梁小燕，李依民,3，高 靜,3，徐 進(jìn)，顏永剛，張 崗,3*

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，西安 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)省部共建特色秦藥資源研究開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[培育]，陜西咸陽 712083；3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中醫(yī)藥管理局“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 712046；4 鎮(zhèn)巴縣百花谷現(xiàn)代農(nóng)牧開發(fā)有限公司，陜西漢中 723600)

種子萌發(fā)是植物生命周期中一個(gè)脆弱而重要的時(shí)期，直接關(guān)系到幼苗的形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)[1]。環(huán)境脅迫如高鹽、干旱、水澇或缺氧等非生物脅迫抑制種子萌發(fā)，限制作物生產(chǎn)[2]。高鹽是最為常見的一種脅迫，其通過降低土壤水勢(shì)抑制種子萌發(fā)，從而削弱種子吸收水分的能力以抑制種子吸脹和胚的生長(zhǎng)[3]。但是，鹽脅迫抑制種子萌發(fā)的內(nèi)在機(jī)制極其復(fù)雜。

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種重要的植物激素，可以通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)參與植物對(duì)逆境的響應(yīng)過程[4]。SA通過提高葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，降低細(xì)胞膜脂過氧化作用來有效提高植物的抗鹽性[5]。外源施用一定濃度的水楊酸可提高多種植物的耐鹽性，常包括拌種和浸種兩種方式[6-7]。0.08 mmol/L SA拌種顯著提高二色補(bǔ)血草種子在200 mmol/L NaCl條件下的萌發(fā)率以及部分酶活性和內(nèi)源激素含量[6]。0.1、0.2與0.4 mmol/L SA浸種使鹽脅迫下的水飛薊種子具有較高萌發(fā)指數(shù)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)[7]。SA浸種能促進(jìn)重度 NaCl 脅迫下膜莢黃芪和蒙古黃芪種子的最終發(fā)芽率[8]。

中國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材大黃在2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定為蓼科大黃屬(Rheum)多年生高大草本掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(R.tanguticumMaxim. ex Balf.)或藥用大黃(R.officinaleBaill.)的干燥根及根莖，味苦、性寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效，用于實(shí)熱積滯、血熱吐衄、目赤咽腫等癥[9]。大黃主要含有蒽醌類、蒽酮類、黃酮類、鞣質(zhì)類等多種有效成分[10]，具有瀉下、抗炎和止血等藥理活性[11]。大黃主要分布在亞溫帶及亞熱帶的高寒山區(qū)，其道地產(chǎn)區(qū)為中國(guó)甘肅、青海、四川、陜西等高海拔地區(qū)[11]。大黃喜光照、耐嚴(yán)寒，不適宜在溫度較高或潮濕的地方生長(zhǎng)，且野生資源有限，現(xiàn)多為栽培品[12]。氣候環(huán)境的不斷惡化以及人類活動(dòng)的影響使土壤鹽漬化程度在全球范圍內(nèi)不斷加劇，嚴(yán)重影響植物的形態(tài)建成與生態(tài)分布[13]，勢(shì)必影響大黃的栽培和生長(zhǎng)。目前，大黃研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、種質(zhì)資源及次生代謝調(diào)控等方面[14]，而對(duì)其耐鹽特性研究報(bào)道較少。因此，本研究考察了SA拌種和浸種兩種方式對(duì)鹽脅迫下3種大黃種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，旨在為大黃在鹽脅迫下的栽培提供一定理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用3種大黃種子由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為掌葉大黃(R.palmatumL.)、唐古特大黃(R.tanguticumMaxim.ex Balf.)和藥用大黃(R.officinaleBaill.)的干燥成熟種子，分別產(chǎn)自甘肅省和政縣(2019年8月)、甘肅省湟中縣(2019年9月)、陜西省鎮(zhèn)巴縣(2020年8月)。SA購(gòu)自上海源葉生物公司，NaCl為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)處理

選擇大小均勻、飽滿的3種大黃種子，分別置于蒸餾水中浸泡24 h后，按照黑小斌等[15]建立的方法進(jìn)行大黃種子消毒處理，用無菌蒸餾水沖洗3～4次后待用。

試驗(yàn)使用NaCl模擬鹽脅迫。將NaCl配制成0(CK)、100、150、200、250 mmol/L 5個(gè)濃度梯度溶液進(jìn)行鹽脅迫下3種大黃種子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)掌葉大黃、唐古特大黃種子萌發(fā)均在250 mmol/L NaCl下受到明顯抑制，藥用大黃種子萌發(fā)在150 mmol/L NaCl脅迫下受到顯著抑制，所以掌葉大黃、唐古特大黃選擇200 mmol/L NaCl濃度藥用大黃選用100 mmol/L NaCl濃度配合外源水楊酸進(jìn)行拌種和浸種實(shí)驗(yàn)。

