王 爽 陳 偉 黃雪冰 黃路生 夏偉光 李凱潮 王勝林 鄭春田 張亞男

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640)

維生素E(vitamin E)是具有α-生育酚生物學(xué)活性的所有生育酚和生育三烯酚的總稱，因此又被稱為生育酚，也叫抗不育因子[1]。適宜的維生素E水平具有保護(hù)生殖器官、刺激卵巢發(fā)育、增加排卵數(shù)等功能[2]。維生素E還是最主要的抗氧化劑之一，可以減輕家禽在不同應(yīng)激條件下的負(fù)面影響[3-7]。飼糧中維生素E水平不足會(huì)影響家禽機(jī)體抗氧化性能、生殖系統(tǒng)的發(fā)育及繁殖性能。此外，維生素E作為脂溶性維生素，可以在形成卵泡的過(guò)程中沉積于種蛋中，對(duì)胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響。因此，飼糧中的維生素E對(duì)家禽的繁殖及抗氧化性能起到十分重要的作用，而目前關(guān)于飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨繁殖性能及子代生長(zhǎng)性能的影響研究很少。因此，本試驗(yàn)研究了飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨繁殖性能及子代生長(zhǎng)性能、抗氧化性能的影響，探討維生素E在蛋種鴨飼糧中的添加效果，為科學(xué)合理配制蛋種鴨飼糧提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧組成

采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇504只120日齡健康、采食正常的福建龍巖麻鴨蛋種鴨，隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14只鴨，單籠飼養(yǎng)。采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，各組蛋種鴨飼糧維生素E添加水平分別為0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/kg。子代雛鴨飼喂相同的基礎(chǔ)飼糧，維生素E添加水平為20.0 mg/kg?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。蛋種鴨飼養(yǎng)期24周，子代雛鴨飼養(yǎng)期4周。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 血漿和肝臟α-生育酚含量測(cè)定

試驗(yàn)進(jìn)行24周后，每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取2只試驗(yàn)鴨，翅靜脈采血5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心制備血漿。試驗(yàn)鴨采血后放血致死。打開(kāi)腹腔采集肝臟樣品，-80 ℃保存。肝臟樣品凍融后稱取0.1 g，加入0.9 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)冰上勻漿，5 000×g離心5 min取上清液。上清液和血漿α-生育酚含量利用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2.2 卵巢發(fā)育指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)進(jìn)行24周后，每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取2只試驗(yàn)鴨，打開(kāi)腹腔，剪斷卵巢系膜，取出卵巢及輸卵管，分別稱重記錄，分離優(yōu)勢(shì)卵泡(成熟卵泡，充滿卵黃，直徑大于10 mm)，記錄優(yōu)勢(shì)卵泡重量，測(cè)定輸卵管長(zhǎng)度。

1.2.3 蛋種鴨繁殖性能及子代雛鴨生長(zhǎng)性能測(cè)定

試驗(yàn)進(jìn)行24周后，蛋種鴨進(jìn)行人工授精，每3天人工授精1次，每個(gè)重復(fù)選擇50枚合格種蛋進(jìn)行孵化，孵化第7天照蛋，統(tǒng)計(jì)受精率。孵化第28天統(tǒng)計(jì)孵化率、健雛率。出殼后子代雛鴨每個(gè)重復(fù)選取15只進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，飼喂統(tǒng)一的基礎(chǔ)飼糧，自由采食及飲水，統(tǒng)計(jì)28日齡雛鴨體重、平均日增重及料重比。

1.2.4 子代雛鴨血漿和肝臟抗氧化指標(biāo)測(cè)定

每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的28日齡子代雛鴨2只，頸動(dòng)脈采血2 mL，4 ℃、3 000 r/min離心制備血漿。采血后放血致死，打開(kāi)腹腔采集肝臟樣品，-80 ℃保存。測(cè)定血漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，測(cè)定肝臟GSH-Px、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和MDA含量及T-AOC。試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.5 子代雛鴨肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鴨谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1，GPX-1)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)序列，利用Primer 6.0和Oligo 7.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見(jiàn)表2。采用Trizol Reagent提取肝臟總RNA，采用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第1鏈。分別對(duì)肝臟GPX-1、HO-1、Nrf2進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)在MXPro 3500熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和回歸分析，以重復(fù)為試驗(yàn)數(shù)據(jù)單元。方差分析差異顯著時(shí)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨血漿和肝臟α-生育酚含量的影響

