黃惠興,陳明望,莊曉娜,鄭嘉瑩,李逸飛,李天宇通信作者
(1.中山市黃圃鎮(zhèn)動物疫病預(yù)防控制中心,廣東 中山 528400;2.中山市動物疫病預(yù)防控制中心,廣東 中山 528400;3.廣西大學(xué),廣西 南寧 530004)
雞毒支原體(mycoplasma gallisepticum,MG)又稱為雞敗血支原體,可以通過飛沫或垂直傳播進(jìn)入家禽體內(nèi),引起家禽產(chǎn)生呼吸道疾病[1],并可使家禽淋巴細(xì)胞萎縮壞死,免疫器官受損,產(chǎn)生免疫抑制,容易與其他病原進(jìn)行混合感染,導(dǎo)致死亡率增高,給全球家禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。由于MG特殊的免疫逃逸機(jī)制,可在宿主體內(nèi)長期存活,導(dǎo)致病禽終身帶毒,且存在散毒風(fēng)險?,F(xiàn)階段MG滅活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的免疫缺陷,滅活疫苗免疫保護(hù)效果較弱;弱毒疫苗免疫存在散毒和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險。在藥物治療方面,MG臨床常用抗生素,但容易產(chǎn)生耐藥性,進(jìn)一步加劇了MG防控難度。本文針對MG病原學(xué)特點和流行特點,建議家禽養(yǎng)殖業(yè)優(yōu)化管理模式,做好生物安全防控,培育優(yōu)質(zhì)MG凈化雞群。
雞毒支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間的原核生物,無細(xì)胞壁,僅細(xì)胞膜包裹,唯一的細(xì)胞器是核糖體,雞毒支原體細(xì)胞長度為250~500 nm。在電子顯微鏡下可觀察到其呈現(xiàn)多種形態(tài),常見的3種形態(tài)主要是球狀、絲狀和桿狀。雞毒支原體采用革蘭氏染色著色效果較差,呈弱陰性,經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色液染色著色效果較好,呈淡紫色。雞毒支原體對大環(huán)內(nèi)酯類以及四環(huán)素類藥物敏感,但易產(chǎn)生耐藥性,對作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物(磷霉素、糖肽或β-內(nèi)酰胺類抗生素)以及第一代喹諾酮類藥物、磺胺類藥物、多黏菌素、甲氧芐啶和利福平耐受力較強(qiáng)。對紫外線敏感,陽光直射就能使其迅速喪失活力,一般常用的化學(xué)消毒劑(含氯溶液、乙醇、乙醚、過氧乙酸等)能將其迅速殺死,50℃條件下加熱20 min也能將其滅活。雞毒支原體對雞血紅細(xì)胞具有很強(qiáng)的吸附性,這一特性常用于與非致病性禽源支原體鑒別診斷。
雞毒支原體進(jìn)入雞體后通過其單極末端的泡狀結(jié)構(gòu)釋放出細(xì)胞黏附素GapA、CrmA蛋白使其吸附到宿主氣管黏膜上,同時利用微管透過黏膜將自身DNA、核酸酶注入到宿主細(xì)胞內(nèi),再利用宿主細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量繁殖,使氣管纖毛細(xì)胞病變,纖毛運(yùn)動能力逐漸喪失,氣管內(nèi)的異物以及黏性分泌物無法排出體外,會殘留在肺泡和細(xì)支氣管末端,逐漸導(dǎo)致肺小葉細(xì)胞壞死,肺部出現(xiàn)組織肉病變,造成雞出現(xiàn)呼吸困難。并逐漸由呼吸道轉(zhuǎn)移侵入到全身各個組織器官,病禽其他臟器也可見肝周炎、氣囊炎和腹膜炎等。
