魯曉峰 孫海龍* 杜國棟 徐樹廣

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，興城 125100；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/沈陽市北方果樹栽培與生理生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110866）

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1 引言

乙草胺是選擇性芽前處理除草劑，通過進(jìn)入作物根圍土壤，經(jīng)胚芽鞘或下胚軸吸收，吸收后向上傳導(dǎo)，阻礙蛋白質(zhì)合成而抑制細(xì)胞生長，使雜草幼芽、幼根生長停止，通常通過觀察植物根系生理功能的影響，表征除草劑脅迫對根系發(fā)育的傷害程度[1]。Ghazi-Khansari M 等研究發(fā)現(xiàn)，利用草甘膦處理后，毛桃根系呈現(xiàn)出顏色變深、須根變短、變少等現(xiàn)象，說明除草劑脅迫對毛桃根系生長發(fā)育有較大傷害[2]。根系的活力直接影響植株整體的生長發(fā)育，是植株幼苗發(fā)育過程中的重要生理指標(biāo)。李亞東等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度乙氧氟草醚、二甲戊靈、仲丁靈明顯抑制棉花的根系活力，而五氟磺草胺即使低濃度時，對棉花的根系活力也表現(xiàn)出嚴(yán)重的抑制效果[3]。在正常生理狀態(tài)下，植物組織中的ROS 產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)[4]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，植株體內(nèi)會產(chǎn)生過量ROS，引起細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷，引起膜脂過氧化物產(chǎn)物（MDA）激增[5-6]。土壤中除草劑西草凈的含量達(dá)到0.8～8.0 mg kg-1時，小麥根系中活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，對根系細(xì)胞膜脂造成損傷[7]。且研究指出，外源施加除草劑丙酯草醚和丁草胺，均能不同程度破壞小麥、油菜和大麥體內(nèi)的保護(hù)性酶活性，使植株體內(nèi)的膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量提高[8-9]。溫銀元等人研究發(fā)現(xiàn)，受到除草劑撲草凈脅迫后，西府海棠幼苗根系中抗氧化酶SOD、POD 等含量均顯著升高，O2-、H2O2含量顯著高于對照[10]；馮煜在研究除草劑谷友和苯·唑·2 甲鈉脅迫下糜子根系抗氧化酶活性變化時也發(fā)現(xiàn)，兩種除草劑均對糜子根系產(chǎn)生藥害，降低糜子根系SOD及POD活性，顯著提高M(jìn)DA含量[11]。

線粒體是根系細(xì)胞主要的細(xì)胞器之一，是感受外界脅迫相關(guān)信號主要部位[12-13]。研究表明，逆境脅迫會導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯變化[14]。如鹽堿脅迫下，番茄根系線粒體內(nèi)H2O2和MDA 含量增加，線粒體膜通透性增大[15]；干旱脅迫條件下，銀沙槐幼苗葉片中線粒體膜完整性低，出現(xiàn)內(nèi)部嵴消失、空泡化等現(xiàn)象[16]；鎘脅迫導(dǎo)致平邑甜茶根系細(xì)胞線粒體電子傳遞受阻，氧自由基含量增加，造成線粒體膜質(zhì)過氧化，細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[17]。同時，線粒體也是產(chǎn)生ROS 的場所，其內(nèi)含有的抗氧化酶對機(jī)體有一定保護(hù)作用[18]。過量的ROS 會引起線粒體膜氧化損傷，導(dǎo)致線粒體的電子傳遞受阻，內(nèi)膜的完整性和呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)艿狡茐?，進(jìn)一步破壞線粒體的抗氧化防御體系，使線粒體O2-產(chǎn)生速率加快、H2O2和MDA含量增高、膜脂過氧化加劇[19]。在植物根系中，線粒體呼吸鏈電子漏是O2-產(chǎn)生的主要來源[20]，而線粒體膜電位的下降又能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子漏的增加[21]。細(xì)胞色素Cyt c 介導(dǎo)的呼吸鏈電子漏旁路，可以清除由于呼吸鏈漏電子而產(chǎn)生的O2-和H2O2。如在外源丁香酸和鄰苯二甲酸脅迫下，根系線粒體膜透性增大，降低膜電位及根系線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素Cyt c/a 含量，線粒體內(nèi)膜細(xì)胞完整性遭到破壞，電子傳遞受阻[22]。徐建興研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，線粒體內(nèi)膜的完整性和呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)艿狡茐?，最終導(dǎo)致線粒體O2-產(chǎn)生速率加快,H2O2和MDA 含量增高[23]。目前，雖然有關(guān)除草劑影響作物生長發(fā)育的研究較多，但對作物根系線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷機(jī)制尚未見詳細(xì)報道。本文以草莓植株為試驗(yàn)材料，研究乙草胺誘發(fā)ROS 對草莓根系線粒體膜電位、膜通透性等生物膜結(jié)構(gòu)和功能的影響，為生產(chǎn)上有效應(yīng)對乙草胺類除草劑脅迫提供借鑒。

