周文娟， 邱遠(yuǎn)望， 貝佳炎， 王煜洲， 阮詩(shī)琪， 倪 林,3*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002； 2.福建中益制藥有限公司，福建 泉州 362700； 3.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

油樟隸屬樟科樟屬，為我國(guó)特有樹種[1]，主要分布于長(zhǎng)江以南地區(qū)，近年來在福建有大規(guī)模種植。福建龍巖、三明等地油樟人工林種植面積達(dá)5萬畝，植物資源豐富。油樟枝葉是生產(chǎn)以1，8-桉葉油素為主成分精油的主要原料，常采用水中蒸餾的方式進(jìn)行提取，其間需要利用大量的水，每年產(chǎn)生的油樟水提液可達(dá)5萬噸，對(duì)資源造成嚴(yán)重浪費(fèi)。如何科學(xué)、有效地利用水提液成為了油樟產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。油樟枝葉除精油外，還含有大量的酚酸類、黃酮類、苷類、甾體、三萜、香豆素等成分[2-4]，具有良好的抑菌、抗炎、抗氧化等[5-7]生物活性，深入系統(tǒng)的化學(xué)成分研究有望為水提物的利用和開發(fā)尋找到新途徑。因此，本研究對(duì)油樟水提物的化學(xué)成分進(jìn)行分離、純化和鑒定，并對(duì)化合物進(jìn)行抗肝癌活性測(cè)試，以期為油樟水提物的化學(xué)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

油樟葉樣品，于2019年7月采自福建連城油樟種植基地三年生油樟葉(東經(jīng)116°73′，北緯25°72′)，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)鄒雙全教授鑒定為樟科樟屬油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao ex H.W.Li)，植物標(biāo)本(No. 20200922)留存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥與制藥工程系。

D101大孔吸附樹脂，鄭州和成新材料科技有限公司；GF254薄層層析硅膠、柱色譜硅膠，青島海洋化工有限公司；Sephadex LH-20凝膠，美國(guó)通氣電力公司；PRP-512A樹脂，北京聚福樹脂廠。甲醇、乙腈，色譜純；甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、氘代二甲亞砜和氘代氯仿等試劑，均為市售分析純。5-氟尿嘧啶(5-Fu)，Sigma公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；HepG2肝癌細(xì)胞，上海細(xì)胞微生物研究所。

球形真空濃縮罐；TQ系列多功能提取罐，廈門百盛捷自動(dòng)化設(shè)備有限公司；Bruker AV400(400 MHz)核磁共振儀，德國(guó)布魯克公司；Waters W2695-QDA 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)儀，美國(guó)Waters公司；LC-20AP制備型高效液相色譜(HPLC)儀，日本島津公司；Bio Tek酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司。

1.2 提取分離

陰干切碎的1～3 cm油樟葉小段100.0 kg，投入多功能提取罐，加入8 t蒸餾水，100 ℃水蒸氣蒸餾提取3 h，水提液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附、洗脫，減壓濃縮得1.8 kg浸膏。取1.4 kg浸膏經(jīng)甲醇溶解后，與4.4 kg硅藻土拌樣，依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取相(64.96 g)，乙酸乙酯萃取相(404.48 g)，乙醇萃取相(528.95 g)。

取乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜，利用二氯甲烷/甲醇(體積比為100 ∶0、 30 ∶1、 20 ∶1、 10 ∶1、 8 ∶1、 5 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶1和0 ∶100)進(jìn)行梯度洗脫，得到9個(gè)餾分Fr.1～Fr.9。Fr.3重結(jié)晶得到化合物13(2.0 g)。Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜分離，利用石油醚/乙酸乙酯(體積比為100 ∶0、 20 ∶1、 10 ∶1、 5 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶1和0 ∶100)進(jìn)行梯度洗脫，收集餾分，經(jīng)薄層層析(TLC)分析合并得到13個(gè)餾分(Fr.2.1～Fr.2.13)，其中Fr.2.9重結(jié)晶得到化合物15(4 mg)，F(xiàn)r.2.6經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比20 ∶80)純化得到化合物16(10.0 mg)，F(xiàn)r.2.8經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比30 ∶70)純化得到化合物24(14.2 mg)，F(xiàn)r.2.11經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比30 ∶70)純化得到化合物5(3.0 mg)、17(5.0 mg)、18(3.0 mg)和19(4.3 mg)。Fr.2.12經(jīng)PRP樹脂分離，利用水/乙醇(體積比1 ∶9、 1 ∶3、 1 ∶6、 1 ∶9和0 ∶1)進(jìn)行梯度洗脫，收集餾分，經(jīng)TLC分析合并得到6個(gè)餾分(Fr.2.12.1～Fr.2.12.6)。Fr.2.12.2經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比35 ∶65)純化得到化合物1(10 mg)、2(10 mg)、14(20 mg)、22(2.7 mg)。Fr. 2.12.5經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比54 ∶46)純化得到化合物3(10 mg)、4(11 mg)。Fr.2.12.3經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比47 ∶53)純化得到化合物6(10 mg)、7(11 mg)。Fr.2.12.4經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比52 ∶48)純化得到化合物8(3.7 mg)、9(5.3 mg)、10(13.8 mg)、11(6.3 mg)、12(3 mg)。Fr.2.12.1經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比25 ∶75)純化得到化合物20(5 mg)、21(12 mg)。餾分Fr.2.13經(jīng)制備HPLC(甲醇/水體積比25 ∶75)純化得到化合物23(5.3 mg)。

1.3 分析測(cè)試方法

1.3.1HPLC分析 Diamonsil C18分析型反相色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動(dòng)相：甲醇(A)，超純水(B)，0 min，10%A，25 min，90%A。PDA紫外檢測(cè)器，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2HPLC制備 SilGreen C18色譜柱(250 mm×20 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇/水，紫外波長(zhǎng)210 nm，流速為8 mL/min。

1.3.3結(jié)構(gòu)鑒定 質(zhì)譜：電噴霧離子(ESI)源，毛細(xì)管電壓為0.8 kV，離子源溫度為600 ℃，荷質(zhì)比掃描范圍100～600。核磁共振：采用氘代二甲基亞砜或氘代氯仿作溶劑，13C NMR和1H NMR分別在400和100 MHz的條件下進(jìn)行掃描。

1.4 抗肝癌活性實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法[8-9]，對(duì)化合物1～5和10～15進(jìn)行了人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性測(cè)定，以5-Fu為陽性對(duì)照藥。在96孔培養(yǎng)板上接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每孔180 μL，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入10 μL不同濃度的藥物，對(duì)照組加入等體積DMSO溶液，空白組加入等體積的蒸餾水，每組設(shè)3個(gè)平行孔，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率(I)，運(yùn)用 SPSS 2020 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

I=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物分離結(jié)果

從油樟葉水提物中分離得到24個(gè)化合物，化合物1～24的結(jié)構(gòu)見圖1。這些化合物分別屬于香豆素類化合物(1～2)、木脂素類化合物(3～10)、黃烷類化合物(11～12)、苯丙素類(19～20)、酚酸類(16～18、23～24)，其它類化合物(13～15、21～22)。除化合物1、3～4、7～8、13和17外，其它化合物均為首次從樟屬植物中分離得到。

圖1 化合物1～24的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-24

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)表征

化合物1：無色針狀結(jié)晶(甲醇)，分子式C10H8O4，m.p. 201～203 ℃。ESI-MS(m/z): 191[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.33(1H, br s, 7-OH), 7.90(1H, d,J=9.2 Hz, H- 4), 7.21(1H, s, H-5), 6.77(1H, s, H-8), 6.21(1H, d,J=9.6 Hz, H-3), 3.81(3H, s, 6-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.7(C-2), 151.2(C-7), 149.5(C-9), 145.3(C- 4), 144.5(C- 6), 111.7(C-10), 110.6(C-5), 109.6(C-3), 102.8(C-8), 56.0(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為6-甲氧基-7-羥基香豆素。