雞毒支原體粘附在氣管黏膜表面時其細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)與宿主細(xì)胞上Toll樣受體(Toll like receptor ,TLRs)相結(jié)合,其中TLR2主要是介導(dǎo)誘導(dǎo)炎性因子釋放、促凋亡和抗凋亡等[3]。雞毒支原體能與TLR2受體結(jié)合通過膜通道蛋白將信號傳遞至宿主細(xì)胞膜內(nèi),引起免疫應(yīng)答,使B細(xì)胞、T細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞大量增殖,同時通過轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor,MyD88)和TIRAP(TLR containing adapter protein)依賴途徑,使下游分子磷酸化,從而激活NF-κB(nuclear factor-KB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路,這2類通路可調(diào)控許多炎癥相關(guān)基因的表達(dá),并可影響炎癥和免疫反應(yīng)。NF-κB信號通路中激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)激酶(NIK),進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB),NF-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的細(xì)胞核中,誘導(dǎo)下游炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL1β)、白細(xì)胞介素6(IL6)以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá),導(dǎo)致免疫細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子加速凋亡造成組織炎性損傷(見圖1)。
圖1 Toll-like receptor,NF-κB,MAPK 信號通路[4]
當(dāng)雞毒支原體透過黏膜屏障后開始侵入非吞噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞HD11,雞毒支原體在感染HD11后雞體抗氧化能力降低,引起細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡,破壞線粒體,釋放線粒體DNA,并產(chǎn)生活性氧(ROS),過量的ROS積累引發(fā)雞體的氧化應(yīng)激和異常的細(xì)胞凋亡[5]。吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量改變以及結(jié)構(gòu)破壞都會嚴(yán)重影響免疫器官的功能,在雞毒支原體感染雞體期間,會造成淋巴細(xì)胞的萎縮以及壞死,導(dǎo)致免疫失調(diào),造成法氏囊、胸腺和脾臟等免疫器官受損,破壞了雞的免疫系統(tǒng),產(chǎn)生免疫抑制。
雞毒支原體的基因中涉及表面抗原多樣化的數(shù)量非常多,使得LAMPs可以以較高頻率發(fā)生變異,特別是細(xì)胞粘附素可產(chǎn)生高度突變,使支原體可以逃避宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答,所以禽類一旦感染雞毒支原體,將長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài),導(dǎo)致雞體的免疫功能遭到抑制,使雞毒支原體更容易達(dá)到免疫逃逸。
雞毒支原體可感染不同日齡的禽類,尤其雞和火雞最易感,其中幼齡雞和純種雞的發(fā)病率和死亡率最高。MG感染成年雞通常不表現(xiàn)出臨床癥狀,呈隱性感染。然而幼齡雞感染后通常表現(xiàn)為呼吸困難甚至肺炎等癥狀,嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡,死亡率高達(dá)30%。MG一年四季均可發(fā)生,尤其寒冷季節(jié)感染率最高。
