王璐，李洋，杜伯濤

2017年歐洲人類生殖與胚胎學會（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）將反復妊娠丟失（recurrent pregnancy loss，RPL）定義為連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的妊娠丟失[1]。作為妊娠早期并發(fā)癥，RPL發(fā)生率約為1%～5%，而連續(xù)3次及3次以上的RPL患者再次妊娠后胚胎丟失率為40%～80%。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，母胎界面免疫環(huán)境異?？赡苁菍е氯焉飦G失的重要原因。其中，蛻膜自然殺傷（decidual natural killer，dNK）細胞作為妊娠早期母胎界面最豐富的免疫細胞群，在RPL中的作用和治療價值引起了廣泛關注?，F(xiàn)就dNK細胞在RPL中可能的作用機制及相關治療的研究進展綜述如下。

1 dNK細胞在正常妊娠中的生理和作用

1.1 dNK細胞的來源母胎界面由滋養(yǎng)層細胞、蛻膜基質(zhì)細胞、免疫細胞以及來源于這些細胞的可溶性因子等構(gòu)成[2]。其中dNK細胞約占母胎界面免疫細胞的70%，是妊娠早期最重要的免疫細胞[3]。關于dNK細胞的前體細胞及其具體分化過程仍無統(tǒng)一定論，目前主要存在以下3種觀點：外周血募集、造血祖細胞分化和外周血CD16+NK（CD16+peripheral natural killer，CD16+pNK）細胞轉(zhuǎn)化。2008年Carlino等[4]證實CD16-pNK細胞與蛻膜基質(zhì)細胞相互作用時，可表達高強度的CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）。CXCR4通過與CXC趨化因子配體12（CXCL12）結(jié)合被招募到蛻膜。隨后，研究發(fā)現(xiàn)存在于蛻膜中的CD34、CD122和CD127造血前體在體外與蛻膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)時可分化為dNK細胞[5]。此外，CD16+pNK細胞在轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和（或）其他因素的影響下遷移到子宮組織中，并局部分化獲得dNK細胞表型[6]。

1.2 dNK細胞的獨特表型和表面標志物pNK細胞根據(jù)CD56表達的不同可分CD56dimCD16-表型（占90%）和CD56brightCD16-表型（占10%）。與pNK細胞不同，dNK細胞表達CD56+/brightCD16-和CD56+/dimCD16+。在表面標志物方面，dNK細胞除可表達許多典型的NK細胞標志物（NKG2A、NKG2D和NKp46）外，還可表達組織駐留的標志物（CD49a、CD69和CD94）。這種獨特的表型和標志物構(gòu)成了dNK細胞分布和生物學功能的基礎。

1.3 dNK細胞的作用

1.3.1 子宮螺旋動脈重塑 為了滿足母胎界面穩(wěn)定和胎兒的生長需要，絨毛外滋養(yǎng)細胞（extravillous trophoblasts，EVT）重塑子宮螺旋動脈。在重塑過程的最早期，內(nèi)皮細胞空泡化，個別血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）腫脹[7]。dNK細胞分泌趨化因子促使大量免疫細胞與蛻膜細胞聚集到螺旋動脈周圍，如γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）可能通過母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）途徑介導VSMC的初始破壞，促進血管壁變薄、管腔擴張及血管阻力減小[8]。隨著重塑過程的推進，dNK細胞和EVT誘導的細胞外基質(zhì)的破壞介導子宮螺旋動脈重塑過程中血管平滑肌層的破壞和丟失，最終重塑動脈的VSMC發(fā)生凋亡。

1.3.2 參與母胎界面免疫耐受 第一，dNK細胞能夠識別來源于母系和父系的異種人類白細胞抗原（human leucocyte antigen-C，HLA-C）入侵EVT，并刺激分泌IFN-γ，提高CD14+dNK細胞表達吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase1，IDO）[9]。IDO是降解色氨酸的關鍵酶，其介導的色氨酸分解代謝產(chǎn)物L-kynurenine可以促使CD56brightpNK細胞向低毒性的dNK細胞轉(zhuǎn)化，從而為建立母胎界面免疫耐受提供了良好的免疫環(huán)境。第二，在妊娠早期，蛻膜巨噬細胞分泌白細胞介素15（interleukin-15，IL-15）激活dNK細胞，使其與蛻膜巨噬細胞協(xié)同抑制T細胞活化和妊娠早期免疫反應[10]。第三，CD16+dNK細胞亞群通過分泌IL-10選擇性抑制IL-2、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IFN-γ和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）等細胞因子的合成[11]，從而抑制母體對同種異體抗原的免疫反應，參與母胎界面免疫耐受的調(diào)節(jié)。