通過預(yù)試驗(yàn)以及查閱文獻(xiàn)后將SA處理濃度設(shè)定為50、100、150、200和250 mg/L。SA施用方式為拌種和浸種兩種[8]。拌種的具體方法是：將SA與NaCl配制成符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度的溶液，加入種子發(fā)芽床，使SA始終貫穿整個(gè)處理過程。浸種的具體方法是：將大黃種子浸泡于SA溶液24 h后，用蒸餾水沖洗至凈后置入發(fā)芽床，此后種子不再與SA接觸。試驗(yàn)在墊有3層濾紙的150 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行，每個(gè)培養(yǎng)皿中100粒種子，重復(fù)3次。所有材料在(20±2)℃、12 /12 h光照/黑暗、光照強(qiáng)度15 000 Lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天加入適量相應(yīng)濃度溶液以保持濾紙濕潤(rùn)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)每天記錄種子的發(fā)芽個(gè)數(shù)，連續(xù)觀察10 d。第5 天計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)；第10 天計(jì)算種子發(fā)芽率和相對(duì)NaCl傷害率。

累積發(fā)芽率(%)=10 d內(nèi)萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=5 d內(nèi)萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

1.3.2 幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第10 天時(shí)，從每處理組各重復(fù)組中任意取10株幼苗測(cè)量其子葉、胚軸、根及苗長(zhǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析，SPSS 24.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行處理和差異顯著性檢驗(yàn)(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)大黃種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

首先，隨著NaCl濃度的增大，3種大黃種子的每日累計(jì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)(5 d的累計(jì)發(fā)芽率)整體均呈下降趨勢(shì)(圖1)。其中，掌葉大黃種子每日累計(jì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在100 mmol/L NaCl濃度下與對(duì)照(CK)無顯著差異(P> 0.05)，在NaCl濃度大于等于150 mmol/L時(shí)均比CK顯著下降(P<0.05)；唐古特大黃種子每日累積發(fā)芽率在100 mmol/L NaCl濃度下與CK相差無幾，在NaCl濃度大于等于150 mmol/L時(shí)比CK顯著下降，其發(fā)芽勢(shì)在NaCl濃度大于等于150 mmol/L時(shí)顯著下降；藥用大黃種子每日累積發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均在NaCl濃度大于等于100 mmol/L時(shí)比CK顯著下降，在250 mmol/L NaCl脅迫條件下發(fā)芽率極低?？梢姡?種大黃種子發(fā)芽率均隨NaCl濃度增大顯著下降。

圖1 不同濃度NaCl脅迫下大黃種子累積發(fā)芽率的變化Fig.1 The cumulative germination rate of rhubarb seeds under different NaCl concentrations

其次，隨著NaCl脅迫濃度的增加，3種大黃幼苗的子葉、胚軸、根系和苗的長(zhǎng)度均逐漸降低，幼苗生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重抑制，且?guī)缀跛兄笜?biāo)降低幅度均在 100 mmol/L NaCl 脅迫時(shí)就達(dá)到顯著水平(圖2)。其中，掌葉大黃和藥用大黃幼苗的子葉長(zhǎng)在100 mmol/L NaCl脅迫時(shí)就比相應(yīng)CK顯著降低(P<0.05)，而唐古特大黃幼苗的子葉在150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)才受到顯著抑制(圖2，A)；掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃幼苗的胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)均在100 mmol/L NaCl脅迫時(shí)就比相應(yīng)CK顯著降低(圖2，B～D)。以上結(jié)果說明3種大黃幼苗的生長(zhǎng)大多在100 mmol/L NaCl脅迫下受到顯著抑制。

與CK相比，掌葉大黃幼苗的子葉長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)受到的抑制作用大體上隨鹽濃度的增大而遞增(P<0.05)，且胚軸、根和苗在NaCl濃度大于等于 100 mmol/L 時(shí)受到顯著抑制。唐古特大黃幼苗的子葉在NaCl大于100 mmol/L 時(shí)受到顯著抑制，其根和苗在NaCl大于等于100 mmol/L 時(shí)受到顯著抑制。隨著NaCl濃度的增大，藥用大黃幼苗的子葉、胚軸、根及苗受到的抑制作用整體呈遞增狀態(tài)。

同一物種內(nèi)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)5%水平圖2 不同濃度NaCl脅迫下大黃幼苗子葉(A)、胚軸(B)、根(C)和苗(D)生長(zhǎng)的變化Different lower-case letters within same species indicate statistically significant difference among treatments at 0.05 level (P<0.05)Fig.2 The growth of cotyledons (A), hypocotyl (B), roots (C) and seedlings (D) of rhubarb seedlings under different NaCl concentrations