MG的傳播途徑有兩種方式,即水平傳播和垂直傳播,以后者傳播方式為主。水平傳播是指病原通過飛沫的方式進(jìn)行空氣傳播,如咳嗽和噴嚏。此外,健康禽類接觸污染的飼料、水及土壤也可感染。垂直傳播是指帶菌母雞經(jīng)蛋傳播給雛雞,或者帶菌公雞在交配時通過精液傳播給母雞從而使母雞感染。
1976年,雞毒支原體首次在我國分離出來。1986年,冀錫霖等[6]對全國20個省(區(qū))雞場開展MG的流行病學(xué)調(diào)查研究,試驗結(jié)果顯示雞群中MG的平均陽性率高達(dá)78.5%,表明MG在我國多個省份已經(jīng)迅速傳播,將嚴(yán)重影響我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。2018—2019年,謝昊晉[7]采集江蘇省未免疫雞毒支原體疫苗的規(guī)?;u場血清樣本3 112份血樣,陽性率為55.27%。與此同時,2018—2019年,上海市連續(xù)監(jiān)測2年養(yǎng)殖戶專業(yè)戶和散養(yǎng)戶的雞群MG血清抗體陽性率的感染情況,其中養(yǎng)殖戶專業(yè)戶MG抗體陽性率分別為79.46%(2018年)和81.65%(2019年),而散養(yǎng)戶MG抗體陽性率分別為50%(2018年)和59.49%(2019年),由此看出養(yǎng)殖專業(yè)戶的雞群MG感染情況比散養(yǎng)戶嚴(yán)重。
雛雞感染MG后的主要臨床癥狀為呼吸啰音、打噴嚏和咳嗽,鼻腔內(nèi)有黏液性鼻液,往往會堵塞鼻孔影響呼吸。眼結(jié)膜潮紅、流淚增多、眼瞼腫脹。另外,病雞食欲減退、精神萎靡、生長速度慢、體重減輕。
成年雞感染MG后,臨床癥狀類似于雛雞,但相比雛雞較為緩和。產(chǎn)蛋病雞產(chǎn)蛋率下降,產(chǎn)軟殼蛋,種蛋受精率、孵化率降低,孵化出來的雛雞往往體質(zhì)較弱。感染嚴(yán)重則還會出現(xiàn)肺炎、心包炎、肝被膜炎等[1]。
當(dāng)MG感染雞群后,容易引起雞群繼發(fā)大腸桿菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒混合感染,導(dǎo)致呼吸道癥狀加重,產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥,導(dǎo)致雞群死亡率增高,給養(yǎng)殖場戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
剖檢發(fā)現(xiàn)雞只的鼻孔、氣囊、氣管以及支氣管中存在較多黏性液體或者卡他性分泌物,氣管壁發(fā)生水腫,感染前期氣囊膜變厚且呈灰白色不透明狀,感染后期可見氣囊壁上存在干酪樣滲出物。蛋雞剖檢時可見輸卵管炎癥,與大腸桿菌混合感染時,可見纖維性心包炎和肝周炎。
MG病原分離鑒定常用人工培養(yǎng)基(FM-4培養(yǎng)基、改良Frey液體培養(yǎng)基和PPLO培養(yǎng)基)、雞胚、雞組織培養(yǎng)物分離病原體。選用疑似感染雞只的上呼吸道滲出液(氣管、氣囊或鼻竇滲出液等),接種到改良Frey液體培養(yǎng)基中進(jìn)行初步分離培養(yǎng)。待液體培養(yǎng)基顏色從玫瑰紅初變?yōu)辄S色時,用接種環(huán)接種到固體培養(yǎng)板上,待其成長為典型的“煎蛋”狀菌落,挑起單個菌落再次接種到改良Frey液體培養(yǎng)基中并重復(fù)以上過程3次以上即可認(rèn)為得到一株MG純培養(yǎng)物。
將分離純化后的待檢培養(yǎng)液離心,取其沉淀物涂片,用瑞氏-姬姆薩染色液染色后,進(jìn)行鏡檢。
MG的病原分離鑒定是診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但工作量大,耗費時間長,不適合應(yīng)用于生產(chǎn)實踐上的快速診斷和實時監(jiān)測。
平板凝集試驗(SPA)是應(yīng)用最廣泛的檢測方法。其優(yōu)點在于檢測結(jié)果清晰、簡便快速、成本低等,但會出現(xiàn)一些非特異性凝集反應(yīng),假陽性的概率較高。
