趙敏，張?jiān)婄?，冉紫晶，葉青，梅小平

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川南充637000

目前，核苷（酸）類似物（NAs）的抗HBV 治療是CHB 患者治療的主要手段［1］，通過抑制 HBV DNA 逆轉(zhuǎn)錄來降低CHB 患者血清HBV DNA 載量以促進(jìn)肝功能恢復(fù)與降低傳染性，但抗HBV 治療對肝細(xì)胞核內(nèi)HBV 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）沒有明確清除作用［2］，其HBV 復(fù)制的動(dòng)始環(huán)節(jié)是以肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA 為模板進(jìn)行 HBV pgRNA 逆轉(zhuǎn)錄，是 HBV 在CHB 患者體內(nèi)持續(xù)復(fù)制和NAs 治療停藥后復(fù)發(fā)的主要原因。目前評價(jià)抗HBV 療效及停藥時(shí)機(jī)選擇的生物學(xué)標(biāo)志物有血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg等，但不能直接反映 HBV cccDNA 水平。研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，CHB 患者血清中的乙型肝炎病毒前基因組RNA（HBV pgRNA）和松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）一樣，存在于成熟病毒顆粒的核衣殼內(nèi)，HBV pgRNA 是ccc DNA的直接產(chǎn)物，能反映肝內(nèi)ccc DNA活性，阻斷逆轉(zhuǎn)錄不影響HBV pgRNA 合成，作為能夠反映HBV cccDNA水平的新型血清學(xué)標(biāo)志物已受到重視，在評價(jià)抗HBV 療效、病情程度等方面可能具有潛在臨床價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，HBV pgRNA 的狀態(tài)可以反映慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治療的長期預(yù)后。HB-crAg 由 HBV 前 C/C 區(qū) 編 碼 的 HBcAg、HBeAg 與P22cr3 種蛋白質(zhì)組成，其中P22cr 是 HBeAg 形成前的中間產(chǎn)物，有相同的149 個(gè)氨基酸序列［5］。CHEN等［6］研究發(fā)現(xiàn) CHB 患者外周血 HBcrAg 水平較血清HBsAg 或HBV DNA 水平與肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA水平的正相關(guān)性更強(qiáng)。研究結(jié)果提示，CHB 患者血清HBcrAg 水平可反映HBV 感染的自然病程，其動(dòng)態(tài)變化可預(yù)測HBeAg 自發(fā)血清學(xué)轉(zhuǎn)化［7-8］。在2018年歐洲肝病學(xué)會(huì)《慢性乙型肝炎病毒感染管理臨床實(shí)踐指南》及我國2019 版《慢性乙型肝炎防治指南》［9］中均增加了 HBV 檢測的 3 種新型生物學(xué)標(biāo)志物，特別是血清HBV pgRNA 與HBcrAg 的檢測給予了高度關(guān)注，但并未推薦臨床應(yīng)用，可能與HBV pgRNA 研究數(shù)據(jù)少、其血清中水平低及尚未形成統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)等因素相關(guān)。本研究觀察了恩替卡韋治療的 CHB 患者血清 HBV pgRNA、HBcrAg 的動(dòng)態(tài)水平表達(dá)變化，并分析了血清HBV pgRNA、HBcrAg 與CHB 患者病情之間的關(guān)系，血清HBV pgRNA、HB-crAg 與HBV DNA、HBsAg、HBeAg 之間的相關(guān)性，為血清HBV pgRNA、HBcrAg 檢測在抗病毒藥物治療效果評估及停藥時(shí)機(jī)選擇中的應(yīng)用提供更多研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020年6月—2021年10月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科門診或住院部就診的初次使用恩替卡韋抗HBV 治療并隨訪48 周的CHB 患者 105 例，男 60 例、女 45 例，年齡 34～72 歲。其中CHB 輕度 40 例、CHB 中度 35 例、CHB 重度 30 例，HBeAg（ +）51 例、HBeAg（-）54 例。CHB 患者診斷參照2019 年版《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行［9］。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷均符合2019年版“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標(biāo)準(zhǔn)；知情同意；均在6 個(gè)月內(nèi)未行免疫調(diào)節(jié)與抗HBV治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嗜/非嗜肝病毒感染及其他原因所致肝組織炎癥；合并其他疾病。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清HBV pgRNA 的檢測 CHB 患者初次治療前、治療12 周、治療24 周、治療48 周時(shí)采集患者上午8：00時(shí)空腹靜脈血標(biāo)本3 mL，置于肝素抗凝管內(nèi)，并在 6 h 內(nèi)以 1 000 g/min 離心 15 min 后留取其上清液，置于-80 ℃冰箱保存。HBV pgRNA 水平采用PCR 定量檢測試劑盒（湖南圣湘生物科技有限公司）。使用病毒RNA 提取試劑盒提取血清中的HBV RNA 粗品，再對提取到的HBV RNA 粗品進(jìn)行純化，然后再進(jìn)行HBV RNA 反轉(zhuǎn)錄，最終檢測出HBV pgRNA水平。

