胡國(guó)霞 李津杞 李津嬰 查占山 屠曉華 錢(qián)寶華 楊江存

丙酮酸激酶缺乏癥（pyruvate kinase deficiency，PKD）是糖酵解途徑中最常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳酶缺陷引起的先天性溶血性貧血。丙酮酸激酶缺乏的紅細(xì)胞，變形能力降低容易發(fā)生溶血[1-2]。PKD病情嚴(yán)重程度差異很大，從胎兒水腫伴宮內(nèi)死亡到偶然發(fā)生的無(wú)癥狀完全代償性溶血，再到出生到老年的嚴(yán)重輸血依賴(lài)性貧血甚至危及生命[3]。1961年，VALENTINE首次將PKD描述為遺傳性溶血性貧血的病因[4]。BEUTLER對(duì)白種人PKD的患病率估計(jì)1/20 000～1/300 000，變化范圍較大，這可能是因?yàn)镻KD確診困難且真正患病率尚不清楚[2，5]。PKD診斷標(biāo)準(zhǔn)的組成主要是臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。到目前為止，PKD缺少提示本病的特征性臨床診斷線索。實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠PK活性或基因檢測(cè)。然而，很多因素影響PK活性檢測(cè)，如標(biāo)本儲(chǔ)存條件、白細(xì)胞和血小板污染、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增高、近期輸血、患者的年齡、無(wú)癥狀雜合子攜帶者、PK特殊變異型等影響及PK活性質(zhì)量控制試劑沒(méi)有商業(yè)來(lái)源等；另外，基因檢測(cè)也不能完全確診PKD[6-7]。因此，為了減少PKD漏診和誤診，本文通過(guò)研究40例PKD患者相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以期找出對(duì)PKD有診斷價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

資料與方法

1 研究對(duì)象及診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1 研究對(duì)象：收集自2015年1月～2022年1月在本院做紅細(xì)胞相關(guān)酶檢測(cè)的812例門(mén)診或住院患者，其中PK活性降低的有164例，家系驗(yàn)證確診PKD有23例，基因驗(yàn)證確診PKD有17例，最終確診40例PKD作為患病組，并將32例健康體檢者作為正常對(duì)照組。所有被檢者檢測(cè)血常規(guī)、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.2 PKD診斷標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)包括臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。診斷金標(biāo)準(zhǔn)為特異底物條件下的酶催化活力測(cè)定。PK活力測(cè)值下降并符合臨床診斷2項(xiàng)以上可診斷為PKD；臨床診斷低于2項(xiàng)、實(shí)驗(yàn)室診斷特異性指標(biāo)異常且通過(guò)家系驗(yàn)證后可確診PKD；高度懷疑的疑難病例，溶血全套排查試驗(yàn)仍不能確診，基因檢測(cè)出有明確致病性的PKLR基因突變可確診PKD[8]。

1.3 儀器及試劑： Wright's-Giemsa染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，Ch20BIBF200）、離心機(jī)（Thermo,ST-40R）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（756-UV，上海三分廠生產(chǎn)）、恒溫循環(huán)水槽（DC-0530，寧波新芝科技公司）。儀器按照說(shuō)明書(shū)操作。酶試劑按照《溶血性疾病》相關(guān)要求配制[9]。

2 研究方法

2.1 病史采集：收集患者及父母既往病史和現(xiàn)病史資料。疑難病例標(biāo)本送基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行紅系相關(guān)疾病panel分析并對(duì)家系行Sanger驗(yàn)證。病歷系統(tǒng)資料顯示18例PKD患者PKLR基因有突變，系統(tǒng)登記了12例患者PKLR基因突變類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)12例PKD患者的PKLR基因有9個(gè)位點(diǎn)突變及3個(gè)小片段缺失，部分患者基因檢測(cè)資料未知。

家系（指患者父母）PK活性低下的有41例，其中患者父親PK活性低下有23例，比例56%；患者母親PK活性低下有18個(gè)，比例44%；患者父母親PK活性都低下有16例，比例39%。所有家系中位年齡30歲（19～50歲），PK活性為：（9.5±3.1）U?g-1?Hb-1，G6PD活性為:（10.7±1.7）U?g-1?Hb-1。

