周輝明，林輝鋒*，陳昌銘，莫智龍，林發(fā)壯，張政斌，曹奕鴦，宋彩鳳

(1.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建三明 365051；2.三明市森彩生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，福建三明 365051)

建蘭(Cymbidiumensifolium)隸屬蘭科蘭屬地生蘭，別稱四季蘭、駿河蘭、秋蘭，源自福建，在我國(guó)的東南、華南、西南諸省均有分布，廣泛分布于東南亞和南亞各國(guó)，北至日本[1]。因其一年多次開(kāi)花、花期長(zhǎng)、植株雄健、花姿多變、葉株藝豐富等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的青睞[2]。

建蘭栽培歷史悠久，品種繁多，生產(chǎn)上主要以種子雜交育苗和分株繁殖為主，但傳統(tǒng)分株繁殖存在繁殖率低、周期長(zhǎng)、品種退化；種子雜交育苗周期長(zhǎng)、種苗易分離、品質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題，遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需求。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)于建蘭的種苗繁育已獲得較大進(jìn)展，關(guān)于建蘭種子、莖尖、花芽和側(cè)芽為外植體的組培快繁技術(shù)研究已有報(bào)道[3-6]。在組培過(guò)程中建蘭先誘導(dǎo)形成根狀莖，進(jìn)而進(jìn)行根狀莖增殖分化及壯苗生根。因此，根狀莖的增殖分化及壯苗生根是提高種苗繁殖系數(shù)和質(zhì)量的關(guān)鍵階段[7]。研究表明，不同建蘭品種其組織培養(yǎng)各階段適宜的培養(yǎng)基配方也不同，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比均不一致[6，8-9]?！八募具_(dá)摩”別稱“禪月達(dá)摩”，是原產(chǎn)于漳州與龍巖交接的東家山脈，經(jīng)下山細(xì)選出的金邊建蘭矮種，株型美觀，夏秋兩季開(kāi)花，壯苗一年可以開(kāi)4次花，少則也有2～3次花，觀葉觀花，小巧文雅芳香四溢，葉芽紅色，易花易芽，觀賞價(jià)值奇高。目前未見(jiàn)有建蘭“四季達(dá)摩”的組培研究。筆者以建蘭“四季達(dá)摩”的根狀莖為材料，研究不同基本培養(yǎng)基、添加物對(duì)組培增殖分化以及不同糖濃度、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度對(duì)壯苗生根階段的影響，以期提高種苗繁育速度和質(zhì)量，旨在為其優(yōu)質(zhì)種苗繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料供試材料為由三明市森彩生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供、保存于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種苗繁育中心組培室的“四季達(dá)摩”根狀莖。

1.2 方法

1.2.1不同基本培養(yǎng)基和不同添加物對(duì)根狀莖增殖的影響。將根狀莖接種于①花寶1號(hào)3 g/L+香蕉60 g/L+NAA 2.0 mg/L，②花寶1號(hào)3 g/L+多維片1/4片+NAA 2.0 mg/L，③花寶2號(hào)3 g/L+香蕉60 g/L+NAA 2.0 mg/L，④花寶2號(hào)3 g/L+多維片1/4片+NAA 2.0 mg/L 4種不同增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理15瓶，根狀莖長(zhǎng)度為1.0～1.2 cm，每瓶接種10條，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1)℃。45 d后根據(jù)實(shí)際測(cè)量統(tǒng)計(jì)根狀莖的長(zhǎng)度、直徑和分枝數(shù)。

1.2.2不同基本培養(yǎng)基和不同添加物對(duì)根狀莖分化的影響。將根狀莖接種于①花寶1號(hào)3 g/L+香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，②花寶2號(hào)3 g/L +香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，③1/2MS +香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，④花寶1號(hào)3 g/L +多維片1/4片+香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，⑤花寶2號(hào)3 g/L+多維片1/4片+香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，⑥1/2MS+多維片1/4片+香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L 6種不同分化培養(yǎng)基中，每個(gè)處理15瓶，接種密度為10條增殖的根狀莖，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：光照16 h/d，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，培養(yǎng)溫度(25±1)℃。90 d后根據(jù)實(shí)際統(tǒng)計(jì)分化率。