1.3.3 對滋養(yǎng)細胞侵襲起雙向調(diào)節(jié)作用 一方面，滋養(yǎng)細胞表達的HLA-C、HLA-E和HLA-G可與dNK細胞抑制性受體（LILRB1、KIR2DL4和CD94/NKG2A）相互作用，促進滋養(yǎng)細胞侵襲。dNK細胞還可以通過產(chǎn)生趨化因子與滋養(yǎng)細胞相應表面受體結(jié)合，如IL-8與CXCR1、IL-10與CXCR3，以達到促進滋養(yǎng)細胞侵襲的作用。另一方面，已有研究證實血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）和VEGF-C分別與受體血管內(nèi)皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR-1）和VEGFR-3結(jié)合后可抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲[12]。dNK細胞通過控制EVT侵襲深度、維持EVT侵襲的穩(wěn)定，保護母胎界面免疫微環(huán)境。

1.3.4 記憶功能 與初次妊娠女性相比，在多次妊娠女性蛻膜中觀察到更深更早的血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞浸潤，提示dNK細胞在多次妊娠中胎兒、胎盤的有效發(fā)育存在“訓練”或“記憶”免疫[13]。研究者在多次妊娠婦女蛻膜組織中發(fā)現(xiàn)了以NKG2C和LILRB1高表達為特征的蛻膜“記憶”NK細胞，稱之為PTdNKs細胞。其中，NKG2C與HLA-E、LILRB1與HLA-G相結(jié)合在IL-5的介導下可誘導分泌更多的IFN-γ和VEGF-A[14]。PTdNKs細胞的記憶功能代表了一種特殊類型的先天記憶，且已被證明是對外界環(huán)境或病毒感染的反應，以及對細胞因子誘發(fā)的記憶。

2 dNK細胞在RPL中的病理和作用

基于dNK細胞在妊娠早期母胎界面免疫微環(huán)境中獨特的生理作用，其在相關病理妊娠尤其是RPL中的影響引起了廣泛關注。

2.1 亞群和表型的改變2020年El-Badawy等[15]通過刮宮收集蛻膜標本，發(fā)現(xiàn)RPL患者CD56dimdNK細胞的百分比顯著高于CD56brightdNK細胞。在不同的CD56dim亞群中，CD56dimCD16-dNK細胞是主要亞群，其次是CD56dimCD16dim和CD56dimCD16brightdNK細胞。而且這些CD56dim亞群的數(shù)量與既往妊娠丟失時間相關：當CD56dimCD16-亞群數(shù)量增加、CD56dimCD16dim亞群數(shù)量減少，既往早期妊娠丟失數(shù)量增加；當CD56dimCD16dim亞群數(shù)量增加、CD56dimCD16-亞群數(shù)量減少，既往晚期妊娠丟失數(shù)量增加。研究推測，這種相關性可能是因為反復早期妊娠丟失的患者中，高細胞毒性CD56dimCD16brightdNK細胞過度激活，通過基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）介導CD16的表達丟失，導致CD56dimCD16-dNK細胞增加、CD56dimCD16dimdNK細胞減少。而反復晚期妊娠丟失的婦女中，CD56dimCD16bright的dNK細胞毒性較低，CD16丟失較少，從而CD56dimCD16dimdNK細胞增多、CD56dimCD16-dNK細胞減少。因此，CD16表達的丟失可能與妊娠持續(xù)時間相關，CD16丟失越多妊娠持續(xù)時間越短。

