馬雪妮，許慧梅，張德奎

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，蘭州 730030

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤生長所必需的微環(huán)境[1]，包括細(xì)胞成分與非細(xì)胞成分。細(xì)胞成分包括間充質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等，非細(xì)胞成分包括細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、細(xì)胞因子及趨化因子等。其中免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子直接作用于腫瘤細(xì)胞，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，它們相互調(diào)控，共同形成抑制性免疫分子網(wǎng)絡(luò)，使腫瘤細(xì)胞能夠躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[2-3]。

中性粒細(xì)胞是人外周血中最豐富的白細(xì)胞，約占白細(xì)胞總數(shù)的50%～70%，在先天性免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色[4]，可通過吞噬作用、脫顆粒、產(chǎn)生活性氧等多種途徑抵御外界病原體的入侵，是機(jī)體應(yīng)對病原體入侵的第一道防線[5]。除此以外，中性粒細(xì)胞還可形成有別于細(xì)胞壞死及凋亡的特殊細(xì)胞死亡程序——中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)，參與機(jī)體的各種病理生理過程[6]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生及釋放NETs的過程不僅發(fā)生在敗血癥等感染性疾病中，而且在非感染性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、糖尿病、動脈粥樣硬化、急性肺損傷、肝缺血再灌注損傷、血栓形成及慢性肝病中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-8]。此外，NETs在多種腫瘤中高表達(dá)，如肺癌[9-11]、肝癌[11]、淋巴瘤[12]、結(jié)直腸癌[13]、乳腺癌[10,14]、胃癌[15]等，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及其相關(guān)的血栓形成密切相關(guān)。本文就TME對NETs表達(dá)的影響，以及NETs在TME中的作用進(jìn)行綜述，旨在探討NETs作為腫瘤標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用前景。

1 TME對NETs形成的影響

1996年，Takei等[6]在使用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激中性粒細(xì)胞時，觀察到一種不同于細(xì)胞凋亡(核固縮、細(xì)胞質(zhì)空泡化)及細(xì)胞壞死(保持核膜完整性)的現(xiàn)象，即中性粒細(xì)胞的分葉核退縮、擴(kuò)散，繼而核膜破裂，核內(nèi)成分釋放到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜破裂[6]。直到2004年，Brinkmann等[16]將該過程中釋放到胞外的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正式命名為NETs。NETs是以DNA為骨架并鑲嵌多種活性蛋白的細(xì)胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中的活性蛋白包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及組織蛋白酶G(cathepsin G，CG)等，而染色質(zhì)是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主干[17]。研究發(fā)現(xiàn)，多種物質(zhì)均可刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，包括細(xì)菌、真菌、原生動物、病毒等在內(nèi)的病原體以及一些化學(xué)或生物因素[5,9-13]。

白細(xì)胞介素(IL)-8是CXC家族的典型趨化因子，又稱CX-CL8，負(fù)責(zé)中性粒細(xì)胞向炎癥部位的募集并活化[18]。研究發(fā)現(xiàn)，來自彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)的IL-8與中性粒細(xì)胞上的受體(CXCR2)相互作用，通過激活Src、p38及ERK信號通路形成NETs[12]。同時，Alfaro等[19]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌及非小細(xì)胞肺癌中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的包括IL-8在內(nèi)的趨化因子能夠募集骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，使其形成NETs，該過程能夠募集更多的中性粒細(xì)胞，有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。最近有研究顯示，黑色素瘤及胰腺癌中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)產(chǎn)生的淀粉樣蛋白β能夠刺激NETs的形成，稱為腫瘤相關(guān)NETs(t-NETs)，此過程依賴于活性氧(ROS)的產(chǎn)生[20]。因此，TME能夠刺激NETs的產(chǎn)生，從而促進(jìn)NETs形成(NETosis)。

2 NETs對TME的影響

2.1 對腫瘤細(xì)胞的影響 NETs能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Miller-Ocuin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，來源于NETs的細(xì)胞外DNA可通過激活胰腺星狀細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而通過肽?；彼崦搧啺访?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)抑制劑或脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)抑制NETs的生成能夠逆轉(zhuǎn)上述作用；且這種促腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制還可能涉及NETs的多種活性蛋白酶。Yazdani等[22]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞受到外界刺激后會釋放損傷相關(guān)分子模式(DAMP)蛋白，在此過程中將中性粒細(xì)胞募集到TME，并誘導(dǎo)NETs的形成，而NETs主要通過增加線粒體的生物合成來增加能量的產(chǎn)生，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。NETs通過釋放NE激活TLR4-p38-PGC-1α軸，從而促進(jìn)線粒體生物合成及腫瘤生長。在PAD4-/-小鼠體內(nèi)，通過DNase Ⅰ或NE抑制劑(NEi)抑制NETs的形成，或在體外阻斷NE-TLR4-PGC-1α軸，都可以抑制線粒體的生物合成并減緩腫瘤的生長。此外，DLBCL產(chǎn)生的NETs可直接上調(diào)DLBCL Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)途徑，隨后激活核因子(NF)-кB、STAT3及p38途徑，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抑制NETs形成、阻斷IL8-CXCR2軸或抑制TLR9均會抑制腫瘤的進(jìn)展[12]。