2 數(shù)據(jù)采集與處理方法

本試驗(yàn)于2017年5—9月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)苗木良種繁育基地進(jìn)行，供試材料為日本草莓品種‘寶交早生’（Fragaria×ananassaDuch.），取自遼寧省沈陽市沈北新區(qū)國邦園藝農(nóng)場草莓苗木生產(chǎn)基地。濃度99%乙草胺乳油購自吉林美聯(lián)化學(xué)品有限公司。

將‘三葉一心’的草莓假植幼苗定植于內(nèi)徑寬和高分別為16.0 cm和16.0 cm的塑料盆缽中，栽培基質(zhì)為園土∶泥炭土∶有機(jī)肥=3∶1∶1（按體積比均勻混合），每盆裝入基質(zhì)1.25 kg，栽植草莓苗1 株，重復(fù)30次。試驗(yàn)設(shè)乙草胺處理（處理D，乙草胺濃度為使用推薦劑量的10倍，每缽添加濃度0.2 mol·L-1的乙草胺量100 ml）及對照（CK，未施加乙草胺）處理。草莓植株生長30 d 后，選擇長勢基本一致的草莓植株，按試驗(yàn)設(shè)定劑量將除草劑溶液澆灌于盆缽中，對照施入等量的蒸餾水，各處理重復(fù)5次，分別于處理后0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d，取草莓根系前端1～2 cm分生區(qū)部位根段樣品，用于各生理指標(biāo)的測定。

線粒體的提取參照楊玖英[24]的方法；線粒體膜電位測定參照Braidot[25]等方法；線粒體膜通透性的測定參照金超芳[26]等方法；線粒體細(xì)胞色素c/a（Cyt c/a）測定參照Tonshin 及馬懷宇[27]等方法。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定[28]；過氧化氫酶（CAT）活性采用KMnO4滴定法測定[29]；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法測定[30]；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[31]；超氧陰離子（O2-）活性采用羥胺法測定[32]；過氧化氫（H2O2）含量采用四氯化鈦法測定[33]。根系活力采用TTC 法測定[34]，單位為mg·g-1· h-1；質(zhì)膜H+-ATPase 測定參照Blumwald 等[35]方法，單位為μmolPi mg-1protein · h-1。采 用Excel 2010 軟件進(jìn)行原始 數(shù)據(jù)處理，Sigma Plot 10.0軟件繪圖。

3 數(shù)據(jù)樣本描述

3.1 乙草胺處理對草莓根系線粒體膜功能的影響

施加乙草胺后，根系線粒體膜Δψm 呈持續(xù)下降的趨勢，于處理5 d 下降幅度最明顯，較對照下降64.3%，處理后期無明顯變化（圖1-a）。由圖1-b 可知，與對照相比，前期草莓根系線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素Cyt c/a 含量明顯下降，于處理7 d 后達(dá)最低值，后期的線粒體Cyt c/a 變化不明顯。乙草胺處理一定程度上影響了線粒體功能的發(fā)揮，與對照相比，在乙草胺處理5 d 后，根系線粒體膜透性（MPT）明顯上升，比對照上升138.0%，處理9 d 后，線粒體膜的MPT 達(dá)最高值。

圖1 乙草胺對草莓根系線粒體功能的影響Fig.1 Effects of acetochlor on the mitochondrial function of strawberry roots

3.2 乙草胺處理對草莓根系活力、H+ -ATPase及丙二醛含量的影響

由圖2-a 可知，與對照相比，乙草胺處理的草莓根系活力呈現(xiàn)直線下降的趨勢。其中，乙草胺處理9 d 后，根系活力僅分別為對照的54.8%。草莓根系細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPase 活性均呈現(xiàn)明顯下降趨勢（2-b）。丙二醛（MDA）是植物受到逆境脅迫所生成膜質(zhì)過氧化物質(zhì)，其含量常常用來表征植物機(jī)體內(nèi)膜質(zhì)過氧化程度。由圖2-c 可以看出，與對照相比，在除草劑乙草胺脅迫下，根系MDA 含量均呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。

圖2 乙草胺對草莓根系活力、H+-ATPase及丙二醛含量的影響Fig 2 Effects of acetochlor phytotoxicity on root activities,H+-ATPase and MDA in strawberry roots