化合物2:黃色粉末(甲醇)，分子式C11H10O5，m.p. 149～152 ℃。ESI-MS(m/z): 223[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.89(1H, d,J=9.6 Hz, H- 4), 7.00(1H, s, H-5), 6.20(1H, d,J=9.2 Hz, H-3), 3.81(6H, s, 6, 8-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.3(C-2), 145.7(C- 6), 145.0(C- 4, 9), 143.1(C-7), 134.7(C-8), 111.9(C-3), 110.1(C-10), 104.5(C-5), 60.7(6-OCH3), 56.2(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，因此鑒定該化合物為異嗪皮啶。

化合物3：白色粉末(氯仿)，化學(xué)式C22H26O6，m.p. 123～125 ℃。ESI-MS(m/z): 387[M+H]+。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.76(2H, t,J=8.0 Hz, H-2, 5), 6.68(1H, d,J=2.0 Hz, H-2’), 6.65(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-5’), 6.55(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.48(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6’), 4.12(1H, dd,J=9.2, 7.2 Hz, H-9’a), 3.88(1H, m, H-9’b), 3.86(3H, s, 3-OCH3), 3.85(3H, s, 3’-OCH3), 3.83(3H, s, 4-OCH3), 3.82(3H, s, 4’-OCH3), 2.94(2H, m, H-7a, 7b), 2.60(2H, m, H-7’a, 8’), 2.51(2H, m, H-7’b, 8)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 178.9(C-9), 149.2(C-3), 149.1(C-3’), 148.1(C- 4), 148.0(C- 4’), 130.5(C-1), 130.3(C-1’), 121.5(C- 6), 120.7(C- 6’), 112.4(C-2’), 111.9(C-2’), 111.4(C-5’), 111.2(C-5), 71.4(C-9’), 56.0(3, 3’, 4, 4’-OCH3), 46.7(C-8), 41.2(C-8’), 38.3(C-7), 34.6(C-7’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，因此鑒定該化合物為甲基牛蒡酚。

化合物4：淡黃油狀物(氯仿)，化學(xué)式C20H18O7，b.p. 467～567 ℃。ESI-MS(m/z): 369[M-H]-。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.57(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6’), 7.46(1H, d,J=1.6 Hz, H-2’), 6.96(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.87(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.85(1H, m, H- 6), 6.77(1H, d,J=8.0 Hz, H-5’), 6.06(2H, s, —OCH2O—), 5.95(2H, s, —OCH2O—), 4.65(1H, d,J=8.8 Hz, H-7), 4.28(1H, m, H-9’a), 4.13(1H, m, H-9’b), 4.10(1H, m, H-8’), 3.75(1H, dd,J=10.8, 4.4 Hz, H-9a), 3.65(1H, dd,J=10.8, 1.6 Hz, H-9b), 2.85(1H, m, H-8)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 197.5(C-7’), 152.3(C- 4’), 148.5(C-3), 148.1(C-3’), 147.6(C- 4), 134.5(C-1), 131.5(C-1’), 125.0(C- 6), 120.5(C- 6’), 108.4(C-2’), 108.2(C-2’), 108.2(C-5’), 107.2(C-5), 102.1(—OCH2O—), 101.2(—OCH2O—), 83.8(C-7), 70.9(C-9), 61.4(C-9’), 52.4(C-8), 50.0(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，因此鑒定該化合物為(+)-表芝麻酮。

化合物5：無色塊狀晶體(甲醇)，化學(xué)式C20H20O6，m.p. 164～165 ℃。ESI-MS(m/z): 357[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.94(1H, d,J=1.6 Hz, H-2), 6.89(1H, d,J=8.0 Hz, H-2’), 6.87(1H, d,J=1.6 Hz, H-5), 6.82(1H, dd,J=8.0, 1.6 Hz, H-5’), 6.78(2H, m, H- 6, 6’), 5.95(2H, m, —OCH2O—), 5.60(1H, s, 4’-OH), 4.85(1H, d,J=5.2 Hz, H-7’), 4.42(1H, d,J=7.2 Hz, H-7), 4.11(1H, d,J=9.2 Hz, H-9’a), 3.91(3H, s, 3’-OCH3), 3.84(2H, m, H-9b, 9’b), 3.31(2H, m, H-9a, 8’), 2.87(1H, m, H-8)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 148.1(C-3’), 147.3(C- 4), 146.5(C-3), 144.7(C- 4’), 135.2(C-1), 130.4(C-1’), 119.7(C- 6), 118.5(C- 6’), 114.4(C-2), 108.4(C-5), 108.3(C-5’), 106.7(C-2’), 101.2(—OCH2O—), 87.8(C-7), 82.2(C-7’), 71.1(C-9’), 69.9(C-9), 56.1(3’-OCH3), 54.7(C-8), 50.2(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，因此鑒定該化合物為(7R,7’S,8R,8’R)-3,4-亞甲二氧基-3’-甲氧基- 4’-羥基-7,9’：7’,9-雙環(huán)氧木脂烷。

