田 莎，陳 錕，王慶平

作者單位：(200040)中國上海市，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院1 眼科；2檢驗(yàn)科

0引言

玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤(vitreoretinal lymphoma，VRL)是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)的一種罕見亞型，其主要病理類型為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large cell B-cell lymphomas，DLBCL)，可累及玻璃體、視網(wǎng)膜及視神經(jīng)[1]。約60%～90%的VRL最終發(fā)展至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)，同時15%～25%的PCNSL患者會出現(xiàn)眼內(nèi)累及[2]。

近年來一項(xiàng)涉及7個國家16個研究中心的廣泛回顧性研究發(fā)現(xiàn)，VRL可以發(fā)生在免疫系統(tǒng)功能正常的成年人(24～85歲，中位年齡為63歲)[3]。VRL的臨床表現(xiàn)呈多樣性，最常見癥狀為視物模糊、與眼部炎癥程度不符的視力下降和飛蚊癥[4]。其常偽裝成各種非特異性慢性和復(fù)發(fā)性葡萄膜炎，但對抗炎反應(yīng)差。玻璃體混濁及視網(wǎng)膜下病灶是最為常見的臨床體征。其中，較為特異性的體征為：(1)“北極光”:即惡性細(xì)胞沿玻璃體膠原纖維排列生長[5-6];(2)“豹斑”:即惡性細(xì)胞聚集并在視網(wǎng)膜下形成色素病變[7]。

雖然臨床表現(xiàn)和體征可以提示該疾病，但VRL的明確診斷仍是需要通過玻璃體液細(xì)胞病理學(xué)檢查，光鏡下見到大量形態(tài)變異的異常大淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞增殖浸潤，胞體大，胞質(zhì)嗜堿性，核大、不規(guī)則或呈分葉狀，核染色質(zhì)粗糙，核仁大而明顯。這是目前診斷VRL的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。玻璃體液的取樣主要是通過玻璃體抽吸和玻璃體切割術(shù)進(jìn)行，而這兩種取樣方法在技術(shù)上都具有極大的挑戰(zhàn)性[9]。具體來說，玻璃體液中的細(xì)胞數(shù)量低可導(dǎo)致再次重復(fù)取樣，不僅給患者造成手術(shù)痛苦和疾病診斷的困難，還可能導(dǎo)致其眼部并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)隨著增加。此外，許多其他混雜因素(污染物、碎屑、壞死細(xì)胞和反應(yīng)性免疫細(xì)胞)的存在是導(dǎo)致陽性預(yù)測值很低(<30%)，假陰性率很高(>70%)的原因[10-11]。因此，VRL的診斷仍面臨很大的挑戰(zhàn)，仍需要探索出更高效的細(xì)胞學(xué)檢查方法及更多高效的輔助診斷技術(shù)。以下將從影像學(xué)診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷兩方面介紹VRL的診斷進(jìn)展。

1影像學(xué)診斷

1.1眼底熒光素血管造影和吲哚菁綠造影VRL的眼底熒光素血管造影(fundus fluorescein angiographies, FFA)顯示早期和晚期的斑駁、顆粒狀低熒光病灶，晚期可具有典型的“豹斑外觀”[12-14]。然而，這樣的豹紋斑點(diǎn)并不是VRL的獨(dú)有特征,在非腫瘤性偽裝綜合征中也可出現(xiàn)類似表現(xiàn)[13]。但Fardeau等[13]研究發(fā)現(xiàn)VRL病灶在FFA顯示的圓形的低熒光團(tuán)簇病灶與眼底點(diǎn)狀白色病變是相對應(yīng)的，此外，吲哚菁綠造影(indocyanine green angiographies，ICGA)往往只在早期呈現(xiàn)出較FFA相對應(yīng)但數(shù)量更少的圓形簇狀低熒光病變。其FFA和ICGA聯(lián)合診斷的陽性預(yù)測值為88.9%，陰性預(yù)測值為85%。若臨床上高度疑似淋巴瘤時，行FFA及ICGA檢查是非常有必要的。

