高景悅，于璇，臧朝雯，鄧曉惠

單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells，MNCs）是指血液中具有單個(gè)圓形核的細(xì)胞群，可通過Ficoll-Paque密度梯度離心法去除多核細(xì)胞和紅細(xì)胞等不同密度的細(xì)胞組分獲得。既往通常將收集MNCs作為研究單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞特性的前提步驟[1]，隨著細(xì)胞療法的發(fā)展，MNCs中豐富的免疫細(xì)胞種類、干細(xì)胞特性、多細(xì)胞群間的協(xié)同作用以及相對容易的收集方法使其在治療炎癥相關(guān)疾病及損傷性疾病方面展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用空間。根據(jù)來源不同，MNCs主要分為臍帶血單個(gè)核細(xì)胞（umbilical cord blood mononuclear cells，UCBMNCs）、骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）和外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs）。在生殖系統(tǒng)領(lǐng)域，MNCs在治療卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、宮腔粘連以及反復(fù)種植失敗（repeated implantation failure，RIF）方面已開展了相關(guān)研究。現(xiàn)就MNCs在女性生殖系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MNCs臨床應(yīng)用特點(diǎn)

1.1 UCBMNCsUCBMNCs是不成熟的免疫細(xì)胞、造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞等組成的細(xì)胞群體，其來源廣泛，提取分離過程無創(chuàng)且安全，不存在倫理問題。與BMMNCs相比，UCBMNCs中不成熟的免疫細(xì)胞抗原提呈能力及反應(yīng)性低，具有低免疫原性。移植同種異體臍帶血移植物抗宿主?。╣raft-versushost disease，GVHD）的發(fā)生率低，具有良好的臨床安全性[2]。UCBMNCs在心肌缺血、皮膚損傷、腎損傷及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均展現(xiàn)了良好的組織修復(fù)和功能恢復(fù)作用。

1.2 BMMNCsBMMNCs 富含造血干細(xì)胞和MSCs，還有組織特異性祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等，可分泌多種促進(jìn)損傷組織修復(fù)的生長因子，在治療疾病方面較單一種類干細(xì)胞能夠發(fā)揮更好的協(xié)同作用[3]。在臨床研究中，用于移植的BMMNCs多來源于受試者自身，獲取方便，可有效避免GVHD的發(fā)生。盡管自體BMMNCs移植在心肌缺血損傷、肢體缺血、股骨頭壞死及神經(jīng)系統(tǒng)病變等疾病中均顯示出良好的治療效果，但有研究表明，供體年齡增加可通過影響自噬對BMMNCs的旁分泌作用產(chǎn)生負(fù)面效果，從而限制了損傷組織的修復(fù)[4]，提示BMMNCs的治療效果可能因供體年齡增加而降低。此外，BMMNCs采集步驟較為復(fù)雜，操作對供者創(chuàng)傷較大，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。

1.3 PBMNCsPBMNCs富含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，還有少量造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞及MSCs等干細(xì)胞群體，但干細(xì)胞比例小于0.1%。經(jīng)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）動(dòng)員的PBMNCs中干細(xì)胞比例明顯增加，且具備成體干細(xì)胞的特點(diǎn)。與BMMNCs相比，PBMNCs的收集方法操作較簡便，對供者創(chuàng)傷小且更安全[5]。獲取的便利性也便于PBMNCs的重復(fù)收集，增加細(xì)胞數(shù)量，以利于臨床應(yīng)用。

2 MNCs作用機(jī)制

在生殖系統(tǒng)疾病中，MNCs治療作用的發(fā)揮可能與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)損傷組織的干細(xì)胞分化和增殖、促進(jìn)新生血管形成和調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境有關(guān)[6-8]。而細(xì)胞歸巢和分泌與旁分泌作用可能是其發(fā)揮以上作用的基礎(chǔ)。