化合物6：白色粉末(甲醇)，化學(xué)式C20H22O6，m.p. 138～139 ℃。ESI-MS(m/z): 359[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ： 8.93(1H, s, 4-OH), 8.89(1H, s, 4’-OH), 6.90(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.88(1H, s, H-2’), 6.76(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.73(2H, d,J=1.2 Hz, H-5’, 6’), 6.72(1H, d,J=8.4 Hz, H-5), 4.75(1H, d,J=6.0 Hz, H-7), 4.29(1H, d,J=6.8 Hz, H-7’), 4.04(1H, dd,J=9.2, 1.2 Hz, H-9’a), 3.76(6H, s, 3,3’-OCH3), 3.73(1H, d,J=6.0 Hz, H-9b), 3.71(1H, d,J=8.4 Hz, H-9’b), 3.17(2H, d,J=4.8 Hz, H-9a, 8’), 3.07(1H, t,J=8.4 Hz, H-8’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.5(C-3), 147.3(C-3’), 146.0(C- 4), 145.3(C- 4’), 132.4(C-1), 129.6(C-1’), 118.7(C- 6), 117.9(C- 6’), 115.2(C-5, 5’), 110.3(C-2), 109.7(C-2’), 87.0(C-7), 81.4(C-7’), 70.3(C-9), 68.9(C-9’), 55.6(3, 3’-OCH3), 54.0(C-8), 49.4(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致,因此鑒定該化合物為(+)-表松脂醇。

化合物7：無色油狀物(甲醇)，化學(xué)式C20H22O6，b.p. 506～606 ℃。ESI-MS(m/z): 359[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.94(2H, s, 4, 4’-OH), 6.89(2H, d,J=1.6 Hz, H-2, 2’), 6.75(2H, dd,J=8.0, 1.6 Hz, H- 6, 6’), 6.73(2H, d,J=8.0 Hz, H-5, 5’), 4.60(2H, d,J=1.6 Hz, H-7, 7’), 4.11(2H, m, H-9), 3.76(6H, s, 3, 3’-OCH3), 3.72(2H, dd,J=9.2, 3.6 Hz, H-9’), 3.03(2H, m, H-8, 8’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.6(C-3, 3’), 146(C- 4, 4’), 132.3(C-1, 1’), 118.7(C- 6, 6’), 115.2(C-2, 2’), 110.4(C-5, 5’), 85.2(C-7, 7’), 70.9(C-9, 9’), 55.6(3, 3’-OCH3), 53.6(C-8, 8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，因此鑒定該化合物為(+)-松脂醇。

化合物8：黃色油狀物(甲醇)，化學(xué)式C21H24O6，b.p. 670～790 ℃。ESI-MS(m/z): 371[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96(1H, br s, 4-OH), 6.92(1H, m, H-2), 6.89(2H, s, H-2’, 5), 6.88(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.75(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6’), 6.72(1H, d,J=8.0 Hz, H-5’), 4.65(1H, d,J=4.0 Hz, H-7), 4.61(1H, d,J=4.0 Hz, H-7’), 4.12(2H, dd,J=9.2, 2.0 Hz, H-9), 3.76(3H, s, 4-OCH3), 3.75(3H, s, 3’-OCH3), 3.73(3H, s, 3-OCH3), 3.04(2H, p,J=3.9 Hz, H-9’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 148.8(C-3’), 148.2(C- 4’), 147.6(C-3), 146.0(C- 4), 133.9(C-1’), 132.2(C-1), 118.7(C- 6), 118.2(C- 6’), 115.2(C-5), 111.6(C-5’), 110.4(C-2), 109.9(C-2’), 85.2(C-7), 85.0(C-7’), 71.1(C-9), 71.0(C-9’), 55.6(3-OCH3), 55.6(4-OCH3), 55.5(3’-OCH3), 53.8(C-8), 53.6(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，因此鑒定該化合物為(+)-松脂素單甲基醚。