1.3 血清HBcrAg水平的檢測 樣本采集及保存同HBV pgRNA。將待測樣本及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，依次進(jìn)行加樣、溫育、洗滌、加入酶標(biāo)試劑、溫育、洗滌、加入顯色劑、加終止液，再測量各孔的吸光度（OD值），運(yùn)用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的水平，再乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品實(shí)際水平。

1.4 血清 HBV DNA、HBsAg、HBeAg 資料的收集從患者臨床病例中收集CHB 患者治療前、治療12周、治療24 周、治療48 周時(shí)血清 HBV DNA、HBsAg、HBeAg等數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s 表示，比較采用t 檢驗(yàn)；多組間計(jì)量資料比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)。非正態(tài)計(jì)量資料采用M（IQR）表示，比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB 患者治療前后血清HBV pgRNA、HB-crAg、HBsAg、HBV DNA 水平變化 CHB 組患者在治 療 第 0、12、24、48 周 時(shí) HBV pgRNA 分 別 為（1.41 ± 0.13）、（1.33 ± 0.18）、（1.31 ± 0.94）、（1.27 ± 0.13）log10copies/mL，HBcrAg 分 別 為（2.34 ± 0.16）、（2.05 ± 0.32）、（1.98 ± 0.38）、（1.88 ± 0.57）log10 U/L，HBsAg 分 別 為（4.19 ±0.74）、（3.06 ± 0.40）、（2.47 ± 0.58）、（1.62 ±1.16）log10 IU/mL，HBV DNA 分 別 為 （6.89 ±0.96）、（4.19 ± 0.52）、（2.54 ± 0.49）、（1.35 ±0.20）log10copies/mL。 CHB 組患者在治療第 12周、第24周、第48周時(shí)HBV pgRNA、HBcrAg、HBsAg及HBV DNA 水平較治療前下降（P＜0.05）。CHB 患者血清 HBV pgRNA、HBcrAg、HBsAg、HBV DNA 分別在治療各時(shí)段間比較，F(xiàn) 分別為12.278、23.799、120.501、675.802，P 均＜0.05，進(jìn)一步各時(shí)間段間比較，P均＜0.05。

HBeAg（+）的CHB 患者中，治療第0、12、24、48周時(shí) HBV pgRNA 分別為（1.51 ± 0.06）、（1.38 ±0.07）、（1.34 ± 0.08）、（1.29 ± 0.08）log10copies/mL，HBcrAg 分 別 為（2.36 ± 0.18）、（2.14 ±0.40）、（1.99 ± 0.41）、（1.89 ± 0.44）log10 U/L，HBeAg（-）的 CHB 患者中，治療第 0、12、24、48 周時(shí)HBV pgRNA 分別為（1.34 ± 0.13）、（1.29 ± 0.07）、（1.29 ± 0.09）、（1.25 ± 0.04）log10copies/mL，HB-crAg 分別為（2.33 ± 0.14）、（1.99 ± 0.27）、（1.97 ±0.19）、（1.87 ± 0.33）log10copies/mL，治療前，與HBeAg（-）的 CHB 患者比較，HBeAg（+）的 CHB 患者HBV pgRNA、HBcrAg 水平高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組HBV pgRNA、HBcrAg 水平均下降（P＜0.05），以 HBeAg（ + ）CHB 組為著（P＜0.05）。

2.2 血清HBV pgRNA、HBcrAg 水平與 CHB 患者病情的關(guān)系 治療前，CHB 輕度、中度、重度患者HBV pgRNA 分 別 為（1.43 ± 0.10）、（1.32 ± 0.16）、（1.20 ± 0.10 ）log10copies/mL，HBcrAg 分 別 為（2.41 ± 0.18）、（2.32 ± 0.29）、（2.19 ± 0.16）log10 U/L。隨著病情程度加重，CHB 患者血清HBV pgRNA 及HBcrAg 水平下降（F 分別為 32.692、9.162，P 均＜0.05），CHB 輕度患者血清 HBV pgRNA 水平較 CHB中度及 CHB 重度患者高（P 均＜0.05）。血清 HBV pgRNA、HBcrAg水平與CHB患者病情程度呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.796、-0.670，P均＜0.05）。