2.1 歸巢作用MNCs在發(fā)揮作用前需要先歸巢至受損區(qū)域。趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF1）及其受體CXCR4在歸巢過程中起到了關(guān)鍵作用。體內(nèi)出現(xiàn)缺血或炎癥部位后，組織損傷處缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）生成增加，誘導(dǎo)SDF1的表達(dá)，SDF1釋放入血后，表達(dá)CXCR4的MNCs在SDF1濃度梯度誘導(dǎo)下歸巢至組織損傷區(qū)域[9]，從而發(fā)揮作用。在早衰的卵巢組織中可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植的MNCs[10]，可能歸因于MNCs的歸巢作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，放線菌素相關(guān)抗菌肽可增強(qiáng)MNCs對SDF1的趨化反應(yīng)。Klyachkin等[11]將經(jīng)放線菌素相關(guān)抗菌肽預(yù)處理后的MNCs注射至小鼠梗死心肌組織周圍發(fā)現(xiàn)，與移植未經(jīng)處理的MNCs的小鼠相比，移植預(yù)處理MNCs小鼠的心肌組織微血管形成數(shù)量更多，梗死組織瘢痕更少，心臟功能得到了更好地改善。提示經(jīng)放線菌素相關(guān)抗菌肽預(yù)處理后的MNCs從病灶周圍向梗死灶歸巢的能力增強(qiáng)，從而更好地發(fā)揮組織損傷修復(fù)作用。MNCs移植途徑主要包括損傷部位局部注射移植（即原位移植）、靜脈移植和動(dòng)脈移植，不同移植途徑可影響其在受損組織的歸巢。在濃度相同的前提下，MNCs卵巢原位移植較靜脈移植對POF小鼠性激素水平的改善效果更好[10]。提示促進(jìn)MNCs的歸巢更有利于其發(fā)揮治療作用。

2.2 分泌與旁分泌Leal等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MNCs移植到腦組織7 d后幾乎無法在受損組織中檢測到MNCs的存在，但損傷組織的恢復(fù)并未隨MNCs的消失而停止。而血清中抗炎因子水平的升高則提示MNCs可能通過分泌細(xì)胞因子參與局部組織損傷修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)BMMNCs裂解物與BMMNCs對神經(jīng)的保護(hù)作用相似，提示BMMNCs可能通過可溶性細(xì)胞因子的釋放發(fā)揮作用。生物微膠囊可以為移植細(xì)胞提供與受體免疫系統(tǒng)的物理分離和保護(hù)作用，同時(shí)允許低分子質(zhì)量營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣自由穿過半透膜，是研究旁分泌效應(yīng)的良好工具。Kieling等[13]將BMMNCs包裹在微膠囊中移植入急性肝損傷大鼠腹膜腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠存活率提高，提示BMMNCs可能通過分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)受損肝組織的修復(fù)。對UCBMNCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，可于培養(yǎng)液中檢測到抗炎因子、促血管生成因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子及具有趨化活性的蛋白質(zhì)[14]，表明UCBMNCs能夠分泌具有生物活性的細(xì)胞因子。PBMNCs體外可分泌多種細(xì)胞因子，且在人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）刺激下子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)細(xì)胞因子白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）分泌增加，經(jīng)hCG激活的PBMNCs可促進(jìn)胚胎植入[15]。以上研究均提示，分泌與旁分泌作用可能是MNCs發(fā)揮修復(fù)損傷和參與局部免疫調(diào)節(jié)作用的主要機(jī)制。