1.2.3不同糖濃度、NAA濃度、多效唑濃度對(duì)組培壯苗生根的影響。以花寶1號(hào)為基本培養(yǎng)基，采用糖(30、45、60 g/L)、NAA(0.5、1.0、2.0 mg/L)、多效唑(0、10、20 mg/L)3因子3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每處理接苗高2.5 cm左右的小苗30株，60 d后測(cè)量統(tǒng)計(jì)試管苗根體積、假鱗莖大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理使用Excel 2010 軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行新復(fù)極差(SSR)多重比較，分析各因素對(duì)增殖分化和壯苗生根的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基和不同添加物對(duì)根狀莖增殖的影響將建蘭“四季達(dá)摩”誘導(dǎo)出的根狀莖接種于4種不同的增殖培養(yǎng)基，經(jīng)暗處理45 d后，增殖后的根狀莖增長(zhǎng)、變粗，在根狀莖生長(zhǎng)的節(jié)點(diǎn)處誘導(dǎo)出新的根狀莖分枝(圖1C)，且根狀莖的增殖啟動(dòng)時(shí)間因不同增殖培養(yǎng)基而不同。表明經(jīng)暗處理30 d增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)后，③、④號(hào)增殖培養(yǎng)基底部清晰可見(jiàn)增殖生長(zhǎng)的根狀莖，而①、②號(hào)增殖培養(yǎng)基的根狀莖生長(zhǎng)數(shù)較少(圖1A、B)，在增殖45 d后，根狀莖的分枝數(shù)為①號(hào)>②號(hào)>④號(hào)>③號(hào)，根狀莖長(zhǎng)度為③號(hào)>①號(hào)>②號(hào)>④號(hào)，根狀莖直徑為③號(hào)>①號(hào)>④號(hào)>②號(hào)(表1)。與花寶2號(hào)比較，花寶①號(hào)更適合作為根狀莖增殖基本培養(yǎng)基，添加物香蕉可使根狀莖增粗和增長(zhǎng)，而多維片有利于根狀莖分枝數(shù)增加。

注：A.增殖30 d時(shí)根狀莖在培養(yǎng)基表面狀態(tài)；B.增殖30 d時(shí)根狀莖在培養(yǎng)基中狀態(tài)；C.增殖45 d后根狀莖的形態(tài)。左1為①號(hào)培養(yǎng)基；左2為②號(hào)培養(yǎng)基；右2為③號(hào)培養(yǎng)基；右1為④號(hào)培養(yǎng)基Note：A.The state of rhizome on the surface of culture medium after 30 days of proliferation；B.The state of rhizome in culture medium after 30 days of proliferation；C.Morphology of rhizomes after 45 days of proliferation.Left 1 is medium No.1；Left 2 is medium No.2；Right 2 is medium No.3；Right 1.Medium No.4圖1 4種培養(yǎng)基配方對(duì)根狀莖增殖的影響Fig.1 Effect of four media formulations on rhizome proliferation

表1 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)根狀莖增殖的影響

2.2 不同基本培養(yǎng)基和不同添加物對(duì)根狀莖分化的影響將建蘭“四季達(dá)摩”增殖的根狀莖接種于分化培養(yǎng)基中，經(jīng)光照培養(yǎng)90 d后，芽體由根狀莖的頂端分化生長(zhǎng)，不同分化培養(yǎng)基根狀莖的分化率不同，⑤號(hào)分化培養(yǎng)基分化率最高達(dá)64.0%，花寶2號(hào)基本培養(yǎng)基分化率最高，多維片促進(jìn)芽分化(表2)。此外，在根狀莖分化的同時(shí)，根狀莖也會(huì)生長(zhǎng)(圖2)，多維素也可使根狀莖的分枝增多。