如表3所示，飼糧維生素E添加水平顯著影響蛋種鴨血漿和肝臟α-生育酚含量(P<0.05)；隨著飼糧維生素E添加水平的增加，蛋種鴨血漿和肝臟α-生育酚含量呈現(xiàn)線性和二次曲線變化(P<0.05)。飼糧維生素E添加水平(y)與血漿α-生育酚含量(x)回歸方程為y=-0.000 6x2+0.155 6x+11.009(R2=0.365 7)，飼糧維生素E添加水平(y)與肝臟α-生育酚含量(x)回歸方程為y=-0.000 006x2+0.001 4x+0.095 3(R2=0.672 4)。

表3 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨血漿和肝臟α-生育酚含量的影響

2.2 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨卵巢發(fā)育指標(biāo)的影響

如表4所示，飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨卵巢重量、輸卵管長(zhǎng)度和優(yōu)勢(shì)卵泡/卵巢無(wú)顯著影響(P>0.05)，但顯著影響輸卵管重量和優(yōu)勢(shì)卵泡重量(P<0.05)。飼糧維生素添加水平為12.5 mg/kg時(shí)，輸卵管重量和優(yōu)勢(shì)卵泡重量最高。

表4 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨卵巢發(fā)育指標(biāo)的影響

2.3 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨繁殖性能及子代雛鴨生長(zhǎng)性能的影響

如表5所示，飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨種蛋受精率、孵化率及健雛率均無(wú)顯著影響(P>0.05)；飼糧維生素添加水平為12.5 mg/kg時(shí)，孵化率最高。飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨的平均日增重、料重比和28日齡體重均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.4 飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨血漿和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表6所示，飼糧維生素E添加水平顯著影響子代雛鴨血漿和肝臟MDA含量以及血漿GSH-Px活性(P<0.05)；隨著飼糧維生素E添加水平的增加，子代雛鴨血漿和肝臟MDA含量呈現(xiàn)線性變化(P<0.05)，血漿GSH-Px活性呈現(xiàn)二次曲線變化(P<0.05)。飼糧維生素添加水平為25.0 mg/kg時(shí)，子代雛鴨血漿GSH-Px活性最高。飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨血漿T-AOC及肝臟T-AOC和GSH-Px、SOD活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨繁殖性能及子代雛鴨生長(zhǎng)性能的影響

表6 飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨血漿和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

如表7所示，飼糧維生素E添加水平顯著影響子代雛鴨肝臟GPX-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，但對(duì)肝臟HO-1和GPX-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

表7 飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 飼糧維生素E添加水平對(duì)蛋種鴨繁殖性能的影響

本研究中，飼糧維生素E添加水平為12.5 mg/kg時(shí)，輸卵管重量、卵巢重量、優(yōu)勢(shì)卵泡重量均高于其他飼糧維生素E添加水平，受精卵孵化率高于其他飼糧維生素E添加水平。蛋種鴨血漿和肝臟α-生育酚含量隨飼糧維生素E添加水平升高而線性升高，表明血漿和肝臟α-生育酚含量不是影響蛋種鴨繁殖指標(biāo)的直接因素。這一結(jié)果與Xie等[8]對(duì)肉鴨的研究結(jié)果相一致，即北京鴨血漿和肝臟α-生育酚含量隨維生素E添加水平增加而升高，但生長(zhǎng)性能并未線性升高。田河等[1]對(duì)蛋種雞后期的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加50 mg/kg以上維生素E對(duì)入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率、死胎率等沒(méi)有顯著影響。Das等[9]研究表明，飼喂雌性大鼠維生素E缺乏飼糧，大鼠生殖器官的發(fā)育會(huì)受到抑制。Abedi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，添加適宜水平(60 mg/kg)的維生素E會(huì)增加日本鵪鶉三級(jí)卵泡重量，但對(duì)卵巢重量沒(méi)有影響。郭小虎等[11]體外研究表明，適量的維生素E添加水平能夠促進(jìn)蛋種雞卵巢顆粒細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡率。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，即維生素E可調(diào)節(jié)雌激素分泌，從而誘導(dǎo)三酰基甘油和蛋黃主要成分磷脂的產(chǎn)生[12]，還能增強(qiáng)鳥(niǎo)類中卵巢發(fā)育和產(chǎn)生卵巢激素所必需的脂肪酸的生物合成[13-14]。因此，本試驗(yàn)中適宜的維生素E添加水平可以促進(jìn)蛋種鴨的卵巢發(fā)育，保證種蛋胚胎品質(zhì)。