3 MNCs在生殖系統(tǒng)疾病治療中的進(jìn)展

3.1 POFPOF指育齡期女性因卵巢功能減退導(dǎo)致以不孕及絕經(jīng)前綜合征為主要表現(xiàn)的疾病，目前治療方式多為激素替代治療以改善相關(guān)癥狀，尚無有效方法恢復(fù)卵巢功能。近年來細(xì)胞療法成為治療POF的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，注射UCBMNCs至POF大鼠卵巢50 d后血清雌二醇（estradiol，E2）水平升高，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）水平降低，卵巢中未閉鎖卵泡數(shù)量增加，并且大鼠紊亂的動(dòng)情周期得到改善[16]。王毅峰等[10]對比相同濃度的UCBMNCs原位和靜脈移植2種途徑的效果，發(fā)現(xiàn)2種途徑均可提高POF小鼠血清中E2、抑制素B和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，降低FSH和LH水平，減少卵巢組織內(nèi)細(xì)胞凋亡。且靜脈移植30 d后在卵巢中依然能發(fā)現(xiàn)UCBMNCs的分布，提示經(jīng)靜脈移植的UCBMNCs同樣可以到達(dá)疾病部位。與原位移植相比，靜脈移植對激素水平的改善作用較弱，提示在相同細(xì)胞濃度的情況下，不同移植途徑對卵巢功能的改善效果存在差異。損傷部位有效細(xì)胞濃度的降低可能是靜脈移植治療效果較原位移植差的原因之一。與原位移植相比，靜脈移植更易被患者接受，其成本低、創(chuàng)傷小且操作方便，臨床應(yīng)用中可能更具優(yōu)勢。但在目前POF的細(xì)胞療法研究中，原位移植仍是首選。超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道后穹窿穿刺或腹腔鏡手術(shù)將MSCs原位注射至卵巢中，POF患者血清FSH水平下降，圍絕經(jīng)期主觀癥狀改善，且隨訪期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[17-18]。若考慮靜脈移植，MNCs在其他器官的滯留及影響、對損傷組織的恢復(fù)效果及安全性需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

除UCBMNCs外，有研究發(fā)現(xiàn)PBMNCs也能促進(jìn)早衰卵巢功能的恢復(fù)。El Andaloussi等[19]將PBMNCs通過尾靜脈注射至POF小鼠中，觀察到PBMNCs可促進(jìn)小鼠動(dòng)情周期的恢復(fù)，甚至是生育力的恢復(fù)；卵巢干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物VEGF、集落刺激因子1、Notch4和抑制素B表達(dá)水平增加，提示PBMNCs可能激活卵巢中的干細(xì)胞。Huang等[6]將來源于雄性大鼠且經(jīng)GCSF動(dòng)員的PBMNCs聯(lián)合富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）原位移植至POF大鼠雙側(cè)卵巢中，在移植后5 d、10 d 及20 d 均發(fā)現(xiàn)了血管生成標(biāo)志物CD34、抗苗勒管激素及VEGF水平顯著升高，卵巢新生血管及原始卵泡數(shù)增加，大鼠發(fā)情周期得到恢復(fù)，并通過檢測Y染色體性別決定區(qū)（sex determining region of Y，Sry）基因確認(rèn)了PBMNCs存在于卵巢。這可能是通過促進(jìn)促凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma 2 associated X protein，Bax）表達(dá)下調(diào)和抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）表達(dá)上調(diào)，減少顆粒細(xì)胞凋亡，從而改善了卵巢功能。研究顯示聯(lián)合治療比PRP或PBMNCs單獨(dú)治療效果更佳，提示臨床或可采用PBMNCs聯(lián)合PRP療法治療POF。