表2 不同分化培養(yǎng)基對(duì)根狀莖分化的影響

圖2 部分培養(yǎng)基組合對(duì)根狀莖分化的影響Fig.2 Effect of some medium combinations on rhizome differentiation

2.3 不同糖濃度、NAA濃度、多效唑濃度對(duì)組培壯苗生根的影響由表3可知，當(dāng)壯苗培養(yǎng)基組合為60 g/L糖+2.0 mg/L NAA+10 mg/L 多效唑(處理⑨)和30 g/L糖+1.0 mg/L NAA+10 mg/L多效唑(處理②)時(shí)，其假鱗莖大小高于其他組合；當(dāng)壯苗培養(yǎng)基組合為45 g/L糖+1.0 mg/L NAA+20 mg/L多效唑(處理⑤)時(shí)，其根體積高于其他組合。極差分析結(jié)果表明，在假鱗莖生長(zhǎng)指標(biāo)中，3種影響因素的主次關(guān)系均表現(xiàn)為多效唑>NAA>糖，多效唑濃度之間的關(guān)系為10 mg/L多效唑>20 mg/L多效唑>0 mg/L多效唑。在根體積的指標(biāo)中，3種影響因素的主次關(guān)系為多效唑>NAA>糖，多效唑濃度之間的關(guān)系為20 mg/L多效唑>10 mg/L多效唑>0 mg/L多效唑，說(shuō)明高濃度的多效唑雖有利于根體積的增大，但抑制假鱗莖的生長(zhǎng)，綜合考慮假鱗莖和根體積的生長(zhǎng)情況，有利于組培的壯苗生根培養(yǎng)基為60 g/L糖+1.0 mg/L NAA+10 mg/L 多效唑，其假鱗莖健壯，根較粗(圖3)。

表3 糖、NAA和多效唑?qū)衙缟挠绊?/p>

圖3 60 d后“四季達(dá)摩”組培壯苗生根狀態(tài)Fig.3 Rooting state of “four seasons Dharma” strong seedlings in tissue culture after 60 days

3 討論

植物組織培養(yǎng)是大量繁殖種苗的重要手段，蘭花組培包括誘導(dǎo)、增殖、分化和壯苗生根階段。不同建蘭品種根狀莖的增殖和分化條件不同。在增殖階段，增殖系數(shù)的高低直接決定該品種能不能通過(guò)組培快繁技術(shù)規(guī)模化繁育種苗，而增殖系數(shù)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、有機(jī)添加物和其遺傳背景相關(guān)[10-12]。同時(shí)，由于根狀莖是后續(xù)種苗分化儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)的重要載體，影響種苗分化的速度和質(zhì)量。因此，在提高增殖系數(shù)的同時(shí)，還要考慮根狀莖的質(zhì)量，高麗等[9]研究表明MS培養(yǎng)基對(duì)素心建蘭根狀莖的增殖和生長(zhǎng)最有利。劉翠華等[8]認(rèn)為6-BA對(duì)建蘭‘小桃紅’根狀莖增殖培養(yǎng)影響顯著，葉秀仙等[3]認(rèn)為根狀莖增殖起主要作用的是基本培養(yǎng)基，其次是TDZ，NAA對(duì)增殖的影響較小。該研究結(jié)果表明，花寶1號(hào)更適合作為“四季達(dá)摩”根狀莖增殖的基本培養(yǎng)基，說(shuō)明根狀莖在黑暗條件下增殖時(shí)需要培養(yǎng)基的氮素比例較低。而在比較有機(jī)添加物香蕉泥和多維素對(duì)增殖的影響表明有機(jī)添加物香蕉可使根狀莖增粗和增長(zhǎng)，而多維片有利于根狀莖分枝數(shù)的增加。