NETs可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Martins-Cardoso等[14]發(fā)現(xiàn)，NETs能夠?qū)⑷巳橄侔┘?xì)胞MCF7(主要為CD44Lo/–CD24+表型)轉(zhuǎn)化為CD44+CD24Lo/–表型，而CD44是一種細(xì)胞表面糖蛋白受體，可識別多種配體，包括細(xì)胞外基質(zhì)成分如透明質(zhì)酸、骨橋蛋白、金屬蛋白酶等，與腫瘤遷移及轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。將NETs與人乳腺癌細(xì)胞MCF7共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，NETs能將MCF7典型的上皮形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型，即N-鈣黏蛋白及纖連蛋白的表達(dá)增加，而E-鈣黏蛋白的表達(dá)被抑制，從而導(dǎo)致MCF7細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。還有研究證實(shí)，在小鼠結(jié)腸癌及肺癌模型中，即便不存在敗血癥，NETs仍可捕獲循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，使其黏附于肝臟[24]。而Najmeh等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細(xì)胞中，這種黏附作用是整合素介導(dǎo)的蛋白-蛋白互相作用；在NETs及腫瘤細(xì)胞中，β1整合素均呈高表達(dá)，且兩種β1整合素均參與了這種黏附作用；而將NETs上的β1整合素阻斷后，腫瘤細(xì)胞與NETs黏附減少，當(dāng)腫瘤來源的β1整合素被抑制后，來源于NETs的β1整合素也會相應(yīng)減少，由此可以推論來源于NETs與來源于腫瘤細(xì)胞的β1整合素可能存在某種共域化作用。此外，跨膜蛋白CCDC25是一種存在于腫瘤細(xì)胞表面的NETs DNA受體，可通過激活I(lǐng)LK-β-parvin信號通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[26]。

2.2 對免疫細(xì)胞的影響 TME中浸潤的免疫抑制性細(xì)胞是腫瘤抑制性免疫微環(huán)境形成的關(guān)鍵因素，這些免疫抑制性細(xì)胞包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)、MDSCs、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)等，它們能夠協(xié)助腫瘤進(jìn)行免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[27]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子可促進(jìn)中性粒細(xì)胞及MDSCs發(fā)生NETosis，在此過程中，NETs將腫瘤細(xì)胞包裹起來，阻斷了免疫細(xì)胞與周圍靶細(xì)胞的結(jié)合，從而使腫瘤細(xì)胞免受CD8+T細(xì)胞及自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，而PAD4抑制劑可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，是腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)[13]。Xia等[28]發(fā)現(xiàn)，表達(dá)DNase Ⅰ的腺病毒(即AAV-DNaseⅠ)可通過抑制中性粒細(xì)胞募集、抑制NETs形成、增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量、減少CD4+T細(xì)胞數(shù)量來調(diào)節(jié)TME中的先天性及獲得性免疫應(yīng)答，而CD8+T細(xì)胞是抗原特異性抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)器，可以識別并殺死腫瘤細(xì)胞。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞通過募集中性粒細(xì)胞使其分泌CCL17而將Tregs募集到腫瘤部位，此過程損害了免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷能力[29]。因此，NETs可能通過作用于TME中的免疫細(xì)胞協(xié)助腫瘤進(jìn)行免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2.3 對內(nèi)皮細(xì)胞的影響 NETs中的多種成分可通過影響內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)腫瘤微血管的生成。Jung等[30]發(fā)現(xiàn)，組蛋白作為NETs的重要組成部分，能在胰腺癌中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成，而組蛋白的抑制劑(如肝素或多聚唾液酸)可逆轉(zhuǎn)以上作用。此外，NE能通過誘導(dǎo)TME內(nèi)的血管生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，其可能的機(jī)制是NE導(dǎo)致腫瘤抑制因子失活，從而促進(jìn)TME中的血管生成[31]。Wilson等[32]認(rèn)為CG不僅具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，還可通過刺激血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)而促進(jìn)新生血管形成，使轉(zhuǎn)移灶擁有豐富的血供，從而繼續(xù)生長；對骨髓轉(zhuǎn)移癌小鼠模型使用CG抑制劑，可使其微血管密度低于正常對照。另外，有研究顯示，結(jié)直腸癌患者腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的NETs能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促凝表型，即表現(xiàn)為磷脂酰絲氨酸(PS)外露增加、凝血時間縮短、大量纖維蛋白形成，從而促進(jìn)腫瘤相關(guān)血栓形成[33]。