1.2光學(xué)相干斷層掃描VRL在光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)可顯示視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)損傷、RPE下高反射結(jié)節(jié)、橢圓體帶連接中斷、視網(wǎng)膜內(nèi)層多處高反射性浸潤灶和滲出性視網(wǎng)膜脫離[15]。而黃斑水腫較少見。2019年Deák等[16]首次在VRL患者的OCT中發(fā)現(xiàn)診斷的特異性表現(xiàn)：即二級和三級血管附近區(qū)域貫穿視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮全層的垂直高反射柱(vertical hyperreflective lesions，VHRL)，這對VRL的診斷有重要提示意義。

1.3眼底照相VRL在眼底彩色照相中可觀察到視網(wǎng)膜的乳脂樣白色病灶，以及因此造成的“豹紋”樣眼底，這一眼底表現(xiàn)在FFA中更加明顯[17]。此外，還可在眼底照相中看到視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎及血管炎的表現(xiàn)。

1.4眼部B超Lai等[18]提出VRL在超聲可見簇狀密集點(diǎn)狀高回聲或偏心團(tuán)塊。B超掃描具有客觀性、重復(fù)性好、描述性好、隨訪便捷等優(yōu)勢可用于VRL患者的初步篩查及隨訪[18]。但眼部B超的表現(xiàn)不具有特異性，無法準(zhǔn)確的區(qū)分葡萄膜炎和VRL。

1.5眼底自發(fā)熒光眼底自發(fā)熒光(fundus autofluorescence, FAF)可輔助識別眼內(nèi)淋巴瘤的微小病灶，特別針對RPE被輕微破壞時[19-20]。Ishida等[21]研究者通過觀察10例VRL患者18眼發(fā)現(xiàn)其中11眼(61%)出現(xiàn)異常熒光表現(xiàn)，其中FAF上的強(qiáng)自體熒光點(diǎn)、FFA上的弱熒光點(diǎn)和OCT的高反射點(diǎn)之間存在對應(yīng)關(guān)系。此外，在淋巴瘤浸潤消退的情況下，有可能會留下低自發(fā)熒光區(qū)域。雖然FAF的異常發(fā)現(xiàn)可能提示眼內(nèi)累及未緩解，若無異常并不能排除VRL的緩解和復(fù)發(fā)。但因其為無創(chuàng)性檢查，在評估患者視網(wǎng)膜下特征與VRL一致時，F(xiàn)AF可作為臨床檢查結(jié)果的補(bǔ)充。若與其他影像學(xué)檢查聯(lián)合有著重要提示作用。

1.6共聚焦顯微鏡VRL的臨床特征主要局限于后段。僅部分VRL患者會有眼前節(jié)表現(xiàn)其中包括前房閃輝、角膜后沉著物(keratic precipitates，KPs)、假性前房積膿及虹膜浸潤病灶。這些體征往往易與葡萄膜炎混淆。Mahendradas等[22]通過觀察3例VRL患者6眼在共聚焦顯微鏡(invivoconfocal microscopy，IVCM)的眼前節(jié)表現(xiàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：所有眼均可見特有的KPs花型。這種花卉樣圖案是由一個非典型淋巴細(xì)胞(細(xì)胞大、核質(zhì)比高、核仁明顯)組成的高反射為中心,周圍伴有花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)。根據(jù)花瓣?duì)畹耐暾潭瓤煞譃椴煌暾屯暾麅煞N類型?；颊呓?jīng)過眼科局部化療后IVCM上KPs消失。因此，IVCM上KPs的表現(xiàn)可以認(rèn)為是VRL中有用的診斷和治療監(jiān)測指標(biāo)[22]。但該研究樣本量小缺乏對照，仍需更大樣本量的研究。且IVCM的應(yīng)用可能僅限于有前段累及的腫瘤性偽裝綜合征。

各種影像學(xué)特異性表現(xiàn)尤其是多模影像的應(yīng)用可以高度警示VRL，但VRL的明確診斷仍需病理學(xué)診斷的印證。

2實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1.細(xì)胞學(xué)診斷

2.1.1包埋法近年來的研究已經(jīng)證實(shí)稀釋的玻璃體液和未稀釋的玻璃體液的診斷效能類似[23-24]，遂臨床醫(yī)師不需要為取未稀釋的玻璃體液承擔(dān)很大的風(fēng)險(xiǎn)。包埋法主要流程包括制備細(xì)胞塊(大多數(shù)是離心取細(xì)胞沉渣)，固定(可分為95%乙醇、丙酮、火膠棉)、脫水、包埋、切片，隨后進(jìn)行HE染色，觀察染色效果。Zaldivar等[24]首次將細(xì)胞塊技術(shù)與傳統(tǒng)的涂片細(xì)胞學(xué)檢查診斷VRL效能進(jìn)行比較，證明了細(xì)胞塊法具有良好的診斷率，其敏感性和特異性分別為93.3%和100%。細(xì)胞塊技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是可用于特殊染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和PCR檢測[25]，并可具有回溯性研究。但至今缺少統(tǒng)一規(guī)范且高效的制備過程。