化合物9：黃色油狀物(甲醇)，化學(xué)式C22H26O7，b.p. 514～614 ℃。ESI-MS(m/z): 401[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.98(1H, br s, 4-OH), 6.89(1H, dd,J=5.2, 1.6 Hz, H-2), 6.75(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.72(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.64(2H, s, H-2’, 6’), 4.66(1H, d,J=4.4 Hz, H-7), 4.62(1H, d,J=4.4 Hz, H-7’), 4.15(2H, m, H-9a, 9b), 3.77(6H, s, 3,3’-OCH3), 3.76(3H, s, 5-OCH3), 3.75(3H, s, 4-OCH3), 3.63(2H, s, H-9’a, 9’b), 3.04(2H, td,J=4.6, 2.0 Hz, H-8, 8’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 152.9(C-3, 5), 147.6(C-3’), 146.0(C- 4’), 137.3(C- 4), 136.6(C-1), 132.2(C-1’), 118.7(C- 6’), 115.2(C-5’), 110.4(C-2’), 103.1(C-2, 6), 85.2(C-7, 7’), 71.3(C-9), 71.0(C-9’), 60.0(4-OCH3), 55.9(3,5-OCH3), 55.6(3’-OCH3), 53.9(C-8), 53.5(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，因此鑒定該化合物為(+)-O-去甲基木蘭木脂素。

化合物10：白色結(jié)晶性粉末(甲醇)，化學(xué)式C21H24O6，m.p. 133 ℃。ESI-MS(m/z): 371[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.91(1H, s, 4-OH), 6.93(1H, d,J=1.6 Hz, H-2’), 6.89(3H, m, H-2, 5’, 6’), 6.74(2H, d,J=2.0 Hz, H-5, 6), 4.75(1H, d,J=5.6 Hz, H-7’), 4.35(1H, d,J=7.2 Hz, H-7), 4.06(1H, dd,J=9.2, 1.2 Hz, H-9b), 3.76(3H, s, 3’-OCH3), 3.74(3H, s, 4’-OCH3), 3.73(3H, s, 3-OCH3), 3.71(1H, d,J=2.0 Hz, H-9’ b), 3.33(2H, m, H-9a, 8’), 3.09(1H, t,J=8.4 Hz, H-9’a), 2.82(1H, m, H-8)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 148.8(C-3’), 148.3(C-3), 147.3(C- 4’), 145.3(C- 4), 134.0(C-1), 129.6(C-1’), 118.3(C- 6), 117.9(C- 6’), 115.2(C-5), 111.6(C-5’), 109.7(C-2, 2’), 86.8(C-7), 81.4(C-7’), 70.3(C-9), 69.0(C-9’), 55.6(3, 3’, 4’-OCH3), 54.1(C-8), 49.4(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，因此鑒定該化合物為連翹脂素。

化合物11:無色簇狀晶體(甲醇)，化學(xué)式C18H20O6，m.p. 148～150 ℃。ESI-MS(m/z): 331[M-H]-。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.96(3H, s, H-2’, 5’, 6’), 6.12(2H, d,J=10.0 Hz, H- 6, 8), 4.64(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, 3-OH), 4.07(1H, d,J=4.0 Hz, H-3), 3.91(3H, s, 7-OCH3), 3.81(3H, s, 3’-OCH3), 3.75(3H, s, 5-OCH3), 3.08(1H, dd,J=16.4, 2.4 Hz, H- 4a), 2.59(1H, dd,J=16.4, 9.2 Hz, H- 4b)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 159.8(C-7), 158.9(C-5), 155.4(C-9), 147.0(C- 4’), 146.2(C-3’), 129.7(C-1’), 120.8(C- 6’), 114.7(C-5’), 109.6(C-2’), 101.8(C-10), 93.1(C-8), 92.0(C- 6), 82.0(C-2), 68.5(C-3), 56.1(4’-OCH3), 55.7(7-OCH3), 55.5(5-OCH3), 27.8(C- 4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]基本一致，因此鑒定該化合物為(2R, 3S)- 4’-羥基-5, 7, 3’-三甲氧基黃烷-3-醇。

