李 璇, 潘婷敏, 耿媛霄, 周海玉, 李 健, 高艷清,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學 植物保護學院；陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學 林學院,陜西 楊凌 712100；3.廣西民族大學；廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室；廣西林產(chǎn)化學與工程協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西 南寧 530006)

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展,人們對農(nóng)產(chǎn)品的要求不斷提高,數(shù)量足的同時,質(zhì)量也要高。農(nóng)藥的使用,穩(wěn)定了糧食產(chǎn)量的同時,其弊病隨著時間的流逝也日益突出,眾所周知的“3R”(即：殘留、抗性、再猖獗)問題便是其中一個典型的代表[1]。以天然產(chǎn)物為先導,通過結(jié)構(gòu)修飾或者亞結(jié)構(gòu)拼接將潛在藥效基團引入天然特性結(jié)構(gòu)中,有望開發(fā)出低毒、高效的新型農(nóng)藥[2-3]。松節(jié)油是一種經(jīng)濟、易得的天然可再生資源,主要成分為α-蒎烯和β-蒎烯。近年來,松節(jié)油被用于醫(yī)藥、調(diào)香及香料生產(chǎn)，也合成了許多具有生物活性的農(nóng)用化學產(chǎn)品,比如具有農(nóng)藥增效作用、驅(qū)蟲或引誘活性、除草活性、抗菌殺菌活性的產(chǎn)品等[4]。β-蒎烯是典型的雙環(huán)單萜類化合物,可以提供C10或C5分子骨架,分子結(jié)構(gòu)中還有四元環(huán)、六元環(huán)、環(huán)外雙鍵以及2個手性中心[5],化學性質(zhì)活潑,具有改造為農(nóng)用化學品的潛力[6]。鹵素取代物在現(xiàn)代農(nóng)藥研發(fā)中應(yīng)用廣泛,在已知的農(nóng)藥中,約有三分之二的藥品含有鹵素取代的芳基或雜芳基[7]。鹵素原子或者鹵取代基因其獨特的電負性,作為氫鍵受體,能顯著改變分子的物理化學性質(zhì),從而影響化合物的生物活性,在當今農(nóng)藥領(lǐng)域得以成功應(yīng)用[8]。松節(jié)油作為林源可再生資源,通過對其特有結(jié)構(gòu)進行改性修飾,可促進松節(jié)油的提質(zhì)增效利用[9-12]。本研究通過活性亞甲基拼接原理,將鹵素、酰胺、肟酯、酰腙等具有潛在活性的單元引入β-蒎烯中合成蒎烯基衍生物,并研究化合物在農(nóng)用抑菌劑方面的開發(fā)潛力,以期為松節(jié)油在現(xiàn)代有機農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的高附加值利用提供思路。

1 實 驗

1.1 主要儀器與試劑

AVANCE Ⅲ 核磁共振波譜儀、microTOF-Q Ⅲ電噴霧質(zhì)譜儀,瑞士Bruker公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀,美國Thermo公司；SGW X- 4B顯微熔點儀,上海儀電物理光學儀器有限公司。

β-蒎烯,上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。蘋果腐爛病菌(Valsamali)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)和番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea),3種真菌均來自西北農(nóng)林科技大學陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心。

1.2 蒎烯基酰胺類化合物的合成

將根據(jù)參考文獻[9]制備的50 mmol二氫枯茗酸(化合物3)溶解于二氯甲烷中,滴加15 mL二氯亞砜,40 ℃保溫回流8 h,反應(yīng)完畢,減壓旋蒸除去過量的二氯甲烷和二氯亞砜溶液,得到二氫枯茗酸酰氯(化合物4)[13]。將50 mmol含鹵素的苯胺溶解于二氯甲烷溶液中,60 mmol吡啶為縛酸劑，冰浴下滴加前期制備的50 mmol二氫枯茗酸酰氯,室溫反應(yīng)3 h,采用薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程。所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酸洗、堿洗、水洗至中性后，柱層析(V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶15～1 ∶5)純化,干燥制得蒎烯基酰胺類化合物5a～5g(見圖1)。

5a.R1=4-F; 5b.R1=2,6-F; 5c.R1=4-CF3;5d.R1=2-Br; 5e.R1=3-Br; 5f.R1=4-CH3O; 5g.R1=4-NO2; 6a.R2=2-F; 6b.R2=3-F; 6c.R2=4-F; 6d.R2=2-Cl; 6e.R2=2-Br; 6f.R2=3,5-F; 8a.R3=H; 8b.R3=2-Br; 8c.R3=2-F; 8d.R3=4-Br; 8e.R3=4-NO2; 8f.R3=4-CN圖1 蒎烯基衍生物的合成路線Fig.1 The synthetic routes of β-pinene derivatives