2.1.2液基細(xì)胞學(xué)液基細(xì)胞學(xué)因其具有較好的細(xì)胞保存率和可以減少固定及暴露空氣中產(chǎn)生干燥的偽影和細(xì)胞溶解等問題，廣泛應(yīng)用于臨床大多數(shù)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，但在腦脊液及玻璃體液檢查中應(yīng)用較少。最近一項(xiàng)大型研究[26]對比ThinPrep(液基薄層法)和甩片法在腦脊液中的應(yīng)用證明兩種方法的敏感性、特異性、診斷準(zhǔn)確率和陰性預(yù)測值的評估相當(dāng)，但ThinPrep的陽性預(yù)測值是100%，甩片法的陽性預(yù)測值是95%，ThinPrep的陽性預(yù)測值優(yōu)于甩片法。這也為VRL玻璃體細(xì)胞學(xué)檢查提供新思路。

2.1.3甩片法(離心涂片法)近年來許多研究顯示，大多數(shù)玻璃體液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查使用的是甩片法，且玻片制備采用離心涂片機(jī)裝置，可以更好地保存細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)固定液的不同可分為95%乙醇、丙酮、甲醇、多聚甲醛及福爾馬林固定，大多數(shù)文獻(xiàn)研究中最常用的是95%乙醇，也有研究證明乙醇固定會使淋巴瘤細(xì)胞破壞更多[27]。福爾馬林固定的標(biāo)本在免疫化學(xué)染色時需要進(jìn)行抗原修復(fù)，在修復(fù)過程中可能出現(xiàn)細(xì)胞脫落的情況。華山醫(yī)院采用丙酮固定后的免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行診斷，但不能進(jìn)行回溯性研究。

2.1.4流式細(xì)胞學(xué)流式細(xì)胞學(xué)可以定量分析各種細(xì)胞類型的百分比和絕對計(jì)數(shù)，有助于鑒別眼內(nèi)淋巴瘤和免疫介導(dǎo)的葡萄膜炎[11]。但流式細(xì)胞學(xué)通常受到檢測樣本中是否有完整的具有活性的細(xì)胞以及足夠量細(xì)胞數(shù)的限制，甚至一些標(biāo)本需要膠原酶處理后才能檢測，經(jīng)過酶處理后的樣本可能導(dǎo)致一部分細(xì)胞的丟失。玻璃體樣本常因其缺乏足夠的細(xì)胞及出現(xiàn)大量破碎細(xì)胞而不能進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測。一項(xiàng)對疑似VRL的細(xì)胞學(xué)評估和流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行比較的前瞻性研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)評估仍是診斷VRL的金標(biāo)準(zhǔn)，而流式細(xì)胞學(xué)只能為VRL的診斷提供有力的支持[24]。

常見的細(xì)胞學(xué)診斷的方法有以上幾種，如何提高細(xì)胞學(xué)的陽性率一直是臨床醫(yī)生和病理醫(yī)師共同面對的難題。近年來，很多研究建議在診斷性玻璃體活檢前停止使用全身性的皮質(zhì)類固醇制劑，從淋巴瘤細(xì)胞浸潤最密集的病灶部分獲取腫瘤細(xì)胞，在樣本處理前使用特殊培養(yǎng)基代替鹽水[28]來提高細(xì)胞活性和細(xì)胞學(xué)的診斷效率。因淋巴瘤細(xì)胞脆弱且易破碎[25]，快速處理標(biāo)本對提高細(xì)胞學(xué)診斷率也至關(guān)重要[24,29]。此外，越來越多的研究表明細(xì)胞學(xué)聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色可提高細(xì)胞學(xué)診斷陽性率[25,30]。也有研究證明細(xì)胞學(xué)檢查和流式細(xì)胞學(xué)檢測的聯(lián)合應(yīng)用在診斷惡性腫瘤方面往往比單獨(dú)使用這兩種檢測方法更敏感[29]。

