梁英，曹春暉，范麗敏，田傳遠

（1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.天津科技大學海洋資源化學與食品技術教育部重點實驗室，天津 300450）

全球對清潔能源的需求不斷增長，生物質能源受到越來越多的關注。球等鞭金藻（Isochrysisg albana）H24 是常見的富油微藻，富含飽和脂肪酸（SFA,Saturated Fatty Acids）和單不飽和脂肪酸（MUFA），有利于制備生物柴油[1,2]。球等鞭金藻富含的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等n-3多不飽和脂肪酸（PUFA）成分具有諸多生理功能，被認為對心腦血管疾病和神經突觸形成等起重要作用[3,4]。近年來范麗敏[5]和梁英等[6]報道了棕鞭藻（Ochrosphaero neopolitana）H32 的脂肪酸組成。

葉綠素熒光參數能準確反映植物對光能的利用和光系統(tǒng)II（PSII）的狀況。營養(yǎng)鹽脅迫可以提高微藻的油脂含量，氮限制是其中有效的方法。氮缺乏導致光合作用產生的代謝通量在脅迫條件下轉化為脂類生物合成，脂肪酸組成發(fā)生改變是微藻應對脅迫的一種機制[7-17]。微擬球藻（Nannochloropsissp.）的脂含量在氮饑餓條件下由39.1%升至68.5%[8]。富油新綠藻（Neochloris oleoabundans）在氮限制條件下脂肪酸含量由氮充足時的53.2 mg/L 增加至91.2 mg/L，同時單不飽和脂肪酸（MUFA）的含量達到最大值[11]。然而，直接限氮會影響細胞的正常生長，生物量降低。Na2WO4毒性低，對環(huán)境和生物體沒有危害，是農業(yè)上常用的硝酸還原酶抑制劑，可導致氮限制。沈雄等[18]發(fā)現(xiàn)，鎢酸鈉限氮和直接限氮對微擬球藻的脂肪酸組成的影響結果一致。本文通過研究2 株海洋金藻在不同濃度Na2WO4培養(yǎng)基中生物量和脂質積累的變化，探索進一步提高微藻油脂含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

球等鞭金藻（Isochrysisg albana）MACC/H24 和棕鞭藻（Ochrosphaero neopolitana）MACC/H32 實驗在1 000 mL 三角燒瓶中進行。

1.2 方法

將指數生長期的藻種接種到2f 培養(yǎng)基中，終體積為850 mL（0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.5 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L），每個處理設3 個重復，培養(yǎng)過程中光強為100 μmol·m-2s-1，連續(xù)光照、充氣，溫度25℃，鹽度31，Na2WO4脅迫培養(yǎng)時間為5 d。

采用血球計數板法測定細胞密度，根據戴榮繼等[19]方法測定葉綠素含量。用Water-PAM 葉綠素熒光儀（Walz 公司生產）測定葉綠素熒光參數[20]。Fm：最大熒光；Fv：可變熒光；Fv/Fm：PSII 最大光化學效率（量子產量）；rETR：電子傳遞速率；qP：光化學淬滅。取指數生長末期的樣品，經離心和凍干后，按改進的Bligh-Dyer 法測定總脂含量[21]。

將收獲的微藻冷凍干燥后，按Lepage 和Roy[22]的方法進行甲酯化，用1 mL 正己烷萃取分層后，取最上層黃色液體即脂肪酸甲酯供脂肪酸分析。采用美國Agilent6890N 氣相色譜儀、5973 型質譜儀測定脂肪酸含量，其中氫火焰離子化檢測器（FID）和HP-5 彈性石英毛細管色譜柱。程序升溫，進樣口溫度為250℃，進樣1 μL，F(xiàn)ID 檢測器溫度為300℃，載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min。質譜條件為EI 離子源，離子源溫度為230℃，接口溫度為280℃，質量掃描范圍m/z 50～600 u，掃描周期2.69次/s，電離能量為70 eV。以面積歸一劃法得到各脂肪酸組分的相對百分含量。

1.3 統(tǒng)計分析

應用Sigmaplot12.0 軟件作圖，應用SPSS16.0 軟件進行單因子方差分析（ANOVA）和SNK 多重比較分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Na2WO4 濃度對球等鞭金藻H24 的生長、總脂含量和脂肪酸組成的影響

不同Na2WO4濃度的限氮處理顯著影響球等鞭金藻的葉綠素熒光參數值（P＜0.05）（圖1）。在整個鎢酸鈉脅迫培養(yǎng)周期中（5 d），各濃度組的Fv/Fm 值均呈上升趨勢，其中空白對照組的Fv/Fm 顯著低于其他處理組（P＜0.05）。培養(yǎng)第4 d 時2.5 mmol/L和第5 d 時5 mmol/L Na2WO4組的Fv/Fm 值最高（P＜0.05）。rETR 和qP 值先上升后平穩(wěn)，各組間不存在顯著差異。