2.2 受體表達和細胞活性的改變既往研究指出，與健康人群相比，RPL患者的dNK細胞受體表達水平發(fā)生改變，影響dNK細胞的活性，從而導致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。第一，RPL患者dNK細胞高表達CD161+。CD161+的高表達可增加NK細胞分化過程中對促炎細胞因子IL-12和IL-18的反應，并在刺激后使NKp30、CD160、CD25（部分高親和力的IL－2受體）和CD69產(chǎn)生增多[16]，進而增強dNK細胞活性。但與上述研究結(jié)果相反的是，另一項研究發(fā)現(xiàn)RPL患者dNK細胞中CD161水平低于正常妊娠女性。在妊娠早期，滋養(yǎng)細胞可通過CLEC2D（NK細胞受體CLR的編碼基因）與dNK細胞的CD161相互作用，抑制dNK細胞的細胞毒性，促進母胎界面免疫耐受的建立。RPL患者CD161表達水平下降可導致dNK細胞毒性增強[17]，從而導致RPL的發(fā)生。第二，KIR可分為激活性和抑制性受體。在RPL患者中發(fā)現(xiàn)，dNK細胞表達的激活性受體KIR2DL4增多，抑制性受體KIR2DL1降低[18]。說明激活性與抑制性受體比例失衡可過度激活dNK細胞的活性，使妊娠所需母胎界面免疫環(huán)境失衡。第三，在RPL患者的蛻膜組織中觀察到NKG2D的表達水平明顯升高[19]。推測可能是RPL患者的dNK細胞在與激活性受體NKG2D相結(jié)合的作用下，激活性信號過度傳導，刺激dNK細胞異常激活，活性顯著增加的dNK細胞可殺傷自身其他細胞甚至胚胎，引發(fā)RPL。此外，2018年的一項研究發(fā)現(xiàn)RPL患者dNK細胞受體ILT-2、ILT-4 的mRNA水平明顯低于正常妊娠女性、ILT-2分布密度低于正常妊娠女性、ILT-4在蛻膜局部表達水平低下[20]。ILT-2與HLA-G結(jié)合后促進dNK細胞分泌炎性因子和血管生成因子，受體ILT-4多表達于免疫細胞表面。這說明dNK細胞受體ILT-2和ILT-4能夠直接或間接影響dNK細胞功能，其水平低可導致妊娠早期母胎界面免疫環(huán)境紊亂，影響妊娠結(jié)局。

2.3 細胞毒性和功能的改變Li等[21]發(fā)現(xiàn)RPL患者的dNK細胞CD49a水平較低，穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ表達水平較高。CD49a可抑制dNK細胞早期黏附和向滋養(yǎng)細胞遷移，并通過下調(diào)穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ的表達來限制細胞毒性。這表明RPL患者中dNK細胞的細胞毒性高于健康人群，高毒性的dNK細胞的正常血管生成功能減弱，促炎功能增強，滋養(yǎng)細胞的耐受能力明顯降低，這破壞了母胎界面免疫微環(huán)境的穩(wěn)定，導致RPL的發(fā)生。另外，當dNK細胞分泌細胞因子數(shù)量發(fā)生改變，會影響dNK細胞的促滋養(yǎng)細胞侵襲和血管重塑功能。一項研究通過檢測細胞因子分泌譜發(fā)現(xiàn)，RPL患者蛻膜組織的IL-8和IP-10水平高于正常妊娠的對照組，而VEGF水平低于對照組[22]。接著Transwell實驗證實RPL患者dNK細胞與轉(zhuǎn)染微小RNA（miR－133a）模擬物在滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo共培養(yǎng)時誘導HLA-G表達降低，dNK細胞與KIR2DL4結(jié)合時的分泌能力下降，細胞因子的減少可能會影響滋養(yǎng)細胞的侵襲和子宮螺旋動脈重塑。這為RPL致病機制的研究提供了新思路。