2.3 CHB 患者血清 HBV pgRNA、HBcrAg 與 HBV DNA、HBsAg 水平間相關(guān)性分析 治療前CHB 患者血 清 HBV pgRNA 水 平 與 HBcrAg、HBsAg 及 HBV DNA 水平呈正相關(guān)（r分別為0.620、0.729、0.720，P均＜0.05）；血清 HBcrAg 水平與 HBsAg 及 HBV DNA水平呈正相關(guān)（r 分別為 0.880、0.694，P 均＜0.05）。治療后CHB 患者血清HBV pgRNA 水平與HBcrAg、HBsAg 及HBV DNA 水平呈正相關(guān)（r 分別為0.881、0.641、0.600，P 均＜0.05）；血清HBcrAg 水平與HB-sAg 及 HBV DNA 水平呈正相關(guān)（r 分別為 0.838、0.688，P均＜0.05）。

3 討論

德國學(xué)者 KOCK［10］在 1996 年從 CHB 患者血清中首次檢出HBV pgRNA后，即成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，有關(guān)HBV pgRNA 的報(bào)道也相繼出現(xiàn)。TANAKA等［11］采用蔗糖梯度離心法檢出了HBV pgRNA 等結(jié)構(gòu)，確認(rèn)了乙肝病毒顆粒中的核心成分是HBV pgRNA。在以HBV cccDNA 為模板轉(zhuǎn)錄出的HBV pgRNA 在逆轉(zhuǎn)錄過程中被降解，同時(shí)血清中HBV pgRNA 在NAs 等藥物作用下對逆轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生了抑制作用，CHB 患者血清HBV pgRNA 呈現(xiàn)出低水平表達(dá)。HBV復(fù)制的初始環(huán)節(jié)是以HBV cccDNA 為模板進(jìn)行HBV pgRNA 逆轉(zhuǎn)錄，血清HBV pgRNA 是肝細(xì)胞中的pgRNA 在逆轉(zhuǎn)錄前直接獲得包膜釋放入血所致。HBV cccDNA 持續(xù)表達(dá)是HBV持續(xù)復(fù)制和復(fù)發(fā)的根源，目前的抗HBV 治療尚不能完全清除CHB 患者肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA，即使CHB 患者血清中HBV DNA、HBsAg 消失，肝細(xì)胞核中仍有不同水平的HBV cccDNA 表達(dá)，肝細(xì)胞核內(nèi)只要有HBV cccDNA 表達(dá)就可致HBV 相關(guān)肝病患者病情復(fù)發(fā)與HBV 復(fù)制，這是HBV 相關(guān)性肝病患者療程長，停藥后易復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，只有實(shí)現(xiàn)HBV cccDNA 零表達(dá)才是CHB 等肝病患者HBV 被徹底清除的核心目標(biāo)［12］，但HBV cccDNA 僅在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，需創(chuàng)傷性地通過活檢肝組織來檢測，另外，HBV cccDNA 在肝內(nèi)表達(dá)呈不均勻分布，HBV rcDNA 在肝組織穿刺活檢中對HBV cccDNA 的特異性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致在臨床中難以廣泛地開展對HBV cccDNA 水平檢測。需尋找新的血清標(biāo)志物來間接地反映肝組織中HBV cccDNA 水平。研究［13］發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞中 HBV pgRNA在逆轉(zhuǎn)錄之前可直接獲得包膜進(jìn)行包裝后從肝細(xì)胞中釋放入血而獲得血清HBV pgRNA，即“HBV pgRNA 病毒樣顆?！薄Ｍ瑫r(shí)研究［14］發(fā)現(xiàn)，血清 HBV pgRNA 和和HBcrAg 水平檢測對反映HBV cccDNA水平、評價(jià)抗HBV 療效、選擇停藥時(shí)機(jī)、預(yù)測停藥后疾病復(fù)發(fā)及HCC 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等方面可能具有潛在臨床價(jià)值。