圖1 Na2WO4 濃度對球等鞭金藻葉綠素熒光參數的影響Fig.1 Chlorophyll fluorescence parameters of Isochrysis galbana H24 exposed to different concentrations of Na2WO4

Na2WO4濃度顯著影響球等鞭金藻的細胞密度、葉綠素含量和總脂含量（P＜0.05），各組間差異顯著（表1）?？瞻讓φ战M的最終細胞密度和葉綠素含量最大，葉綠素含量隨Na2WO4濃度的升高而下降。在0～5 mmol/L 之間球等鞭金藻的總脂含量隨Na2WO4濃度的增加而明顯增加（23.09%～31.91%）。

表1 不同Na2WO4 濃度下球等鞭金藻的最終細胞密度、葉綠素和總脂含量Tab.1 The final cell density,chlorophyll content,and total lipid content of Isochrysis galbana H24 exposed to different concentrations of Na2WO4

Na2WO4濃度顯著影響球等鞭金藻的18∶1（n-9）、SFA、MUFA 和PUFA 含量（P＜0.05）（表2）。球等鞭金藻的14∶0、16∶0、18∶1（n-9）和DHA 含量高，其中18∶1（n-9）含量隨Na2WO4濃度升高呈明顯的先下降后上升趨勢，5.0 mmol/L 濃度組最大（34.54%）；SFA 和MUFA 含量隨Na2WO4濃度升高而增加，均在5.0 mmol/L 時達到最大值（分別為37.59%和42.65%）。隨著Na2WO4濃度由0 mmol/L上升至5 mmol/L，PUFA 含量由19.42%增加至36.23%。添加Na2WO4對球等鞭金藻其他脂肪酸含量沒有影響。

表2 不同Na2WO4 濃度下球等鞭金藻的脂肪酸組成（占總脂肪酸的百分比）Tab.2 The main fatty acid compositions（% of total fatty acids）of Isochrysis galbana H24 exposed to different concentrations of Na2WO4

2.2 Na2WO4 濃度對棕鞭藻H32 生長、總脂含量和脂肪酸組成的影響

不同Na2WO4濃度的限氮處理顯著影響棕鞭藻H32 的Fv/Fm、rETR 和qP 值（P＜0.05）（圖2）。在整個脅迫培養(yǎng)周期中（5 d），各處理組的Fv/Fm、rETR和qP 均呈下降趨勢，其中5.0 mmol/L Na2WO4濃度組各參數值下降幅度最大，顯著低于其他處理組。第1 d，2.5 mmol/L Na2WO4處理組的Fv/Fm 值最高，第2 d，空白對照組的Fv/Fm 顯著高于其他各處理組，表明脅迫初期低Na2WO4濃度下棕鞭藻Fv/Fm 值較高。脅迫后期低Na2WO4濃度組（1.5 mmol/L）的rETR 和qP 顯著高于其他處理組（第4～5 d）（P＜0.05）。

圖2 Na2WO4 對棕鞭藻葉綠素熒光參數的影響Fig.2 Chlorophyll fluorescence parameters of Ochromonas neopolitana H32 exposed to different concentrations of Na2WO4

Na2WO4濃度顯著影響棕鞭藻H32 的細胞密度、葉綠素含量和總脂含量（表3），各處理組之間差異顯著（P＜0.0 5）?？瞻讓φ战M和低Na2WO4處理組（0.5 mmol/L）的最終細胞密度最大。5.0 mmol/L Na2WO4組的H32 葉綠素含量最高，但與0～1.5 mmol/L 鎢酸鈉處理組間差異不顯著（P＞0.05）。H32的總脂含量在0～5.0 mmol/L 間隨Na2WO4濃度的增加而增加（20.40%～25.55%）。

表3 不同Na2WO4 濃度下棕鞭藻的最終細胞密度、葉綠素含量和總脂含量Tab.3 The final cell density,chlorophyll content,and total lipid content of Ochromonas neopolitana H32 exposed to different concentrations of Na2WO4