3.3 乙草胺處理對草莓根系活性氧含量的影響

如圖3-a 所示，隨著處理時間延長，乙草胺處理后草莓根系O2-含量呈逐漸上升趨勢，處理第5 d 后，含量較對照增長14.9%，處理9 d后O2-含量達(dá)到最高值。由圖3-b 可知，與對照相比，隨著脅迫時間的持續(xù)，乙草胺處理后根系H2O2含量呈現(xiàn)上升趨勢，處理7 d后，H2O2含量達(dá)到最高值，較對照增長32.5%。

圖3 乙草胺對草莓根系ROS含量及H2O2含量的影響Fig.3 Effects of acetochlor on reactive oxygen species and hydrogen peroxide contents of strawberry roots

3.4 乙草胺處理對草莓根系保護(hù)性酶活性的影響

由圖4-a 可以看出，隨著除草劑脅迫處理時間增加，草莓根系SOD 活性均呈逐漸上升趨勢。其中，在脅迫處理9 d后，根系SOD活性比對照增長32.8%。如圖4-b 可知，隨乙草胺脅迫處理時間的增加，根系POD 活性呈現(xiàn)上升趨勢，于處理9 d 后達(dá)最高水平。隨著除草劑脅迫程度加重，根系CAT 活性呈先升高后降低的趨勢，于脅迫處理3 d 后達(dá)最高水平，隨后CAT 活性迅速降低，處理9 d 后的CAT 活性達(dá)最低值，較對照降低了17.1%（圖4-c）。

圖4 乙草胺對草莓根系保護(hù)性酶活性的影響Fig.4 Effects of acetochlor on protective enzyme activity of strawberry roots

4 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與驗(yàn)證/評估

整個生長周期在基地溫室內(nèi)進(jìn)行，定期澆灌Hoagland 營養(yǎng)液，補(bǔ)充充足的水分及養(yǎng)分，確保植株正常生長。草莓植株生長30 d后，選擇長勢基本一致的草莓植株，按試驗(yàn)設(shè)定劑量將除草劑溶液澆灌于盆缽中，對照施入等量的蒸餾水，各處理重復(fù)5 次，為防止溶液流失，在培養(yǎng)缽下放置托盤，將外滲的溶液重新澆回培養(yǎng)缽中。分別于處理后0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d，取草莓根系前端1～2 cm 分生區(qū)部位根段樣品，用于各生理指標(biāo)的測定。取樣前制定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的方案，由1 人獨(dú)立完成，保證選取樣品的固定性。測定各指標(biāo)前對所有參與實(shí)驗(yàn)操作的人員進(jìn)行集中培訓(xùn)，盡可能保證參與人員的固定性，減少人為誤差。

5 數(shù)據(jù)價值與使用建議

本研究公開發(fā)表了2017 年乙草胺處理草莓線粒體膜參數(shù)檢測數(shù)據(jù)集，內(nèi)容包括了草莓根系線粒體膜電位、細(xì)胞色素Cyt c/a、膜透性、根系活力及H+-ATPase、丙二醛及活性氧含量等數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可結(jié)合線粒體細(xì)胞器表觀變化，進(jìn)一步確定除草劑脅迫對線粒體結(jié)構(gòu)影響的具體作用位點(diǎn)，可進(jìn)行分子標(biāo)記和相關(guān)基因挖掘，也可結(jié)合其他除草劑對根系線粒體作用程度，篩選出更優(yōu)質(zhì)的除草劑，同時也可為生產(chǎn)上有效應(yīng)對乙草胺類除草劑脅迫提供參考。本數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)可通過國家農(nóng)業(yè)科學(xué)數(shù)據(jù)中心獲取，登錄首頁后點(diǎn)“資源服務(wù)”下的“數(shù)據(jù)服務(wù)”，進(jìn)入相應(yīng)頁面。

數(shù)據(jù)作者分工職責(zé)

魯曉峰（1992—），女，遼寧人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槔钚淤Y源與育種研究。主要承擔(dān)工作：田間調(diào)查、數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制及論文撰寫。

孫海龍（1988—），男，黑龍江人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槔钚淤Y源與育種研究。主要承擔(dān)工作：方案設(shè)計、組織實(shí)施、論文構(gòu)架及質(zhì)量控制。

杜國棟（1971—），男，遼寧人，博士，教授，研究方向?yàn)楣麡湓耘嗯c生理生態(tài)。主要承擔(dān)工作：方案設(shè)計、組織實(shí)施、論文構(gòu)架及質(zhì)量控制。

徐樹廣（1973—），男，遼寧人，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)槔钚淤Y源與育種研究。主要承擔(dān)工作：田間調(diào)查及質(zhì)量控制。