血凝抑制試驗(HI)檢驗血清中IgG抗體具有特異準(zhǔn)確的特點,可以進(jìn)一步證實SPA的檢測結(jié)果。但HI的靈敏度較差,操作繁瑣,試驗時間較長,并且IgG抗體在病雞感染后3周才能通過HI檢測出陽性,因此HI診斷方法在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用較少。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)與SPA相比,特異性強(qiáng)、結(jié)果易判斷,適合大規(guī)模血清樣品的檢測;與HI相比,敏感性雖然稍低,但特異性強(qiáng)。因此在當(dāng)前推廣規(guī)?;B(yǎng)殖、大批量樣品檢測的情況下,多通過ELISA進(jìn)行檢測。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與血清學(xué)診斷方法相比,靈敏度和特異性較高。
楊美等[8]根據(jù)MG和MS基因的特點設(shè)計合成特異性引物,優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件,建立能夠同時監(jiān)測MG和MS的雙重PCR方法。趙杰等[9]從常用引物中選出靈敏度最高的mgc2基因設(shè)計的引物建立MG套式PCR檢測方法,擴(kuò)增基因片段與GenBank中收錄的相關(guān)序列同源性為98%,并且與大腸桿菌、沙門氏菌、雞滑液囊支原體均無交叉反應(yīng)。周云雷等[10]建立了基于MG中特異性粘附蛋白編碼基因pvpA的實時熒光定量PCR檢測方法。
雞毒支原體滅活疫苗的研制一般采用油乳劑作為佐劑,其具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點,但免疫保護(hù)存在缺陷。研究表明,蛋雞在開產(chǎn)前8周免疫β-丙內(nèi)酯滅活疫苗可以有效緩解雞毒支原體感染引起的產(chǎn)蛋量下降的問題,同時可以降低垂直傳播風(fēng)險;但感染后再免疫,對雞毒支原體垂直傳播沒有抑制作用。
常用的弱毒活疫苗主要有F株、TS-11株和MG6/85株疫苗。F株免疫保護(hù)效力強(qiáng)、時間久,可通過滴眼接種,不影響增重;蛋雞開產(chǎn)前8周提前接種F株疫苗,可以有效減少感染后氣囊損傷和產(chǎn)蛋損失,降低垂直傳播現(xiàn)象;但F株毒力較野毒株弱,仍有一定反強(qiáng)致病風(fēng)險,尤其商品火雞易引起感染。TS-11株和MG6/85株疫苗的毒力相對F株較弱,但對已感染雞的免疫效果不如F株;同時TS-11株和MG6/85株的致病力較弱,分別通過滴眼和噴霧接種未感染雞只,可較好地提供免疫保護(hù),抵抗強(qiáng)毒株攻擊;蛋雞開產(chǎn)前接種TS-11株和MG6/85株疫苗不會影響雞的產(chǎn)蛋量。
鑒于滅活疫苗免疫效果不佳,而活疫苗存在散毒和毒力返強(qiáng)等缺陷,在這樣的背景下,生物技術(shù)苗應(yīng)運(yùn)而生。生物技術(shù)苗包括活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、亞單位疫苗和基因缺失疫苗等。多價疫苗聯(lián)合開發(fā)不僅降低疫苗成本,同時解決了單一雞毒支原體基因載體疫苗免疫原性差等缺陷,具有較大的應(yīng)用前景。
除了接種疫苗,藥物防治也是防控雞毒支原體的有效途徑。雞毒支原體臨床治療主要是抗生素類藥物,例如四環(huán)素、土霉素、泰樂菌素、慶大霉素、達(dá)氟沙星等均對雞毒支原體均有一定治療效果。臨床上使用抗生素進(jìn)行雞毒支原體治療需要進(jìn)行藥敏試驗,選擇敏感性高的抗菌藥,并且避免長時間使用同種抗生素。
由于常用抗菌藥普遍的耐藥性,不利于雞毒支原體的臨床治療,因此,越來越多研究開始關(guān)注中草藥在雞毒支原體治療中的應(yīng)用。黃連、沒藥、桔梗等中草藥由于具有天然、安全、無毒等優(yōu)勢,同時在抗炎和提高免疫力等方面有顯著效果,目前已成為治療和預(yù)防家禽雞毒支原體感染的重要材料。有學(xué)者將虎杖、山藥、三七等中藥復(fù)方提取物應(yīng)用于雞毒支原體治療上,有效緩解了感染后氣囊損傷、減重等臨床癥狀,其治療效果優(yōu)于泰樂菌素。有研究表明,以黃芪、明黨參、麻黃等中藥制成的復(fù)方中藥粉可以減輕雞毒支原體感染導(dǎo)致的氣囊損傷,同時對雞只有促進(jìn)增重的效果。