1.3 蒎烯基肟酯類化合物的合成

在50 mL 80%乙醇溶液中,加入50 mmol含鹵素的苯甲醛和鹽酸羥胺,攪拌溶解,分批加入15 g的無水碳酸鈉,將反應(yīng)液的pH值調(diào)至中性,采用TLC監(jiān)測反應(yīng)進程。過濾除去反應(yīng)生成的氯化鈉后，將濾液傾倒入冰水中,即生成大量白色絮狀固體。用無水乙醇重結(jié)晶,即可得到所需的含鹵素苯甲醛肟(化合物10)[14-15]。取48 mmol上述合成的肟,加入25 mL的二氯甲烷溶解后,加入2 g無水硫酸鎂,靜置,過濾除去硫酸鎂固體。用同樣的方法除去二氫枯茗酸中的水，將二氫枯茗酸倒入單口圓底燒瓶中,滴加1 g的二環(huán)己基碳二亞胺,0.4 g的4-二甲胺基吡啶,將除過水的含鹵素苯甲醛肟用滴液漏斗逐滴滴入反應(yīng)液中，采用TLC監(jiān)測反應(yīng)4 h。柱層析(V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶15)提純,干燥制得蒎烯基肟酯類化合物6a～6f(見圖1)。

1.4 蒎烯基酰腙類化合物的合成

將62.5 mmol水合肼和50 mmol碳酸鈉在50 mL四氫呋喃中攪拌溶解后,緩慢滴加前期制備的50 mmol二氫枯茗酸酰氯,室溫反應(yīng)12 h,反應(yīng)完畢后,旋蒸出溶劑,50%乙醇和水80 ℃重結(jié)晶,過濾,干燥得白色粉末二氫枯茗酸酰肼(化合物7)。將20 mmol二氫枯茗酸酰肼和20 mmol醛溶于無水乙醇中,80 ℃回流,采用TLC追蹤反應(yīng)進程[16-18]。反應(yīng)完畢后,冷卻至室溫,析出大量固體,抽濾收集產(chǎn)物,乙醇重結(jié)晶,得二氫枯茗酸酰腙類化合物8a～8f(見圖1)。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

使用KBr壓片法在傅里葉變換紅外光譜儀上進行紅外光譜測定；使用核磁共振波譜儀在400/500 MHz 下測定化合物的1H HMR,試劑為DMSO-d6,以TMS為內(nèi)標；使用電噴霧質(zhì)譜進行化合物相對分子質(zhì)量測定；固體化合物熔點的測定在顯微熔點儀上進行。

1.6 抑菌活性測試

1.6.1含毒培養(yǎng)基的配制 將化合物用二甲基亞砜溶解,配制成質(zhì)量濃度為10 g/L的藥液。根據(jù)參考文獻[9]制成馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基,將100 mL培養(yǎng)基,倒入錐形瓶,再加1 mL藥液,混勻。最后,將含毒培養(yǎng)基倒入直徑為 9 cm的培養(yǎng)皿中,待其凝固。

1.6.2真菌的培養(yǎng) 用直徑為4 mm的打孔器取活化的蘋果腐爛病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉,沿著菌落外圍打一圈菌餅。將菌餅菌絲面朝下依次接種在含毒培養(yǎng)基中央,設(shè)置3個重復,空白對照和陽性對照分別為二甲基亞砜和多菌靈，將接好菌的培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)室中28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.6.3初篩與復篩 采用菌絲生長速率抑制法測試化合物的抑菌活性[19]。觀察菌落大小,若菌落生長至培養(yǎng)皿的2/3大小,則可采用十字交叉法測量，按下式計算抑制率(η)：

η=(dCK-dT)/(dCK-4)×100%

式中：dCK,dT—分別表示空白對照和處理的菌落直徑,mm。

在初篩結(jié)果的基礎(chǔ)上,進行更為精密的毒力測定,將藥液進行梯度稀釋為100、 50、 25、 12.5和6.25 mg/L的一系列含毒培養(yǎng)基，等量的二甲基亞砜溶液為空白對照。每組測3次,計算平均值,采用SPSS軟件計算出半數(shù)有效質(zhì)量濃度(EC50),并作出毒力回歸曲線。

1.7 蒎烯基化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化

采用量子化學計算軟件Gaussian 16對化合物的分子結(jié)構(gòu)進行了幾何優(yōu)化,并計算化合物的最低能量。針對活性較高的化合物8f進行了最低未占用分子軌道(LUMO)、最高未占用分子軌道(HOMO)、電子密度和電荷分布以及靜電勢能的研究,進一步探討鹵素、氰基和硝基等電負性官能團的引入對化合物活性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒎烯基衍生物的結(jié)構(gòu)表征