綜上，dNK細胞亞群、受體表達水平及細胞功能異常之間可互相影響、互為因果，最終可能導致RPL的發(fā)生，這就為此類RPL的治療提供了新的治療靶點。

3 dNK細胞相關的RPL治療研究進展

3.1 丙種免疫球蛋白與脂肪乳靜脈滴注丙種免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin G，IVIG）是一種被動免疫治療，通過調(diào)節(jié)免疫細胞功能最終改善免疫異常RPL患者的妊娠結(jié)局。IVIG主要影響輔助性T細胞1（helper T cell 1，Th1）/Th2細胞比值，促使平衡由Th1細胞向Th2細胞轉(zhuǎn)變，上調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg細胞）水平，進而發(fā)揮免疫保護的作用。研究發(fā)現(xiàn)IVIG還可以通過增加NK細胞抑制性受體表達，抑制NK細胞的溶解活性，減少NK細胞數(shù)量并降低其細胞毒性，進而改善RPL患者的妊娠結(jié)局[23]。但IVIG在臨床應用中不良反應較多且價格較貴。近年來，靜脈滴注脂肪乳成為IVIG的一種替代方案。Lédée等[24]研究將IL-15/成纖維細胞生長誘導因子14（fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n-14）比值作為dNK細胞活化的標志，高IL-15/Fn-14比值提示IL-15過度激活dNK細胞；將IL-18/腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導劑（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）比值作為Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)平衡的生物標志，IL-18/TWEAK比值越高，提示局部Th1越多。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過脂肪乳治療后RPL患者IL-15/Fn-14和IL-18/TWEAK比值顯著下降，CD56+dNK細胞的動員減少，在妊娠初期過度活化的dNK細胞的比例也趨于正常。說明脂肪乳通過減少dNK細胞募集和下調(diào)Th1促炎細胞因子抑制dNK細胞的過度活化，調(diào)節(jié)dNK細胞功能并促進滋養(yǎng)細胞侵襲，平衡母胎界面的免疫耐受。

3.2 粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）G-CSF是一種由免疫細胞分泌的細胞因子。多項研究發(fā)現(xiàn)G-CSF受體可存在于胎盤、細胞滋養(yǎng)層細胞、合體滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質(zhì)細胞等母胎界面的細胞。G-CSF通過募集dNK細胞下調(diào)IFN-γ和IL-18等細胞因子的產(chǎn)生，降低dNK細胞的毒性，誘導母胎界面免疫耐受[25]?，F(xiàn)臨床上G-CSF的給藥方式分皮下注射和宮腔灌注2種，宮腔灌注多用于慢性薄型子宮內(nèi)膜患者，而RPL患者多選皮下注射。Kamath等[26]分析了13項研究共1 050例接受體外受精-胚胎移植患者，其中522例給予皮下注射G-CSF治療，528例給予安慰劑或不接受額外治療，結(jié)果表明在2次或2次以上移植失敗的患者中，皮下注射G-CSF可提高臨床妊娠率，降低流產(chǎn)率。但該研究沒有關于活產(chǎn)率的報告，并且數(shù)據(jù)有限存在偏倚風險，有待大量研究進一步證明G-CSF的確切效果。

3.3 糖皮質(zhì)激素不同糖皮質(zhì)激素對NK細胞的作用存在差異。地塞米松可增強由IL-2和IL-12刺激的dNK細胞增殖，提高CD16+dNK細胞占比，CD94/NKG2A的表達水平增加，改善dNK細胞的線粒體功能，增強dNK細胞活性。強的松通過減少dNK細胞數(shù)量、下調(diào)細胞因子的產(chǎn)生，減少dNK細胞的募集。一項針對強的松治療不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者的Meta分析表明，與安慰劑相比，強的松能顯著提高不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，有效降低流產(chǎn)率[27]。但仍有研究認為強的松治療并不能改善反復移植失敗患者的妊娠結(jié)局，關于強的松具體作用仍需進一步的研究證明。

3.4 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）MSC是一種多源性有多向分化潛能的基質(zhì)細胞，多用于自身免疫性相關疾病的治療。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)MSC可以通過細胞間相互作用和分泌多種細胞因子，抑制NK細胞、T細胞等免疫細胞的活性，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Rezaei Kahmini等[28]對有流產(chǎn)傾向小鼠在妊娠第4天或第5天腹腔注射脂肪來源的MSC，然后分離孕鼠蛻膜細胞，分析dNK細胞不同亞群的比例以及IL-10、IL-4和IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，治療前有流產(chǎn)傾向小鼠CD49bright+dNK細胞比例增加，IFN-γ的水平明顯高于正常妊娠小鼠，而IL-4和IL-10水平無明顯差異。經(jīng)MSC治療后流產(chǎn)傾向小鼠CD49bright+dNK細胞群減少，IFN-γ的表達水平降低，IL-4和IL-10的表達水平升高。提示MSC可以通過改變dNK細胞的不同亞群比例及其細胞因子水平，調(diào)節(jié)Th1和Th2型細胞因子的平衡，維持母胎界面的免疫微環(huán)境穩(wěn)定。但文獻中并未提及有流產(chǎn)傾向小鼠模型的妊娠結(jié)局，還需大量研究進一步證實并評估其安全性。