除DHA 外，Na2WO4濃度顯著影響H32 的其他主要脂肪酸含量（P＜0.05）（表4）。棕鞭藻H32 有著較高含量的EPA、DHA、18∶1（n-9）和SFA，其中1.5 mmol/L Na2WO4組的14:0 含量最高（17.80%），5.0 mmol/L 組的16∶0、16∶1（n-7）和SFA 含量最高（分別為14.69%、8.90%和32.15%）。18∶1（n-9）和MUFA 含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，空白對照組中為最大值（分別為37.33%和44.98%）。H32 的EPA和PUFA 含量在0～2.5 mmol/L 間隨Na2WO4濃度的增加而增加，0 mmol/L 時分別為4.15%和25.15%，至2.5 mmol/L 時上升到最大值（分別為10.72%和31.96%），之后則呈下降趨勢。

表4 不同Na2WO4 濃度下棕鞭藻的脂肪酸組成（占總脂肪酸的百分比）Tab.4 The main fatty acid compositions（% of total fatty acids）of Ochromonas neopolitana H32 exposed to different concentrations of Na2WO4

3 討論

鎢酸鈉可以降低硝酸還原酶的活性，表現(xiàn)為氮限制[23]。氮限制會使光合作用機構的損傷和細胞生長滯后[24]。Song 等[25]就報道了氮缺乏的球等鞭金藻細胞數量、葉綠素含量和葉綠素熒光參數Fv/Fm、φPSII 和rETR 均顯著下降。Young 和Beardall[26]也發(fā)現(xiàn)，鹽藻（Dunaliella tertiolecta）的Fv/Fm 在缺氮介質中顯著下降。在本研究中，2 株海洋的細胞密度和葉綠素含量均在Na2WO4培養(yǎng)基中明顯下降，與以上研究結果一致。但2 株金藻的葉綠素熒光參數對Na2WO4脅迫的反應不同，其中棕鞭藻在高濃度Na2WO4中Fv/Fm 顯著降低，與以上研究結果一致；球等鞭金藻則在中、高濃度Na2WO4中Fv/Fm 升高，與Song 等[25]的結果并不一致。

缺氮能促進微藻生成脂質，細胞此時代謝失衡，生長受到抑制，剩余能量以脂類形式儲存[15,27]，同時伴隨著脂質代謝相關酶活性（如ACCase）的變化，以及大多數控制脂肪酸合成的相關基因表達的改變[28]。Lacour 等[9]報道了一株等鞭金藻（Isochrysis sp.）在氮饑餓條件下中性脂含量提高了45%。缺氮還可以顯著增加線粒體交替氧化酶（AOX）途徑的活性和脂肪酸的積累，使球等鞭金藻的脂肪酸生產率提高23%[16]。Livne 和Sukenik[29]也報道了球等鞭金藻在氮饑餓下的脂質積累現(xiàn)象。類似的結果還見于微擬球藻（Nannochloropsis sp.）[8,30]、巴夫杜氏藻（Dunaliella parva）[17]以及富油新綠藻[11]等。本試驗結果與上述報道一致，球等鞭金藻和棕鞭藻的總脂含量在Na2WO4限氮脅迫條件下顯著增加，5.0 mmol/L Na2WO4時總脂含量達最大值，分別比空白對照組提高了38.21%和25.24%。然而由氮饑餓產生的脂質貯存也具有很強的物種或品系特異性[31]。

氮濃度能夠影響植物去飽和酶基因的表達，影響脂肪酸組成。氮饑餓對脂肪酸組成的影響甚至大于對脂肪酸含量的影響[32,33]。Huerlimann 等[33]報道，在缺氮條件下大溪地等鞭金藻I.aff.galbana 的C16∶0、C18∶1（n-9）和MUFA 含量顯著提高，而PUFA 含量顯著下降，DHA 含量不變。Wang 等[14]報道了湛江等鞭金藻（I.zhangjiangensis）在氮限制條件下SFA 和MUFA 含量明顯增加，PUFA 含量降低。微擬球藻（Nannochloropsissp.）和扁藻（Tetraselmis suecica）的脂肪酸組成在氮充足和氮饑餓條件下也有顯著差異[8]。類似的趨勢還見于Benvenuti 等[30]、Griffiths 等[10]和Simionato 等[34]的報道。本實驗結果與以上研究一致，2 株金藻均在中-高Na2WO4濃度下14∶0、16∶0 和18∶1（n-9）含量顯著升高，SFA 和MUFA 含量增加，PUFA 含量顯著下降，DHA含量沒有明顯變化。

本研究結果表明，在指數生長末期添加Na2WO4限氮可以兼顧生物量和總脂含量[27]，并可改善脂肪酸組成。2 株海洋金藻生長和積累脂質的適宜鎢酸鈉濃度均為5 mmol/L，可建議應用于生產。而2 株金藻含有較高的DHA 成分，也可考慮開發(fā)定向培養(yǎng)技術，進一步強化DHA 的生成。