2.2免疫學(xué)診斷白介素-6(IL-6)是一種促炎細(xì)胞因子，在炎癥條件下分泌，常見于葡萄膜炎[31]。相比之下，IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[32]。由于眼內(nèi)(特別是玻璃體)樣本在取樣過程中可能被稀釋，因此采用IL-10/IL-6比值對樣本間不同稀釋程度進(jìn)行歸一化。一些研究已經(jīng)報(bào)道了利用IL-10和IL-10/IL-6比值成功區(qū)分淋巴瘤和葡萄膜炎[5,33]。然而，一些研究也表明，低IL-10水平(目前尚無共識的界限)或IL-10/IL-6比值<1并不一定排除淋巴瘤[34]。Costopoulos等[35]提出了眼內(nèi)淋巴瘤診斷的白介素評分(interleukin score for intra ocular lymphoma diagnosis，ISOLD)，該模型在一個大型多中心歐洲隊(duì)列中評估了由IL-6和IL-10水平引起PVRL的概率，具有高敏感性(93%)、特異性(95%)。Kuo等[36]在其基礎(chǔ)上訓(xùn)練和驗(yàn)證了一個新的單中心的邏輯回歸模型。此模型較ISOLD模型具有更佳的診斷效能，證明通過Logistic回歸進(jìn)行眼內(nèi)細(xì)胞因子分析可能是一種很有前途的輔助細(xì)胞病理學(xué)的方法

2.3分子學(xué)診斷

2.3.1免疫球蛋白重鏈免疫球蛋白重鏈(immunoglobulin heavy chain,IgH)重排及免疫球蛋白游離輕鏈kappa和lambda比率(κ/λ比值)：在正常的B細(xì)胞發(fā)育中，14號染色體編碼兩條IgH和兩條免疫球蛋白輕鏈(Igκ和Igλ)的基因片段重排[37]。免疫球蛋白基因經(jīng)過復(fù)雜的重排過程產(chǎn)生出不同的抗體編碼序列，因此基因重排是隨機(jī)的，細(xì)胞表現(xiàn)為多家族和多克隆。然而，VRL癌變B細(xì)胞的細(xì)胞株起源于單個細(xì)胞，遂表現(xiàn)為相同的基因重排[38]。隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)的發(fā)展，多項(xiàng)研究已經(jīng)確立了PCR檢測眼內(nèi)液(包括玻璃體液、房水及視網(wǎng)膜下液)及眼組織切片IgH基因重排作為玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的一種有價(jià)值的診斷檢查[5,34,38-40]。然而，迄今為止關(guān)于這項(xiàng)測試的最大規(guī)模的研究是由美國國立衛(wèi)生研究院團(tuán)隊(duì)在2011年發(fā)表的，證明了其敏感性為100%，特異性為99%[41]。此外，VRL通常由帶有限制性κ或λ鏈的單克隆B細(xì)胞群組成。κ/λ比值>3或<0.5是淋巴瘤的高度敏感標(biāo)記物[42-44]。

2.3.2微小核糖核酸微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)是一種相對較小(長度為18～24個核苷酸)的非編碼RNA，通過與靶mRNA結(jié)合，具有抑制基因翻譯和降解mRNA的功能[45]。miRNAs參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡和腫瘤發(fā)生。miRNAs的失控表達(dá)在人類癌癥中很常見。miRNAs還可以作為癌基因或腫瘤抑制因子。2014年，Tuo等[46]將VRL患者和葡萄膜炎的玻璃體液和房水進(jìn)行了比較，結(jié)果僅確定了miR-155的表達(dá)具有差異性，即VRL患者的樣本中miR-155的水平明顯低于葡萄膜炎組。Kakkassery等[47]首次在PVRL患者的玻璃體標(biāo)本中觀察到miR-21、miR-19b和miR-92表達(dá)顯著上調(diào)，對于區(qū)分VRL與葡萄膜炎具有重要意義。由于所需液體體積較小且只需要上清液，目標(biāo)miRNA有望成為VRL診斷和監(jiān)測的優(yōu)選指標(biāo)。