2.2 抑菌活性研究

3個系列蒎烯基衍生物的抑菌活性初篩結(jié)果列于表1,以廣譜商品殺菌劑多菌靈為陽性對照。在100 mg/L質(zhì)量濃度下,19個化合物對蘋果腐爛病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉均有一定抑菌活性,對蘋果腐爛病菌抑制活性最好。其中,8個化合物對蘋果腐爛病菌的抑制率超過80%,活性最高的化合物5a、5b和8c的抑制率分別為90.6%、 90.3%和90.6%；其次是化合物8a、8b、8d、8e和8f,抑制率分別為88.8%、 85.9%、 87.6%、 82.4%和88.9%。從3個系列化合物對蘋果腐爛病菌的抑菌活性來看,酰腙類化合物(8a～8f)均表現(xiàn)較高的抑菌活性,肟酯類化合物(6a～6f)抑菌活性較低,推測在蒎烯基衍生物的骨架中增加氮原子個數(shù),可能有利于提高化合物的抑菌活性。此外,含氟原子的化合物,如5a、5b、8c對蘋果腐爛病菌的抑制率都在90%以上,表明在苯環(huán)上引入氟原子能顯著提高化合物的活性。

表1 β-蒎烯衍生物對3種農(nóng)業(yè)真菌的抑菌活性(100 mg/L)Table 1 Antifungal activities of β-pinene derivatives on three agricultural fungi(100 mg/L)

在此基礎(chǔ)上,選取8個對蘋果腐爛病菌抑制率在80%以上的化合物進行復篩,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蒎烯基酰胺類衍生物5a、5b,蒎烯基酰腙類衍生物8a～8f對蘋果腐爛病菌具有較好的抑制活性,化合物5a、5b和8b～8f的EC50值范圍在10～20 mg/L之間,其中酰胺類和酰腙類活性較高的化合物5a、5b、8c和8f的抑菌效果見圖2，EC50數(shù)據(jù)見表2。

a.5a,空白對照control(CK); b.5b,CK; c.8c,CK; d.8f,CK; e.5a,25 mg/L; f.5b,25 mg/L; g.8c,25 mg/L; h.8f,25 mg/L; i.5a,100 mg/L; j.5b,100 mg/L; k.8c,100 mg/L; l.8f,100 mg/L圖2 蒎烯基衍生物5a、 5b、 8c和8f對蘋果腐爛病菌的抑菌效果Fig.2 The antifungal effects of β-pinene derivatives 5a,5b,8c and 8f on Valsa mali

表2 蒎烯基衍生物對蘋果腐爛病菌的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of β-pinene derivatives on Valsa mali

續(xù)表2

2.3 化合物8f的能量優(yōu)化

選擇對蘋果腐爛病菌抑制活性較高的化合物8f為代表,通過分析化合物的未占用軌道、電子密度和電荷分布以及靜電勢能圖等量子化學描述符,如圖3所示。

a.LUMO； b.HOMO； c.電子密度和電荷分布electronic density plot； d.靜電勢能圖electrostatic potential energy plot圖3 化合物8f最低能量結(jié)構(gòu)的理論計算Fig.3 Theoretical calculation of the lowest energy structure of compound 8f

初步構(gòu)建出化合物的結(jié)構(gòu)特性與抑菌活性之間的相互關(guān)系。由于鹵素、氰基和硝基等電負性官能團的引入,有利于化合物共軛鍵的穩(wěn)定,能夠提高化合物的電子云密度,并增大極性相互作用,有利于化合物與作用靶標之間的相互作用,因而顯著提高了化合物的活性。

3 結(jié) 論

以β-蒎烯為原料,制備了3系列19種蒎烯基衍生物。通過菌絲生長速率抑制法研究目標化合物對3種常見的農(nóng)業(yè)病原菌的抑制活性,篩選出8種對蘋果腐爛病菌有較好抑菌活性的化合物, EC50值范圍為10～20 mg/L,其中化合物5a和8e的EC50值分別為10.489和10.810 mg/L。通過進一步研究化合物結(jié)構(gòu)與抑菌活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在蒎烯基衍生物中引入氮原子和氟原子有利于提高化合物的抑菌活性。通過對化合物8f的最低能量結(jié)構(gòu)進行理論計算,發(fā)現(xiàn)引入電負性較大的官能團有利于化合物與作用靶標相結(jié)合,從而顯著提高化合物活性。因此，在后續(xù)研究中可選取化合物5a和8e作為先導化合物,引入更多電負性較大的基團,獲得活性更高的化合物,以期為林業(yè)可再生資源松節(jié)油在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的高值化利用提供理論參考。