2.2 外周血形態(tài)鏡檢：新鮮靜脈血制作血涂片Wright's-Giemsa染色后，鏡檢形態(tài)異常紅細(xì)胞。2015年ICSH（International Committee for Standardization in Haematology）指南指出，正常紅細(xì)胞平均直徑為7.5 μm，呈圓形或略橢圓形，中央淡染區(qū)約占整個(gè)細(xì)胞體積的三分之一，并建議評(píng)估至少1 000個(gè)紅細(xì)胞，以提供具有特定形態(tài)異常細(xì)胞的精確百分比[10]。紅細(xì)胞鏡檢內(nèi)容主要是檢查細(xì)胞大小、體積、染色及是否有異常細(xì)胞。紅細(xì)胞形態(tài)異常包括：紅細(xì)胞大小異常、體積異常、染色異常及有異常細(xì)胞?？稍赑KD患者外周血鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)棘球紅細(xì)胞，又稱(chēng)毛刺細(xì)胞，其形態(tài)特征呈非圓盤(pán)狀，細(xì)胞表面覆蓋著10～30個(gè)短而鈍的突起或針狀物。ICSH建議對(duì)外周血的棘球紅細(xì)胞分級(jí)，棘球紅細(xì)胞＜5%為1級(jí)，5%～20%為2級(jí)，＞20%為3級(jí)。各個(gè)分級(jí)分別代表棘球紅細(xì)胞的增多程度：1級(jí)代表少見(jiàn)/罕見(jiàn)、2級(jí)代表中度多見(jiàn)、3級(jí)代表顯著多見(jiàn)[11]。

2.3 酶活性檢測(cè)：采集肝素抗凝靜脈血5 mL，根據(jù)《溶血性疾病》中相關(guān)要求和ICSH推薦方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)并計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室酶活性參考范圍[9,12-13]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示；計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)估計(jì)PK與PK/G6PD比值之間的相關(guān)性，并使用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析PK/G6PD比值對(duì)PKD的診斷準(zhǔn)確度；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PKD患病組臨床資料和溶血相關(guān)性指標(biāo)及紅細(xì)胞形態(tài)特征 40例PKD患者包括來(lái)自不同家族和同一家族,男女比例1.1∶1。年齡≥18歲的成年患者26例，兒童患者5例，3歲以下嬰幼兒患者9例。患者是否黃疸、脾大、膽結(jié)石、貧血、輸血及切脾，見(jiàn)表1。PKD患者的紅細(xì)胞形態(tài)特征通常不顯著，表現(xiàn)出一定程度的異常細(xì)胞。本次報(bào)道中38例紅細(xì)胞形態(tài)異常PKD患者中，20例有棘球紅細(xì)胞，1級(jí)棘球紅細(xì)胞PKD患者有9例，比例45%，2級(jí)棘球紅細(xì)胞PKD患者有9例，比例45%，3級(jí)棘球紅細(xì)胞PKD患者有2例，比例10%。其中在3級(jí)棘球紅細(xì)胞PKD患者中，有1例PKD患者進(jìn)行了脾切除手術(shù)，脾切除術(shù)前的棘球紅細(xì)胞表現(xiàn)輕微；而脾切除術(shù)后，細(xì)胞深染更為突出、特征性棘球紅細(xì)胞更明顯，見(jiàn)圖1。

表1 PKD患病組臨床資料及紅細(xì)胞形態(tài)

2 PKD患病組與正常對(duì)照組PK/G6PD比值和各血象指標(biāo)的比較 與正常對(duì)照組相比較，PKD患病組的PK/G6PD比值（P＜0.01）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（P=0.03）、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（P=0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度、血小板計(jì)數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。另外，PK/G6PD比值與PK的Pearson相關(guān)系數(shù)是0.913（P＜0.01）。以PKD患者為因變量，以PK活性、PK/G6PD比值為自變量進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示PK活性的曲線下面積（AUC）是0.978（95%CI：0.950～1.005），PK/G6PD的AUC是0.972（95%CI：0.941～1.002），見(jiàn)圖2。散點(diǎn)圖直觀顯示兩組之間的差異，見(jiàn)圖3。說(shuō)明PK/G6PD比值診斷PKD的準(zhǔn)確度與PK活性相當(dāng)。

圖2 PK活性、 PK/G6PD比值診斷PKD的ROC曲線

圖3 PKD患病組與正常對(duì)照組PK活性、PK/G6PD比值散點(diǎn)圖

表2 正常對(duì)照組與PKD患病組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

圖1A 脾切除術(shù)前PKD患者棘球紅細(xì)胞（×1 000倍）

圖1B 脾切除術(shù)后PKD患者棘球紅細(xì)胞（×1 000倍）

3 家系雜合子組與非家系雜合子組PK/G6PD比值、Ret結(jié)果比較 40例PKD患者中有28例進(jìn)行了基因檢測(cè)，PKLR基因突變有18例，包括：家系雜合子有9例，非家系雜合子有7例，純合突變1例，突變意義未明1例。9例家系雜合子患者作為家系雜合子組，7例非家系雜合子患者作為非家系雜合子組。與非家系雜合子組相比較，家系雜合子組的PK/G6PD比值、Ret差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PK活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.12），見(jiàn)表3。