3.5 枸櫞酸西地那非（sildenafil citrate，SC）SC可通過抑制環(huán)磷酸鳥苷（cyclicguanosine monophosphate，cGMP）的降解增強一氧化氮的血管擴張作用，增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮血流灌注，臨床上多用于因薄型子宮內(nèi)膜而導致妊娠失敗的患者。目前還發(fā)現(xiàn)SC能通過產(chǎn)生細胞因子和改變Treg細胞的比例來降低NK細胞活性。Kniotek等[29]研究發(fā)現(xiàn)，健康女性月經(jīng)周期第16～25天的外周血單核細胞經(jīng)SC處理后，TGF-β和IL-10的水平顯著升高，IL-12的水平顯著降低。IL-12是Th1形成和增殖過程中重要的細胞因子，通過增強有細胞毒性的細胞因子分泌促進NK細胞活化，增強NK細胞的殺傷毒性。TGF-β具有較強的抗炎作用，可協(xié)同IL-10降低NK細胞活性。因此，SC可以通過提高抗炎細胞因子、降低炎性細胞因子分泌水平，進而降低NK細胞活性。該團隊另一項研究將24例健康女性和23例RPL女性的pNK細胞轉(zhuǎn)化為誘導蛻膜NK（idNK）細胞（與dNK表型及功能相似），經(jīng)SC處理后觀察idNK細胞抑制性受體和細胞因子表達的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康女性idNK細胞相比，RPL患者idNK細胞中KIR2DL1表達降低[30]。說明SC可降低RPL患者抑制性受體KIR2DL1表達，減弱idNK細胞毒性。但目前關于SC是否影響dNK或idNK細胞功能及其受體的研究較少，還需要更多的數(shù)據(jù)證實。

3.6 西羅莫司（Sirolimus）西羅莫司是一種哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian rapamycin target protein，mTOR）抑制劑，通過抑制IL-4和IL-2分泌阻止B細胞和T細胞的增殖，同時還可促進CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的生成，抑制外周血中Th17細胞的分化。Ahmadi等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與不接受西羅莫司治療的反復種植失敗患者相比，接受西羅莫司治療的反復種植失敗患者行體外受精-胚胎移植后的妊娠率和活產(chǎn)率提高。此外，西羅莫司還是一種自噬誘導劑。滋養(yǎng)細胞自噬可抑制胰島素樣生長因子2（insulinlike growth factor-2，IGF-2）的分泌，進一步抑制dNK細胞分化[32]。因此，西羅莫司能通過誘導滋養(yǎng)細胞自噬和抑制免疫反應降低dNK細胞的活性及毒性，對滋養(yǎng)細胞自噬水平低的免疫性流產(chǎn)有一定的治療價值。

4 結(jié)語與展望

目前仍未找到RPL的特異性病因和特效的治療方案，但免疫因素與大多數(shù)的妊娠失敗密不可分。dNK細胞作為早期妊娠母胎界面中數(shù)量最多的免疫細胞，可通過分泌多種細胞因子及細胞間的相互作用，參與母胎界面免疫耐受的建立，重塑子宮螺旋動脈，促進滋養(yǎng)細胞侵襲，維持妊娠的穩(wěn)定。當dNK細胞的數(shù)量過度增加，活性和毒性提高導致功能異常，破壞了母胎界面的免疫微環(huán)境，可導致RPL。但dNK細胞通過哪些信號通路和受體引起數(shù)量及功能的改變，仍有待進一步研究的證實，以期為RPL的機制研究和精準治療提供新的方向。