8.1.1 全進(jìn)全出制
針對MG對外界環(huán)境抵抗力弱的特點,對每批次出欄的雞舍開展清潔、消毒、干燥、空舍等一系列凈化病原措施,可以有效防止新引進(jìn)的雞群感染,為場內(nèi)和雞群MG凈化奠定了基礎(chǔ)。
8.1.2 加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理
養(yǎng)殖場應(yīng)貫徹“養(yǎng)大于防,防大于治”的理念,加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理工作。例如常為雞群提供營養(yǎng)均衡的全價飼料,定期清理料管、料槽中的發(fā)霉飼料;飼養(yǎng)密度合理;夏季防暑,冬季保溫;雞舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生保持整潔,降低舍內(nèi)粉塵和顆粒物含量,對MG病等一些呼吸道疾病的預(yù)防和治療具有一定的輔助作用;定期清理雞舍排泄物以降低NH3濃度,避免因NH3濃度過高導(dǎo)致雞群免疫力下降;控制進(jìn)出雞舍人員數(shù)量,拒絕閑雜人員入舍,做好人員和器械進(jìn)出雞舍的消毒和清潔;在免疫、轉(zhuǎn)群等群體操作前7天,可在飲水中添加復(fù)合維生素等抗應(yīng)激藥物。
8.2.1 合理選址
養(yǎng)殖場選址應(yīng)滿足以下條件:距離動物產(chǎn)品集貿(mào)市場500 m以上;距離動物診療場所200 m以上;養(yǎng)殖小區(qū)之間距離不低于500 m;距離動物無害化處理場所3 000 m以上;距離居民區(qū)等人口集中區(qū)域和主要公路、鐵路等主要交通干道500 m以上。
8.2.2 疫苗免疫
目前,用于MG預(yù)防的疫苗主要分為弱毒苗和滅活苗。養(yǎng)殖場在使用弱毒疫苗進(jìn)行滴眼等方法接種時,免疫時應(yīng)注意疫苗是否均進(jìn)入雞群體內(nèi),接種完成后將疫苗空瓶和所有稀釋并未用完的疫苗應(yīng)進(jìn)行滅活處理,同時消毒和清洗好免疫用具,以免發(fā)生污染和散毒。
8.2.3 疫病凈化
要培育優(yōu)質(zhì)MG凈化雞群,關(guān)鍵在于引種時做好檢疫工作,不從MG疫區(qū)或支原體感染嚴(yán)重的地方引種,從源頭做好疫病凈化工作,保證均為健康雞群。此外,在日常的飼養(yǎng)管理過程中做好嚴(yán)格的生物安全措施,實時監(jiān)測和定期檢查場內(nèi)是否存在陽性雞,并針對陽性雞進(jìn)行淘汰、免疫或用藥等處理。種禽場在種蛋孵化前應(yīng)進(jìn)行MG的專項檢測,并對種蛋進(jìn)行消毒處理,避免支原體通過雞胚代代相傳。
雞毒支原體的預(yù)防和治療至關(guān)重要。結(jié)合當(dāng)前實際,疫苗接種仍是防治雞毒支原體最有效的措施,針對滅活苗和弱毒疫苗現(xiàn)存的免疫局限性,可以考慮兩種疫苗聯(lián)合使用的方法,采取安全有效的接種程序,同時應(yīng)加大對新型生物技術(shù)疫苗的研發(fā)力度,為雞群健康保駕護(hù)航。藥物方面,目前的抗生素耐藥性和藥殘問題普遍存在,臨床上除了要選擇藥敏性強(qiáng)的抗生素,還可以考慮聯(lián)合用藥的方法,如多種抗生素聯(lián)合使用,防止加劇耐藥性,預(yù)防繼發(fā)感染。另一方面,應(yīng)積極尋找替抗產(chǎn)品,逐步減少抗生素的使用,目前中草藥治療雞毒支原體病的研究已取得一定進(jìn)展,可進(jìn)一步推廣應(yīng)用于生產(chǎn)實際。最后,廣大養(yǎng)殖人員要秉持“養(yǎng)大于防,防大于治”的理念,切實提高飼養(yǎng)管理水平,嚴(yán)格落實生物安全防控措施,將雞毒支原體的危害降到最低。