2.2 水楊酸拌種對(duì)NaCl脅迫下大黃種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.2.1 種子萌發(fā)指標(biāo)表1顯示，在S200或S100處理下，掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著低于空白對(duì)照(CK)，且發(fā)芽勢(shì)的降幅(61.74%～88.65%)遠(yuǎn)大于發(fā)芽率降幅(21.23%～29.62%)。與S200處理相比，掌葉大黃種子發(fā)芽率在50 mg/L SA拌種處理下顯著提高(P<0.05)，在200和250 mg/L SA處理后顯著降低，而其發(fā)芽勢(shì)仍僅在50 mg/L SA處理顯著增加，在250 mg/L SA處理后顯著降低。與S200處理相比，唐古特大黃種子發(fā)芽率僅在250 mg/L SA處理時(shí)顯著降低，其發(fā)芽勢(shì)在各濃度SA拌種處理后均無顯著變化。與S100處理相比，藥用大黃種子發(fā)芽率僅在150和250 mg/L SA拌種處理后顯著降低，而其發(fā)芽勢(shì)僅在200 mg/L SA拌種后顯著降低，而其他濃度SA處理后發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均無顯著變化?？梢?，鹽脅迫下掌葉大黃種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在50 mg/L SA拌種后均能得到顯著促進(jìn)，而在250 mg/L SA拌種后均受到顯著抑制；而鹽脅迫下唐古特大黃和藥用大黃種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在各濃度SA拌種后均無顯著促進(jìn)效應(yīng)，其發(fā)芽率在250 mg/L SA拌種處理后均受到顯著抑制。

2.2.2 幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)從表1可知，掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃種子的生長(zhǎng)指標(biāo)子葉長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)在S200或S100處理下均顯著低于相應(yīng)CK(P<0.05)，它們的子葉長(zhǎng)在各濃度SA拌種處理下均與S200或S100處理無顯著差異(P> 0.05)。與S200處理相比，掌葉大黃胚軸長(zhǎng)僅在50和250 mg/L SA拌種處理后顯著降低，根長(zhǎng)在50、150和200 mg/L SA處理后顯著增加，苗長(zhǎng)僅在200 mg/L SA處理下顯著增加，其余濃度SA拌種處理后胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)均無顯著變化；與S200處理相比，唐古特大黃胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)在50～200 mg/L SA處理后均無顯著差異，而均在250 mg/L SA處理后顯著降低；與S100處理相比，藥用大黃胚軸長(zhǎng)僅在50 mg/L SA處理后顯著增加，苗長(zhǎng)僅在200和250 mg/L SA拌種處理后顯著降低，其余濃度SA處理胚軸長(zhǎng)和苗長(zhǎng)均無顯著變化，而其根長(zhǎng)在各濃度SA處理下均與S100處理無顯著差異。

2.3 水楊酸浸種對(duì)NaCl脅迫下大黃種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在S200或者S100處理下均比相應(yīng)CK顯著降低，且發(fā)芽勢(shì)降低的幅度遠(yuǎn)大于發(fā)芽率。與S200處理相比，掌葉大黃的發(fā)芽率在50和200 mg/L SA浸種處理下，在其余濃度SA浸種處理后無顯著變化，而其發(fā)芽勢(shì)在各濃度SA浸種處理后均顯著增加(表2)；與S200處理相比，唐古特大黃種子發(fā)芽率各濃度SA浸種處理后均無顯著差異(P> 0.05)，發(fā)芽勢(shì)在50～200 mg/L SA浸種均得到顯著促進(jìn)(P<0.05)；與S100處理相比，藥用大黃發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在50～250 mg/L SA浸種處理后與對(duì)照均無顯著變化?？梢?，適宜濃度的SA浸種對(duì)200 mmol/L NaCl鹽脅迫下的掌葉大黃發(fā)芽率以及掌葉大黃、唐古特大黃的發(fā)芽勢(shì)有顯著的促進(jìn)效應(yīng)，但種間存在差異。

2.3.2 幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)表2顯示，掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃的子葉長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)在S200或S100處理下也均顯著低于相應(yīng)CK(P<0.05)。與S200或S100處理相比，3種大黃的子葉長(zhǎng)在各濃度SA浸種處理下均無顯著變化(P> 0.05)，三者的胚軸長(zhǎng)除掌葉大黃在150 mg/L SA浸種處理后顯著降低外也均無顯著變化；掌葉大黃根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)均在50、200和250 mg/L SA浸種處理下比S200處理顯著增加，唐古特大黃和藥用大黃根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)均在50 mg/L SA浸種處理下比S200或S100處理顯著增加，其余濃度下大黃根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)與S200或S100相比無顯著差異?？梢?，鹽脅迫下各種大黃的子葉長(zhǎng)和胚軸長(zhǎng)受SA浸種的影響較小，而其根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)生長(zhǎng)在適宜濃度的SA浸種受到顯著促進(jìn)，尤其是50 mg/L SA浸種對(duì)各大黃普遍表現(xiàn)出顯著促進(jìn)效應(yīng)。