化合物12:白色粉末(甲醇)，化學(xué)式C18H20O6，m.p. 106～107 ℃。ESI-MS(m/z): 331[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.90(1H, s, 4-OH), 7.05(1H, d,J=2.0 Hz, H-2’), 6.85(1H, dd,J=8.4, 2.0 Hz, H- 6’), 6.73(1H, d,J=8.0 Hz, H-5’), 6.12(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 6.06(1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 4.76(1H, d,J=4.4 Hz, 3-OH), 4.07(1H, d,J=4.0 Hz, H-3), 3.75(3H, s, 7-OCH3), 3.74(3H, s, 3’-OCH3), 3.70(3H, s, 5-OCH3), 2.75(1H, dd,J=16.8, 4.4 Hz, H- 4a), 2.57(1H, dd,J=16.8, 4.4 Hz, H- 4b)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 158.9(C-7), 158.7(C-5), 155.6(C-9), 147.0(C- 4’), 145.9(C-3’), 130.4(C-1’), 119.6(C- 6’), 114.8(C-5’), 111.5(C-2’), 101.0(C-10), 93.3(C-8), 91.2(C- 6), 78.3(C-2), 64.5(C-3), 55.6(3’-OCH3), 55.4(7-OCH3), 55.1(5-OCH3), 28.5(C- 4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]基本一致，因此鑒定該化合物為(2S, 3S)- 4’-羥基-5, 7, 3’-三甲氧基黃烷-3-醇。

化合物13：黃色粉末(甲醇)，化學(xué)式C15H10O7，m.p. 314 ℃。ESI-MS(m/z): 303[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.50(1H, s, 5-OH), 10.81(1H, s, 7-OH), 9.39(1H, s, 2-OH), 9.62(1H, br s, 3’-OH), 9.33(1H, s, 4’-OH), 6.41(1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 6.18(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 7.67(1H, d,J=2.2 Hz, H-2’), 7.54(1H, dd,J=2.2, 8.4 Hz, H - 6′), 6.88(1H, d,J=8.5 Hz, H-5’)。與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC對(duì)照，Rf值及顯色行為均一致。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]基本一致，因此鑒定該化合物為槲皮素。

化合物14：無色片狀晶體(甲醇)，化學(xué)式C11H16O3，m.p. 151～153 ℃。ESI-MS(m/z): 195[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 5.78(1H, s, H-7), 5.01(1H, s, 3-OH), 4.08(1H, t,J=4.0 Hz, H-3), 2.29(1H, dt,J=13.2, 2.4 Hz, H- 4a), 1.86(1H, m, H-2a), 1.66(3H, s, —CH3), 1.62(1H, dd,J=13.2, 4.0 Hz, H- 4b), 1.41(1H, dd,J=14.0, 3.6 Hz, H-2b), 1.37(3H, s, —CH3), 1.19(3H, s, —CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 183.1(C- 6), 171.1(C-8), 112.1(C-7), 86.6(C-5), 64.9(C-3), 46.7(C- 4), 45.3(C-2), 35.7(C-1), 30.5(C-9), 26.9(C-11), 26.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]基本一致，故鑒定為黑麥草內(nèi)酯。

化合物15：黃色油狀物(氯仿)，化學(xué)式C8H8O4，b.p. 269～353 ℃。ESI-MS(m/z): 169[M+H]+。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 5.85(2H, s, H-3, 5), 3.82(6H, s, 2, 6-OCH3)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 187.0(C- 4), 176.8(C-1), 157.4(C-2, 6), 107.6(C-3, 5), 56.6(2, 6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]基本一致，因此鑒定該化合物為2, 6-二甲氧基對(duì)苯醌。