3.2 宮腔粘連反復(fù)嚴(yán)重的宮腔粘連影響子宮內(nèi)膜容受性，不利于胚胎著床，可導(dǎo)致不孕癥和不良輔助生殖結(jié)局。ΔNp63是p53家族中的一員，其上調(diào)與低增殖和低分化有關(guān)。Zhao等[7]發(fā)現(xiàn)BMMNCs與轉(zhuǎn)染了ΔNp63腺病毒的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，能夠顯著下調(diào)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ΔNp63 mRNA水平，上調(diào)細(xì)胞增殖與分化相關(guān)標(biāo)志物如細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、細(xì)胞增殖核抗原Ki67、雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）及胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）水平。鑒于近年來發(fā)現(xiàn)的生物支架在宮腔粘連治療中的積極作用[20]，Zhao等[7]采用自體BMMNCs搭載膠原支架對5例重度宮腔粘連患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)患者子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ΔNp63表達(dá)下降，CCND1、Ki67、ERα 及IGF1表達(dá)增加，并且患者子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量及細(xì)胞密度增加，局部血流增加，內(nèi)膜增厚；4例患者行體外受精-胚胎移植助孕，1例患者自然妊娠，最終5例患者全部獲得活產(chǎn)。這提示BMMNCs可能通過下調(diào)ΔNp63表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜重建與功能恢復(fù)。盡管5例患者均獲得了良好的妊娠結(jié)局，但該研究存在一定的局限性，樣本量小及非隨機(jī)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)降低了結(jié)論的可信度。令人期待的是，該團(tuán)隊(duì)注冊了一項(xiàng)預(yù)計(jì)納入144例受試者的多中心、隨機(jī)、單盲對照試驗(yàn)，探究搭載膠原支架的自體BMMNCs對嚴(yán)重宮腔粘連患者的治療作用，以期為MNCs在宮腔粘連中的臨床應(yīng)用提供高質(zhì)量證據(jù)。

3.3 RIF目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜容受性降低是導(dǎo)致RIF的重要原因，內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜增殖分化、改善子宮內(nèi)膜容受性及促進(jìn)胚胎植入方面有重要作用。PBMNCs含有豐富的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞。LIF和整合素αvβ3是評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性分子。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與PBMNCs共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中LIF及整合素αvβ3水平均明顯升高[21]。輔助性T細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）/Th2細(xì)胞的平衡對胚胎的成功種植至關(guān)重要。正常情況下，母胎界面Th2細(xì)胞占優(yōu)勢，主導(dǎo)免疫耐受的形成。自體PBMNCs宮腔灌注后，RIF患者宮頸管內(nèi)分泌物中的Th2型細(xì)胞因子IL-6水平升高，Th1型細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平降低。RIF患者經(jīng)宮腔灌注PBMNCs后胚胎種植率和臨床妊娠率提高[22-23]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）參與了胚胎著床過程中免疫耐受的發(fā)生。CRH體外可抑制PBMNCs表達(dá)Th1型細(xì)胞因子，上調(diào)Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，宮腔灌注經(jīng)CRH激活的PBMNCs可提高RIF患者的臨床妊娠率，推測可能是CRH促進(jìn)了PBMNCs表達(dá)Th2型細(xì)胞因子，從而推進(jìn)母胎界面的免疫耐受的形成，改善子宮內(nèi)膜容受性[24-25]。以上研究提示PBMNCs可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡改變子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境，改善子宮內(nèi)膜容受性，從而改善RIF患者的妊娠結(jié)局。