表2 SA浸種對(duì) NaCl脅迫下大黃種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

3 討 論

鹽脅迫是影響植物種子萌發(fā)的重要環(huán)境因子[16]。生長(zhǎng)特性是植物對(duì)鹽脅迫的綜合反應(yīng)，也是植物抗鹽性的最優(yōu)評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]。大量研究表明，鹽脅迫顯著抑制了植物種子的萌發(fā)[18]、萌芽幼苗的大小和胚根的長(zhǎng)度[19]。本研究結(jié)果表明，隨著鹽濃度的增大，3種大黃種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)整體呈下降趨勢(shì)，且它們所受鹽相對(duì)傷害率隨鹽濃度增大依次遞增，并以藥用大黃的相對(duì)傷害率變化速率最大；同時(shí)，鹽脅迫也顯著抑制了3種大黃幼苗的子葉、胚軸、根和苗的生長(zhǎng)，此結(jié)果與黃芪[8]、百日草[20]和甘草[21]等的相關(guān)研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，50、100、150 mg/L SA浸種均促進(jìn)了鹽脅迫下掌葉大黃種子發(fā)芽勢(shì)，但僅有50 mg/L SA浸種處理最終提高了掌葉大黃種子發(fā)芽率；200 mg/L SA浸種促進(jìn)鹽脅迫下唐古特大黃種子的發(fā)芽勢(shì)，而250 mg/L SA拌種卻抑制了鹽脅迫下唐古特大黃種子的發(fā)芽率；200 mg/L SA拌種抑制了鹽脅迫下藥用大黃種子發(fā)芽勢(shì)，而150 mg/L SA拌種抑制了其鹽脅迫下的發(fā)芽率。水楊酸浸種促進(jìn)掌葉大黃、唐古特大黃種子發(fā)芽，有可能是浸種能使種子在獲取SA的同時(shí)通過吸脹作用獲得水分來支持脅迫下種子的萌發(fā)，而拌種處理使種子一直都存在于SA溶液中，SA脅迫產(chǎn)生的抑制作用遠(yuǎn)大于其補(bǔ)償作用[8]。

同時(shí)，200 mg/L水楊酸拌種也促進(jìn)了掌葉大黃苗長(zhǎng)，這與60 mg/L水楊酸噴施處理促進(jìn)NaCl脅迫下喜樹幼苗生長(zhǎng)[22]類似；250 mg/L SA浸種促進(jìn)了掌葉大黃幼苗在鹽脅迫下根和苗的生長(zhǎng)。50 mg/L SA浸種促進(jìn)鹽脅迫下唐古特幼苗根和苗的生長(zhǎng)，其余濃度下根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)與單獨(dú)鹽脅迫相比無顯著差異，說明唐古特幼苗對(duì)SA的響應(yīng)存在濃度效應(yīng)。50 mg/L SA拌種促進(jìn)了鹽脅迫下藥用大黃胚軸生長(zhǎng)，而250 mg/L SA拌種抑制了鹽脅迫下藥用大黃的苗長(zhǎng)，100 mg/L SA浸種均促進(jìn)鹽脅迫下藥用大黃根和苗的生長(zhǎng)，而100 mg/L SA加重了鹽脅迫下鳳仙花種子的傷害[23],這可能與SA的施用方式以及不同植物對(duì)SA的響應(yīng)差異有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，藥用大黃種子及幼苗受鹽脅迫以及水楊酸的影響程度明顯大于掌葉大黃和唐古特大黃種子或幼苗。掌葉大黃和唐古特大黃通常分布海拔高于藥用大黃，生境條件更為苛刻，因此前兩者可能對(duì)環(huán)境脅迫表現(xiàn)出比藥用大黃更高的耐受性。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致活性氧等有害物質(zhì)大量生成，以及細(xì)胞膜脂過氧化程度加劇和電解質(zhì)泄漏等不良生理反應(yīng)，但植物可通過滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)進(jìn)行抗氧化防御，清除活性氧物質(zhì)，防止細(xì)胞過度失水，保持生物膜的完整性[24]。SA可降低植物膜的滲透性，提高植物抗氧化酶和非酶類抗氧化系統(tǒng)的活性，減少活性氧數(shù)量和緩解細(xì)胞的損傷程度[25-26]。但本研究還未測(cè)得SA是否提高了3種大黃幼苗中抗氧化酶活性以及所含抗氧化物質(zhì)含量的差異，關(guān)于外源SA增強(qiáng)3種大黃種子及幼苗的耐鹽脅迫機(jī)制尚不清楚，后續(xù)還需要更進(jìn)一步的深入研究。