化合物16:褐色粉末(甲醇)，化學(xué)式C6H6O2，m.p. 103 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.71(2H, dd,J=5.9, 3.6 Hz, H-2, 6), 6.59(2H, dd,J=5.9, 3.6 Hz, H-1, 5)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.3(C-3, 4), 119.3(C-2, 6), 115.7(C-1, 5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]基本一致，因此鑒定該化合物為鄰苯二酚。

化合物17：白色針狀晶體(甲醇)，化學(xué)式C8H8O4，m.p. 208～210 ℃。ESI-MS(m/z): 167[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.42(2H, H-2, 6), 6.83(1H, d,J=8.7 Hz, H-5), 3.79(3H, s, 3-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 167.5(1-COOH), 151.1(C-3), 147.3(C- 4), 123.6(C-1), 122.0(C- 6), 115.1(C-5), 112.8(C-2), 55.6(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]基本一致，因此鑒定該化合物為香草酸。

化合物18：白色粉末(氯仿)，化學(xué)式C9H12O3，m.p. 40～42 ℃。ESI-MS(m/z): 169[M+H]+。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.87(1H, m, H-2), 6.73(2H, dd,J=6.8, 2.0 Hz, H-5, 6), 3.89(3H, s, 3-OCH3), 3.83(2H, t,J=6.4 Hz, H-7), 2.80(2H, t,J=6.4 Hz, H-8)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 146.7(C- 4), 144.4(C-3), 130.4(C-1), 121.8(C- 6), 114.6(C-2), 111.6(C-5), 64.0(C-8), 56.0(3-OCH3), 39.0(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]基本一致，因此鑒定該化合物為3-甲氧基- 4-羥基苯乙醇。

化合物19：白色粉末(甲醇)，化學(xué)式C10H14O3，m.p. 63～65 ℃。ESI-MS(m/z): 181[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.69(1H, s, 4-OH), 6.72(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.65(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.55(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 4.45(1H, s, 9-OH), 3.73(3H, s, 3-OCH3), 3.39(2H, d,J=8.0 Hz, H-9a, 9b), 2.47(2H, d,J=8.0 Hz, H-7a, 7b), 1.66(2H, m, H-8a, 8b)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.4(C- 4), 144.4(C-3), 133.0(C-1), 120.3(C- 6), 115.3(C-2), 112.5(C-5), 60.2(C-9), 55.5(3-OCH3), 34.7(C-8), 31.3(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]基本一致，因此鑒定該化合物為二氫松柏醇。

化合物20：褐色粉末(甲醇)，化學(xué)式C11H16O4，m.p. 75.5～76.5 ℃。ESI-MS(m/z): 211[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.03(1H, s, 4-OH), 6.42(2H, s, H-2, 6), 4.45(1H, t,J=5.2 Hz, 9-OH), 3.72(6H, s, 3, 5-OCH3), 3.40(2H, td,J=6.6, 5.2 Hz, H-9a, 9b), 2.47(2H, d, H-7a, 7b), 1.68(2H, m, H-8a, 8b)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.9(C-3, 5), 133.4(C- 4), 132.2(C-1), 105.6(C-2, 6), 60.2(C-9), 55.9(3, 5-OCH3), 34.6(C-8), 31.8(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]基本一致，因此鑒定該化合物為3, 5-二甲氧基- 4-羥基苯丙醇。

化合物21：黃色油狀物(甲醇)，化學(xué)式C11H14O5，b.p. 381～471 ℃。ESI-MS(m/z): 227[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.28(2H, s, H-2, 6), 5.09(1H, q,J=6.8 Hz, H-8), 4.71(1H, t,J=5.6 Hz, 4-OH), 3.82(6H, s, 3, 5-OCH3), 1.27(3H, d,J=6.4 Hz, CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 200.0(C-7), 147.6(C-3, 5), 141.1(C- 4), 124.8(C-1), 106.6(C-2, 6), 68.1(C-8), 56.2(3, 5-OCH3), 21.3(CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]基本一致，因此鑒定該化合物為2-羥基-1-(4-羥基-3, 5-二甲氧基苯基) -1-丙酮。