hCG同樣參與了胚胎著床過程中免疫耐受的形成。宮腔灌注hCG預(yù)處理的PBMNCs可提高RIF患者宮腔液中與胚胎種植相關(guān)的細(xì)胞因子Eotaxin、VEGF及IL-8水平[26]。Yoshioka等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，宮腔灌注與hCG共培養(yǎng)的PBMNCs（hCG-PBMNCs）可提高有4次及以上胚胎種植失敗史患者的新鮮周期胚胎植入率。但當(dāng)年齡超過40歲時(shí)，hCG-PBMNCs對胚胎植入率無明顯影響。Qin等[28]的Meta分析表明，于胚胎移植前2～3 d宮腔灌注與hCG共培養(yǎng)48 h的PBMNCs，RIF患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率可升高，hCG的劑量及PBMNCs的濃度對妊娠結(jié)局無明顯影響。但該Meta分析納入的7項(xiàng)研究中僅有1項(xiàng)為高質(zhì)量的雙盲隨機(jī)對照研究，且不同研究之間的異質(zhì)性較高，結(jié)論存在一定偏倚。RIF定義中胚胎植入失敗的次數(shù)并不統(tǒng)一。研究發(fā)現(xiàn)，對于胚胎種植失敗4次及以上的患者，hCG-PBMNCs能夠改善凍融胚胎移植周期的胚胎植入率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但對有1～3次胚胎植入失敗史的患者妊娠結(jié)局無明顯改善[29]。Okitsu等[30]發(fā)現(xiàn)，僅當(dāng)胚胎移植失敗次數(shù)在3次或更多次時(shí)PBMNCs才能改善RIF患者凍融胚胎移植周期的胚胎植入率和臨床妊娠率。同時(shí)該研究指出了PBMNCs可能的負(fù)面影響，包括可能存在中性粒細(xì)胞污染，以及PBMNCs可能產(chǎn)生過量的Th1型和Th2型細(xì)胞因子。因此，該研究僅推薦將PBMNCs用于3次及以上胚胎移植失敗的患者。以上研究提示，PBMNCs對3次及以上胚胎種植失敗患者的妊娠結(jié)局有改善作用，對于僅有1次或2次失敗史的患者，效果尚不確定。

3.4 其他與體外受精-胚胎移植相比，人工授精的成功率始終較低。鑒于PBMNCs在RIF中的良好結(jié)果，Joao等[31]探討了PBMNCs對人工授精結(jié)局的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBMNCs并未提高人工授精的妊娠率和活產(chǎn)率，這一結(jié)果似乎也印證了部分研究中宮腔灌注PBMNCs對單次胚胎移植失敗患者妊娠結(jié)局無明顯改善的結(jié)論。

4 結(jié)語與展望

目前MNCs在治療不同生殖系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展及側(cè)重點(diǎn)各異。MNCs治療POF的研究仍處于臨床前階段，原位移植臨床操作的不便性、靜脈注射療效及安全性不確切等問題均限制了其臨床試驗(yàn)的開展。BMMNCs可改善宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局，但仍需更多研究探討治療機(jī)制。新型生物支架聯(lián)合MNCs是治療宮腔粘連未來可深入探究的方向之一。hCG-PBMNCs對RIF的治療效果已被多項(xiàng)研究證實(shí)，但需要更高質(zhì)量的隨機(jī)對照試驗(yàn)指導(dǎo)臨床，并且探究可能的機(jī)制。外泌體作為近年來的研究熱點(diǎn)之一，其發(fā)揮作用的機(jī)制主要與血管生成、抗炎、抗纖維化有關(guān)[32]。與MNCs相比，外泌體無細(xì)胞相關(guān)的移植物抗宿主反應(yīng)，安全性更高，且無倫理問題。研究表明，從凋亡PBMNCs分離提取的外泌體可促進(jìn)機(jī)體組織損傷的修復(fù)，已被證實(shí)在心肌損傷、神經(jīng)損傷及皮膚損傷等組織損傷中發(fā)揮修復(fù)作用[33]。MNCs來源的外泌體有望在生殖系統(tǒng)疾病中成為新的治療方法。此外，MNCs聯(lián)合基因療法也已獲得一些有意義的結(jié)果，轉(zhuǎn)染了載有神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的重組腺病毒的UCBMNCs可促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)[34]。未來或可將重組腺病毒技術(shù)聯(lián)合MNCs治療用于生殖系統(tǒng)組織損傷，以期獲得新的治療思路。3種MNCs的臨床應(yīng)用特點(diǎn)各有優(yōu)劣，關(guān)于3種MNCs在療效方面的比較研究暫未開展，未來可探究不同種類MNCs對生殖系統(tǒng)不同疾病的治療效果及相關(guān)作用機(jī)制。而且MNCs在應(yīng)用中仍有許多問題亟待解決，其治療不同生殖系統(tǒng)疾病時(shí)的移植途徑及濃度對效果的影響仍需進(jìn)一步研究。