2.4 對腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的影響 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是TME中活化的成纖維細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[34]。Takesue等[35]通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NETs可作用于胰腺導(dǎo)管腺癌中的CAFs，從而促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移，而NETs抑制劑可減少腫瘤組織中CAFs的募集，進(jìn)而抑制肝轉(zhuǎn)移。Munir等[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤及胰腺癌中，這種作用是CAFs產(chǎn)生的淀粉樣蛋白β介導(dǎo)的，抑制NETs或淀粉樣蛋白β均能抑制腫瘤的生長，并恢復(fù)中性粒細(xì)胞的抗腫瘤活性。

2.5 對細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子的影響 NETs還可通過調(diào)控TME中的細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子而影響腫瘤的進(jìn)展。一方面，Albrengues等[11]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的肺部炎癥會導(dǎo)致在休眠癌細(xì)胞周圍形成NETs，作為NETs的重要組成部分，NE及MMP9依次作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的層黏連蛋白-111，使其暴露出一個新的表位，該表位能與腫瘤細(xì)胞表面的整合素α3β1結(jié)合，從而使休眠的腫瘤細(xì)胞蘇醒，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。另一方面，在胰腺癌中，胰腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17，后者通過募集中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)NETs的產(chǎn)生；抑制IL-17可增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(如PD-1、CTLA4)的敏感性，而抑制中性粒細(xì)胞或PAD4依賴的NETosis能產(chǎn)生類似的效應(yīng)[36]。

3 NETs的臨床應(yīng)用前景

3.1 作為腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用前景 NETs可作為多種腫瘤的標(biāo)志物，與腫瘤的分期、分型密切相關(guān)。Rayes等[24]研究發(fā)現(xiàn)，NETs水平在肺癌、胃癌及食管癌患者中明顯升高，晚期患者明顯高于早期患者，且僅有腫瘤也可誘導(dǎo)NETosis，不依賴于手術(shù)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)，外周血NETs水平在以下人群中從高到低依次為：胃腺癌晚期患者、胃腺癌術(shù)前患者、胃腺癌術(shù)后患者、胃良性病變患者、健康志愿者；且NETs水平與腫瘤的分型及預(yù)后相關(guān)。Park等[10]在人乳腺癌組織標(biāo)本中檢測到NETs，其中三陰性乳腺癌中表達(dá)量最高，Luminal型乳腺癌中表達(dá)量很少，甚至不表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)，NETs廣泛存在于乳腺癌及結(jié)腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移病灶中，而跨膜蛋白CCDC25作為存在于腫瘤細(xì)胞表面的NETs DNA受體，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[26]。血清中NETs的水平及腫瘤細(xì)胞表面CCDC25的表達(dá)量可作為生物標(biāo)志物，特異性地預(yù)測早期乳腺癌患者肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。因此，NETs作為生物標(biāo)志物在腫瘤的分期、分型及預(yù)測腫瘤進(jìn)展和預(yù)后方面將發(fā)揮重要的作用。

3.2作為腫瘤治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用前景 雖然目前尚無臨床試驗(yàn)評估靶向NETs對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的影響，但已有研究提示抑制NETs對腫瘤的早期防治具有重要意義。van der Windt等[37]發(fā)現(xiàn)，抑制NETs可使非酒精性脂肪肝誘發(fā)的肝癌發(fā)生率降低50%。同樣地，使用NE抑制劑可以明顯抑制NETs形成，阻止腫瘤細(xì)胞與肝毛細(xì)血管竇及肺毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞向肝臟與肺部轉(zhuǎn)移[27]。另外，DNase Ⅰ或PAD4抑制劑可抑制NETs的形成，進(jìn)一步抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-13,28]，且PAD4抑制劑或DNase Ⅰ也可減輕NETs介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)腎功能損傷[38]。目前，NE抑制劑及DNase Ⅰ已用于其他呼吸系統(tǒng)疾病的治療[39]。以上研究提示，NETs作為腫瘤治療的靶點(diǎn)可能會有很好的應(yīng)用前景，當(dāng)然，考慮到不同腫瘤的特異性、不同治療方式的影響及腫瘤患者與動物模型的差異，將NETs抑制劑真正應(yīng)用于臨床還須謹(jǐn)慎。

4 總結(jié)與展望

中性粒細(xì)胞一直以來被認(rèn)為是人體重要的防御機(jī)制，可通過NETs誘捕并殺滅有害病原體。目前研究發(fā)現(xiàn)，NETs在多種腫瘤中高表達(dá)，TME中的成分能夠刺激NETs的形成，而NETs也能通過影響TME中的腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果提示，NETs作為預(yù)測腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的標(biāo)志物，以及潛在治療靶點(diǎn)將有很好的應(yīng)用前景。但由于受到腫瘤類型、治療方式及腫瘤患者與動物模型差異的影響，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。