3.2 飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨生長(zhǎng)性能的影響

本研究在孵化試驗(yàn)后選取健康的子代雛鴨按原分組進(jìn)行無(wú)差別飼養(yǎng)，飼糧營(yíng)養(yǎng)水平及養(yǎng)殖環(huán)境保持一致，結(jié)果顯示蛋種鴨飼糧中添加不同水平維生素E對(duì)子代28日齡雛鴨的平均日增重、料重比及28日齡體重均無(wú)顯著影響。表明蛋種鴨飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨生長(zhǎng)性能并未產(chǎn)生影響，或子代飼糧中添加20 mg/kg維生素E可以彌補(bǔ)子代雛鴨出殼前維生素E的不足。任周正[15]研究指出，母源飼糧維生素添加水平可影響子代肉鴨生長(zhǎng)前期的生長(zhǎng)性能，并且能影響子代肉鴨生長(zhǎng)前期對(duì)飼糧維生素的需要量，但并未對(duì)針對(duì)維生素E進(jìn)行單獨(dú)研究。目前針對(duì)母源性維生素E對(duì)子代雛鴨生長(zhǎng)性能的研究極少，本研究尚無(wú)可參考的文獻(xiàn)。本研究中，飼糧維生素E添加水平并未對(duì)子代雛鴨生長(zhǎng)性能產(chǎn)生影響，可能與子代雛鴨飼糧中的維生素E補(bǔ)充有關(guān)。

3.3 飼糧維生素E添加水平對(duì)子代雛鴨抗氧化性能的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧補(bǔ)充維生素E可降低子代雛鴨血漿和肝臟MDA含量，并影響血漿GSH-Px活性。MDA是活性氧與抗氧化防御系統(tǒng)相互作用后的最終產(chǎn)物，MDA含量降低表明飼糧添加維生素E降低了子代雛鴨機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度。以往的研究也獲得了類似的結(jié)果，Lin等[16]在蛋種雞飼糧中補(bǔ)充維生素E可以顯著降低其子代雛雞肝臟和腦中MDA含量。Surai等[17]的研究也表明母體維生素E顯著降低子代雛雞肝臟中MDA含量。雛鴨剛出殼時(shí)其體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完善，因此抗應(yīng)激能力差，可依靠被動(dòng)獲得的母源抗體及抗氧化物質(zhì)來(lái)進(jìn)行免疫保護(hù)，直至它們自身發(fā)育完善，而維生素E作為脂溶性維生素，沉積于種蛋蛋黃中[18]，可直接影響子代雛鴨機(jī)體抗氧化能力[19]，提升抗氧化酶活性。本研究中，子代雛鴨血漿GSH-Px活性及肝臟GPX-1表達(dá)的上調(diào)也可以證明這一點(diǎn)。由此可見(jiàn)，種鴨飼糧中補(bǔ)充維生素E是子代雛鴨獲得最佳抗氧化狀態(tài)，從而保護(hù)它們免受自由基及其代謝產(chǎn)物破壞的有效手段。

4 結(jié) 論

① 蛋種鴨飼糧中添加12.5 mg/kg維生素E可促進(jìn)卵巢發(fā)育，更高的維生素E添加水平對(duì)繁殖性能沒(méi)有顯著的改善作用。

② 蛋種鴨飼糧中添加維生素E對(duì)子代雛鴨生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但可降低子代雛鴨血漿和肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度，提高子代雛鴨機(jī)體抗應(yīng)激水平。