2.3.3基因檢測

2.3.3.1單基因檢測髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MYD88)是一種通過Toll/IL-1信號通路激活NF-κB表達(dá)的接合蛋白，據(jù)報(bào)道，MYD88突變在DLBCL頻率較高,包括VRL和原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)。在這些淋巴瘤中，MYD88基因的第256位亮氨酸(CTG)到脯氨酸(CCG)的非同義點(diǎn)突變MYD88L265P，是最常見的突變，大約占>60%[48-51]。最近，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)VRL玻璃體液中MYD88突變頻率高達(dá)69%～87%[52-53]。Miserocchi等[51]在VRL房水中發(fā)現(xiàn)MYD88的突變頻率也高達(dá)75%，檢測MYD88突變的方式從傳統(tǒng)的靈敏度較低的PCR和Sanger測序法，到高分辨率熔體分析(high-resolution melt analysis，HRMA),再到等位基因PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)，再到近年來的液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)的臨床運(yùn)用。ddPCR對VRL眼內(nèi)液中MYD88L265p的檢測顯示了100%的特異性[54], ddPCR的超靈敏能力不僅為VRL的診斷提供了一個很有前景的工具，而且也顯示出了微創(chuàng)性診斷的可能[55-56]。

2.3.3.2二代測序2017年，Cani等[57]發(fā)表了第一個玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的二代測序(next-generation sequencing, NGS)研究。在3435個擴(kuò)增子(126個基因)的偏置候選基因突變篩選中，研究4個玻璃體樣本，這些擴(kuò)增子優(yōu)先選擇體細(xì)胞反復(fù)改變的致癌基因、腫瘤抑制基因和高拷貝數(shù)改變的基因。除了MYD88基因突變外，該研究還發(fā)現(xiàn)了兩個腫瘤抑制基因CDKN2A和PTEN的拷貝數(shù)丟失[57]。此外，有研究表明，與PCNSL類似，VRL屬于DLBCL的MCD/cluster 5亞組，MYD88、CD79B、PIM-1、IGLL5、BTG1/2、TBL1XR1和ETV6的突變頻率較高，9p21/CDKN2A缺失也很常見[58]。

2.3.3.3單細(xì)胞測序細(xì)胞MYD88分析能夠揭示單個細(xì)胞中與MYD88WT、雜合或純合MYD88L265P相對應(yīng)的清晰且分辨率高的測序峰，為幫助VRL診斷提供了有用的遺傳工具[59]。單細(xì)胞DNA測序還可以幫助闡明來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞和眼睛之間的關(guān)系。

3小結(jié)

綜上所述，為了能更準(zhǔn)確地診斷VRL，應(yīng)該結(jié)合VRL的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)檢查加免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)的檢測結(jié)果綜合判斷。當(dāng)臨床懷疑VRL時，建議完善眼科多模式影像檢查，包括眼底照相、OCT、FAF、FFA、ICGA和眼部B超。頭顱增強(qiáng)MRI及全身正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描顯像(positron emission tomography/computed tomography, PET/CT)對全身其它部位累及的排查也是有必要的。診斷性玻璃體切除術(shù)仍是診斷VRL的首選檢查。最常推薦的細(xì)胞學(xué)檢查法仍是離心涂片法，聯(lián)合免疫組化可以提高細(xì)胞病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。眼內(nèi)液細(xì)胞因子是強(qiáng)有力的輔助檢查手段，但病毒性視網(wǎng)膜炎、弓形蟲病等也會表現(xiàn)為IL-10的異常升高，從而導(dǎo)致VRL診斷的假陽性。目前輕鏈限制及IgH基因重排有助于臨床的綜合診斷，然而不是所有的B淋巴細(xì)胞淋巴瘤都能保持其形成細(xì)胞表面免疫球蛋白的能力。MYD88突變是PCNSL和VRL中的熱點(diǎn)突變，高度懷疑VRL而沒有找到細(xì)胞病理學(xué)、輕鏈限制及IgH基因重排的證據(jù)時，可通過檢測MyD88突變的來輔助診斷，但不能完全替代細(xì)胞病理學(xué)診斷。目前還可以通過高通量測序，甚至無偏倚的全外顯子組測序及全基因組測序來診斷VRL。近年來，測序技術(shù)的發(fā)展使臨床對VRL轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌分析成為了可能。