生的兩個(gè)突變，即D1082G和LWG1079AA位點(diǎn)突變，并不是嚴(yán)格意義上的功能獲得性突變，因?yàn)镈1082G和LWG1079AA位點(diǎn)突變可降低光滑假絲酵母菌的耐藥性。

麥角固醇生物合成途徑在光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥方面也發(fā)揮重要作用，氟康唑的抗菌作用機(jī)制主要是通過與14α-去甲基化酶結(jié)合，抑制光滑假絲酵母菌細(xì)胞膜脂質(zhì)的合成，從而起到抑制真菌生長作用。麥角固醇11是麥角固醇生物合成途徑的編碼基因，其通過編碼關(guān)鍵酶14α-去甲基化酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂質(zhì)的合成。Upc2是麥角固醇通路的主要調(diào)節(jié)因子，Upc2通過促進(jìn)麥角固醇11的合成維持細(xì)胞膜脂質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能[20]。Vu等[21]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥角固醇11活性受抑制(如氟康唑處理)時(shí)，Upc2通過結(jié)合麥角固醇11、PDR1、CDR1啟動(dòng)子，從而參與PDR1基因介導(dǎo)光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的耐藥。由此可知，Upc2是連接麥角固醇生物合成和PDR1基因調(diào)控外排泵耐藥協(xié)同作用的中間調(diào)節(jié)因子。Jjj1和Bre5是PDR1基因的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白[22-23]。敲除劑量依賴性敏感的光滑假絲酵母菌株的Jjj1基因會(huì)導(dǎo)致光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥，且ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDR1p和CDR2p表達(dá)量分別增加16倍和4倍，而Snq2p的表達(dá)沒有顯著改變[22]。雖然Jjj1可通過抑制PDR1基因介導(dǎo)的CDR1激活來參與光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑的耐藥，但仍有部分PDR1基因不受Jjj1的影響。Bre5是去泛素化酶復(fù)合物的組成部分，與泛素化特異性蛋白酶Ubp3共同參與蛋白質(zhì)的泛素化修飾，Bre5和Ubp3組成的復(fù)合物參與轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD和RNA聚合酶Ⅱ的泛素化[24]，Bre5可抑制PDR1基因?qū)DR1的激活，這表明PDR1可能受泛素化修飾作用的調(diào)節(jié)。

3 PDR1基因功能獲得性突變對(duì)光滑假絲酵母菌毒力的影響

PDR1基因的功能獲得性突變可增強(qiáng)光滑假絲酵母菌的毒力和侵襲力，與感染野生菌株相比，感染PDR1基因突變的光滑假絲酵母菌的小鼠的組織損傷程度加重、臟器感染的菌量明顯增加，并且不同的功能獲得性突變對(duì)光滑假絲酵母菌毒力的影響并不相同[25-27]。由此可見，PDR1基因發(fā)生功能獲得性突變后光滑假絲酵母菌具有更強(qiáng)的致病性。EPA1是一種編碼黏附素的基因。研究發(fā)現(xiàn)，PDR1基因的功能獲得性突變?cè)鰪?qiáng)了光滑假絲酵母菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附力，同時(shí)EPA1基因的表達(dá)量也發(fā)生了上調(diào)，表明PDR1基因的功能獲得性突變可能通過上調(diào)黏附基因EPA1的表達(dá)從而增強(qiáng)光滑假絲酵母菌的毒力[28]。但Tian等[29]卻研究發(fā)現(xiàn)，PDR1 基因的G346D位點(diǎn)發(fā)生功能獲得性突變后反而降低了EPA1基因的表達(dá)和光滑假絲酵母菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附作用。但目前對(duì)PDR1基因功能獲得性突變的研究有限，并且對(duì)于多位點(diǎn)發(fā)生突變后光滑假絲酵母菌的毒力如何變化，也了解甚少。根據(jù)上述文獻(xiàn)，D1082G和LWG1079AA位點(diǎn)突變可降低光滑假絲酵母菌的耐藥性，但這兩個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)黏附性又產(chǎn)生何種影響，光滑假絲酵母菌PDR1基因發(fā)生不同功能獲得性突變后其耐藥性和對(duì)宿主細(xì)胞的黏附力的影響是否一致，都需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，PDR1基因在光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥中發(fā)揮重要作用，但目前對(duì)PDR1基因調(diào)控機(jī)制的研究并不全面，PDR1基因在發(fā)生單個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)功能獲得性突變后光滑假絲酵母菌的耐藥性和毒力如何變化，仍需進(jìn)一步探究；同時(shí)，探尋新的PDR1基因負(fù)性調(diào)節(jié)因子也是未來研究的重點(diǎn)。但光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑耐藥涉及多種機(jī)制，是一個(gè)多水平作用、多因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，單個(gè)耐藥基因不能完全解釋光滑假絲酵母菌的耐藥機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究以了解更多的耐藥機(jī)制。