在根狀莖分化階段，光照是根狀莖分化的必要條件[13]。增殖后的根狀莖經(jīng)光照，分化的芽體由根狀莖的頂端生長(zhǎng)。在國(guó)蘭根狀莖分化上，存在分化率低的問(wèn)題，這與品種遺傳特性和培養(yǎng)基組成有關(guān)。在建蘭根狀莖分化上，李承秀等[14]研究認(rèn)為建蘭變種根狀莖分化的適宜培養(yǎng)基為MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+10%椰子汁，說(shuō)明建蘭變種分化既要一定量的生長(zhǎng)素、適宜的細(xì)胞分裂素，同時(shí)也需要一定量的附加物。葉秀仙等[3]通過(guò)不同培養(yǎng)基對(duì)根狀莖分化培養(yǎng)的影響，篩選出適宜根狀莖分化培養(yǎng)基配方為改良1號(hào)+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1mg/L+白糖30 g/L，芽分化率達(dá)86.3%。該研究通過(guò)不同基本培養(yǎng)基和多維素添加對(duì)根狀莖分化的影響研究表明，適宜的分化基本培養(yǎng)基為花寶2號(hào)，其能保證芽體分化的氮元素供應(yīng)。而添加的多維片有利于芽的分化，多維片是由多種維生素和微量元素混合而成的固體顆粒，富含全面多種的維生素和礦物質(zhì)成分，可補(bǔ)充植物所需的微量元素和維生素，促進(jìn)根狀莖的分化。

組培分化階段的試管苗生根少和苗較細(xì)弱，在組培苗移栽前須壯苗生根培養(yǎng)。組培苗質(zhì)量直接影響后續(xù)煉苗移栽的成功率和種苗童期[15]，在組培壯苗生根階段，陳春[16]研究表明，有機(jī)添加物香蕉和馬鈴薯對(duì)“嶺南奇蝶”的壯苗生根有明顯的促進(jìn)作用。王濟(jì)紅等[6]研究表明適宜生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2MS+ 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 1.2 mg/L，李麗等[17]認(rèn)為線藝建蘭的壯苗生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.0 mg/L+ GA 0.5 mg/L+香蕉泥100 g/L。鄧櫻等[18]用1/2 MS和花寶1號(hào)誘導(dǎo)原球莖生根分化發(fā)現(xiàn)，花寶1號(hào)+0.2 mg/L NAA+0.6 mg/L IBA有利于建蘭“小金童”生根，但未有生根分化率的統(tǒng)計(jì)。之前研究集中在根數(shù)量和苗高度上，較少關(guān)注假鱗莖大小。假鱗莖是蘭科植物特有的變態(tài)莖，可儲(chǔ)存水分和養(yǎng)分，其大小直接影響蘭花生長(zhǎng)狀況[19]，假鱗莖的大小受培養(yǎng)基組成、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度等因素的影響[15]，該研究以假鱗莖大小、根體積為指標(biāo)，考察不同濃度的糖、NAA、多效唑?qū)M培壯苗生根的影響，結(jié)果表明3種影響因素的主次關(guān)系均為多效唑>NAA>糖，高濃度的多效唑雖有利于根體積的增大，但抑制假鱗莖的生長(zhǎng)，綜合考慮假鱗莖和根體積的生長(zhǎng)情況，有利于組培的壯苗生根的培養(yǎng)基為60 g/L糖+1.0 mg/L NAA+10 mg/L 多效唑，其假鱗莖健壯，根較粗(圖3)。

4 結(jié)論

建蘭“四季達(dá)摩”在增殖階段，適宜的根狀莖增殖培養(yǎng)基為花寶1號(hào)3 g/L+香蕉60 g/L+NAA 2.0 mg/L，花寶1號(hào)宜作為基本培養(yǎng)基，香蕉泥可使根狀莖增粗；在分化階段，適宜的根狀莖分化培養(yǎng)基為花寶2號(hào)3 g/L+多維片1/4片+香蕉60 g/L+NAA 1.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L，多維片有利于芽的分化；在壯苗生根階段，有利于組培壯苗生根的培養(yǎng)基為花寶1號(hào)3 g/L+60 g/L糖+1.0 mg/L NAA+10 mg/L 多效唑，其假鱗莖健壯，根較粗。