化合物22：白色粉末(甲醇)，化學(xué)式C10H12O5，m.p. 103～107 ℃。ESI-MS(m/z): 211[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.14(2H, s, H-2, 6), 3.81(9H, s, 3, 5, 7-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 166.2(C-7), 147.6(C-3, 5), 140.6(C- 4), 119.2(C-1), 106.7(C-2, 6), 56.0(3,5-OCH3), 51.9(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]基本一致，因此鑒定該化合物為丁香酸甲酯。

化合物23：黃色油狀物(甲醇)，化學(xué)式C10H14O2，b.p. 428 ℃。ESI-MS(m/z): 165[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.20(1H, t,J=7.6 Hz, H-2), 7.16(1H, s, H-3), 7.12(1H, dt,J=7.6, 1.6 Hz, H-5), 7.06(1H, dt,J=7.6, 1.6 Hz, H- 6), 5.19(1H, d,J=4.0 Hz, 1’-OH), 4.17(1H, t,J=5.6 Hz, H-1’), 4.49(1H, m, 2’-OH), 3.41(2H, d,J=5.2 Hz, H-2’a, H-2’b), 2.58(2H, q,J=7.6 Hz, CH2), 1.17(3H, t,J=7.6 Hz, CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 143.5(C-1), 143.2(C- 4), 127.8(C- 6), 126.3(C-5), 125.8(C-2), 123.7(C-3), 74.0(C-1’), 67.6(C-2’), 28.3(CH2), 15.7(CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[32]基本一致，因此鑒定該化合物為1-(4-乙基苯基)-1,2-乙二醇。

化合物24：白色針狀晶體(甲醇)，化學(xué)式C8H8O2，m.p. 132～135 ℃。ESI-MS(m/z): 137[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.81(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 7.81(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 6.83(1H, d,J=2.0 Hz, H-3), 6.81(1H, d,J=2.0 Hz, H-5), 2.44(3H, s, CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 129.1(C-1), 131.5(C-2, 6), 115.9(C-3, 5), 162.7(C- 4), 197.7(C-7), 26.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[33]基本一致，因此鑒定該化合物為對(duì)羥基苯乙酮。

2.3 化合物抗肝癌活性結(jié)果

對(duì)化合物1～5和10～15進(jìn)行人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性測(cè)定，結(jié)果顯示：化合物2、5和13對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2具有中等抑制活性，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為33.43、 107.40和71.43 μmol/L，陽性對(duì)照藥5-Fu的IC50為11.76 μmol/L，其它化合物IC50≥200 μmol/L。與已有的文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究首次報(bào)道化合物5具有較好的抗肝癌活性；化合物2為香豆素類化合物，研究顯示該類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性, 且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易修飾, 是良好的先導(dǎo)化合物；報(bào)道顯示化合物13作用HepG2細(xì)胞24 h的IC50為110.50 μmol/L[34]，與本研究數(shù)據(jù)接近，化合物13為黃酮類化合物，文獻(xiàn)顯示該類化合物對(duì)多種常見的癌癥如肺癌、肝癌、胃癌等均具有顯著的防治效果，在抗腫瘤藥物研究方面表現(xiàn)出較好應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

3.1通過系統(tǒng)深入的化學(xué)成分研究，分離、純化和鑒定油樟葉水提物化合物24個(gè)，包括香豆素類2個(gè)(1～2)，木脂素類8個(gè)(3～10)，黃烷類2個(gè)(11～12)，酚酸類5個(gè)(16～18、23～24)，苯丙素類2個(gè)(19～20)及其它類5個(gè)(13～15、21～22)。除化合物1、3～4、7～8、13和17外，其它化合物均為首次從樟屬植物中分離得到。

3.2化合物2、5和13對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2具有中等抑制活性，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為33.43、 107.40和71.43 μmol/L，化合物5的抗肝癌活性為首次報(bào)道。