目前臨床上主要以HBV DNA、HBsAg 消失等作為判定CHB 患者病毒學(xué)應(yīng)答情況、停藥指征的指標(biāo)，但仍有部分CHB 患者病情復(fù)發(fā)，表明CHB 患者肝臟中HBV cccDNA 并沒有被清除或轉(zhuǎn)錄處于沉默狀態(tài)。近年研究［14］發(fā)現(xiàn)，血清 HBV pgRNA 和HBcrAg 水平可反映HBV cccDNA 水平。在本研究中，CHB 組患者在治療第 12、24、48 周時(shí)血清 HBV pgRNA、HBcrAg、HBsAg 及 HBV DNA 水平較治療前下降，隨時(shí)間的延長其下降速度趨緩，這與HBsAg、HBV DNA 下降趨勢相同，說明血清HBV pgRNA、HBcrAg 可能可以作為評價(jià)抗病毒療效的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CHB 患者血清HBV pgRNA 水平、HBcrAg 水平與血清 HBV DNA、HBsAg 在治療前初期和治療后有明顯相關(guān)性，進(jìn)一步說明血清HBV pgRNA、HBcrAg 可能可預(yù)測抗病毒藥物的病毒學(xué)應(yīng)答情況。同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，HBeAg 的表達(dá)狀況不同，循環(huán)血中HBV pgRNA 和HBcrAg水平也不相同。治療前，與HBeAg（-）的CHB 患者比較，HBeAg（+）的 CHB 患者 HBV pgRNA 水平高，HBcrAg 水平也高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在治療后，兩組HBV pgRNA、HBcrAg 水平均呈下降趨勢，HBeAg（ + ）CHB 組明顯，與文獻(xiàn)［15］報(bào)道結(jié)果一致。HBeAg（-）的CHB 患者常伴隨HBV cccDNA 水平降低，提示HBV DNA 復(fù)制程度降低［16］。由此認(rèn)為，在治療過程中，肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA 的轉(zhuǎn)錄活性下降，導(dǎo)致血清中HBV pgRNA 水平、HBcrAg 水平逐漸降低，提示血清HBV pgRNA 和HBcrAg水平變化將可能作為反映HBV cccDNA 水平、預(yù)測HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換等方面的重要參考指標(biāo)。

本研究顯示，隨病情程度加重，CHB 患者外周血中HBV pgRNA、HBcrAg 水平逐漸下降，CHB 輕度組血清HBV pgRNA 水平較CHB 中度及CHB 重度組高；HBV pgRNA、HBcrAg 水平與CHB 病情程度呈負(fù)相關(guān)系，與魯鳳民等［17-18］研究結(jié)果相近。隨著CHB患者病情進(jìn)展，HBV DNA 水平低表達(dá)，可能原因是循環(huán)血中的游離HBV DNA 進(jìn)入肝細(xì)胞核，并與肝細(xì)胞核整合；同時(shí)CHB 患者體內(nèi)細(xì)胞免疫與體液免疫增強(qiáng)，對CHB 患者血清游離HBV DNA 的清除作用隨病程延長及體內(nèi)免疫功能增強(qiáng)而增強(qiáng)，從而導(dǎo)致血中游離HBV DNA 水平降低；另外，隨著CHB 患者病情加重其循環(huán)血中HBsAg、HBeAg水平下調(diào)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了針對HBsAg 的保護(hù)性抗體，激活后的免疫系統(tǒng)在清除HBV 的同時(shí)，HBV 復(fù)制能力與水平下調(diào)，HBsAg、HBeAg 水平也隨之下降，其相應(yīng)的HBV pgRNA 及HBcrAg 水平也出現(xiàn)明顯下調(diào)。說明血清HBV pgRNA及HBcrAg水平可能可作為反映CHB患者病情的指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

在抗HBV 治療過程中，患者血清HBV pgRNA水平、HBcrAg 水平隨著治療時(shí)間的延長呈下降趨勢，隨時(shí)間的延長其下降速度趨緩，這與HBsAg、HBV DNA 也呈下降趨勢相同，且患者血清HBV pgRNA 水平、HBcrAg 水平與血清 HBV DNA、HBsAg在治療前初期和治療后有明顯相關(guān)性，表明血清HBV pgRNA、HBcrAg 可能與HBsAg、HBV DNA 一樣可預(yù)測抗HBV 療效、進(jìn)一步指導(dǎo)抗病毒藥停藥時(shí)間。

綜上所述，CHB 患者血清HBV pgRNA、HBcrAg水平隨恩替卡韋治療療程延長呈下降趨勢，HBeAg（+）的CHB 患者下降更明顯；血清HBV pgRNA、HBcrAg 水平與患者病情程度及HBsAg、HBV DNA水平有關(guān)。目前有關(guān)如何確定CHB 患者治療終點(diǎn)及何時(shí)安全停藥是一個(gè)極具爭議的臨床問題。尋找新的評價(jià)CHB 患者抗HBV 完全應(yīng)答的血清學(xué)標(biāo)志物以反映cccDNA 的存在及水平，為接受抗HBV 治療選擇治療終點(diǎn)是一項(xiàng)艱巨性工作。HBV pgRNA、HBcrAg 或許可以成為CHB 抗HBV 藥物的療效評估及治療終點(diǎn)選擇的指標(biāo)。