表3 家系雜合子組與非家系雜合子組的PK活性、PK/G6PD、Ret比較

討 論

本次報(bào)道的40例PKD患者65%是成年人，比宋琳、李園等報(bào)告的近50%要高，可能是由于我們收集到的大部分病例都是外院未確診的疑難患者，輕癥疑難患者一般無(wú)癥狀，所以導(dǎo)致就診年齡偏大；另一方面也說(shuō)明年齡越大的PKD患者耐受程度更高[14]。因?yàn)?,3-二磷酸甘油酯（2,3-DPG）使氧解離曲線右移，PKD患者PK酶反應(yīng)上游積累了2,3-DPG，所以盡管貧血，組織的氧送仍有改善，或者Ret增高導(dǎo)致造血代償，使得患者通常有較好的輸血閾值。因此，PKD患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，但如遇急性感染、藥物和懷孕等會(huì)加劇溶血，詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史有助于診斷[15-17]。

對(duì)制作、染色良好的血涂片鏡檢，是診斷紅細(xì)胞溶血性疾病的重要組成部分，也是識(shí)別紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常的基本方法。我們觀察到的20例PKD患者的棘球紅細(xì)胞比正常紅細(xì)胞小，邊界不規(guī)則，缺乏中央淡染區(qū)，僅有50%PKD患者外周血鏡檢中發(fā)現(xiàn)了棘球紅細(xì)胞，說(shuō)明PKD的紅細(xì)胞形態(tài)通常不顯著。在PKD患者中可以觀察到不同比例（3%～30%）的棘球紅細(xì)胞，尤其是脾切除術(shù)后[2]。棘球紅細(xì)胞代表脫水的、耗盡ATP（三磷酸腺苷）的紅細(xì)胞；ATP水平迅速下降，紅細(xì)胞失去鉀和水變得干燥、粘稠、有毛刺，在脾臟中被破壞[18]。雖然棘球紅細(xì)胞是PKD的非特異性特征，但是在脾切除術(shù)后尤其明顯，所以棘球紅細(xì)胞在診斷PKD時(shí)可以起到一定的提示作用[2]。

PKLR基因檢測(cè)適合新生兒或胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷、雜合子攜帶者及輸血后的檢測(cè)等。然而，這種技術(shù)的缺點(diǎn)是所發(fā)現(xiàn)的突變中約有20%尚未歸類(lèi)為致病突變；另外，高達(dá)10%的患者有常規(guī)外顯子測(cè)序未檢測(cè)到的變異體，有一部分PKD患者在PKLR的非編碼區(qū)存在隱性突變，這些突變?cè)诨驕y(cè)試中被遺漏；現(xiàn)有的檢測(cè)工具無(wú)法解釋內(nèi)含子或基因調(diào)控區(qū)變體的臨床意義而且分子檢測(cè)成本高昂、耗時(shí)、費(fèi)力[15，19-20]。鑒于目前PKD診斷的局限性和疾病的廣泛表型特征，需要更敏感的生物標(biāo)志物。對(duì)于PKLR突變意義未明的患者，必須進(jìn)行PK活性測(cè)定。因此，篩選一種方便、快捷、廉價(jià)、敏感的PKD的檢出方法顯得尤為重要。通過(guò)分光光度法測(cè)定紅細(xì)胞裂解物中PK活性，速度相對(duì)較快，只需2～3小時(shí)的實(shí)驗(yàn)室工作就可以完成測(cè)試，而且價(jià)格低廉。

已有研究報(bào)道PK與己糖激酶（hexokinase, HK）比值可以診斷PKD，有極好的敏感性，比PK活性更敏感，甚至比PKLR外顯子序列更敏感地診斷PKD，可校正PK酶活性假陰性患者的測(cè)定結(jié)果,PK與紅細(xì)胞年齡依賴(lài)性酶活性比值可被視為PKD診斷評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)組成部分，從而減少PK活性假陰性的影響因素[19]。PK、G6PD、HK的活性與紅細(xì)胞年齡有關(guān)，如果PK活性正?；虻拖?，但另一個(gè)紅細(xì)胞年齡依賴(lài)性酶活性增加，且PK和此酶的活性比值降低，則提示PK缺乏[1，21]。相比較HK，一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定G6PD活性更常見(jiàn)，故我們選擇PK和G6PD的活性測(cè)定，PK/G6PD活性比值明顯降低應(yīng)高度懷疑是PKD。本研究中40例PKD患者中有38例PK活性低，5例G6PD活性高，37例PK/G6PD比值低，對(duì)PKD的診斷敏感性為93%；且家系雜合子PK/G6PD比值更低，與非家系雜合子相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在高網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的情況下，任何缺陷酶都可能表現(xiàn)出正?；蛟黾拥拿富钚訹19]。而家系雜合子患者的網(wǎng)織紅細(xì)胞升高不明顯，PK/G6PD比值更能反映患者的真實(shí)狀態(tài)。

總之，本研究提示PK/G6PD比值與PK活性具有同等的診斷價(jià)值，尤其適用于網(wǎng)織紅細(xì)胞增高、依賴(lài)輸血的患者。在常規(guī)PK活性篩查中，同時(shí)測(cè)定PK和G6PD活性可以提高PKD診斷率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突