佘之蘊(yùn)，黃寶瑩，王文敏，沈宏林，蔣 軒，陳滿英，張 娟

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 佛山 528000）

發(fā)酵乳是指以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品。其具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括生物活性蛋白、乳酸菌及其代謝產(chǎn)物[1]，是葉酸、核黃素、硫胺素、煙酸、維生素B族及鈣、鎂、鋅、磷等礦物質(zhì)元素傳遞到人體的理想載體[2-3]。發(fā)酵乳的酸性使鈣離子化，能夠促進(jìn)腸道對鈣的吸收[4-5]。發(fā)酵乳具有多種保健作用，如調(diào)節(jié)腸道菌群[6-8]，預(yù)防和降低糖尿病[9]、心腦血管疾病等慢性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等[10-12]，已成為最受歡迎的乳制品之一[13-15]。酸度是發(fā)酵乳在生產(chǎn)過程中作為發(fā)酵終點(diǎn)的判定標(biāo)準(zhǔn)之一，適宜的酸度可以賦予發(fā)酵乳良好的凝固狀態(tài)。酸度是影響發(fā)酵乳營養(yǎng)價(jià)值、感官品質(zhì)和風(fēng)味等因素的基礎(chǔ)和原因，酸度過高會(huì)影響風(fēng)味和口感，導(dǎo)致乳清析出，感官質(zhì)量下降[16]。GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中規(guī)定，酸度應(yīng)≥70.0°T[17]。因此，酸度控制是企業(yè)最為關(guān)注的問題之一。

近紅外光譜（near-infrared spectroscopy，NIRS）是介于可見光和中紅外光之間的電磁波譜，其波長范圍為780～2 526 nm[18]。近紅外光譜技術(shù)是利用化合物中特定官能團(tuán)引起振動(dòng)造成近紅外吸收峰不同，不同化合物呈現(xiàn)不同的峰值[19-20]，從而對樣品進(jìn)行分析檢測。由于近紅外光譜與有機(jī)分子中含氫基團(tuán)（-OH，-CH，-SH，-NH）振動(dòng)的組合頻與各級(jí)倍頻的吸收一致，近紅外光對這些化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率有特定的吸收峰，如淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪酸、糖類和水分等。通過掃描待測樣品的近紅外光譜，樣品中的分子選擇性地吸收不同頻率的近紅外光，透射出來的近紅外光線就攜帶樣品中有機(jī)物結(jié)構(gòu)和組分的信息。通過檢測器分析透射光或反射光的光密度，就可以對組分進(jìn)行定性或定量檢測[21-22]。

本研究利用近紅外光譜儀采集發(fā)酵乳的近紅外光譜，對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)合電位滴定法測定的酸度值，建立近紅外快速檢測方法，并比較酸度實(shí)測值與模型預(yù)測值的差異性，從而驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。以期對發(fā)酵乳酸度的高效、快速檢測提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含活乳酸菌發(fā)酵乳樣品81批次：市售。其中71批次用于發(fā)酵乳中酸度近紅外光譜采集和模型建立，剩余10批次作為外部驗(yàn)證預(yù)測樣品。

采樣袋（聚乙烯密實(shí)袋，規(guī)格7 cm×5 cm）：市售。

氫氧化鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酚酞：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo ANTARIS Ⅱ近紅外光譜儀（InGaAs檢測器，安裝Result 3數(shù)據(jù)采集軟件和TQ Analyst 8數(shù)據(jù)分析軟件）：賽默飛世爾科技中國有限公司；785DMP自動(dòng)電位滴定儀：瑞士萬通中國有限公司；ML204/02分析天平：梅特勒托利多中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸度測定

按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[23]，采用電位滴定儀法測定樣品的酸度。

1.3.2 近紅外光譜采集

ANTARIS Ⅱ儀器采用Result 3操作系統(tǒng)采集光譜，智能透射方式，以積分球漫透射方式和空氣為背景，設(shè)置分辨率8 cm-1，掃描范圍4 000～10 000 cm-1，掃描次數(shù)為32。使用聚乙烯密封袋（7cm×5cm）采樣12～15 g，采樣后密封并應(yīng)在15 min內(nèi)錄制NIR光譜，為防止乳酸菌數(shù)在常溫條件下發(fā)生變化而影響酸度，每個(gè)樣品重復(fù)測定2次，取其平均光譜。測試過程在溫度（23±2）℃、濕度（50±5）%的恒溫恒濕環(huán)境中進(jìn)行。采用自制透漫射采樣模塊：不銹鋼材質(zhì)，“[”型，長10 cm×寬3 cm×高3 cm，反射凹面經(jīng)鏡面拋光處理，凹面高度1 mm，光程3 mm。采集的光譜數(shù)據(jù)用TQ Analyst 8數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行處理和計(jì)算。

1.3.3 模型的評價(jià)指標(biāo)

為保證模型的預(yù)測結(jié)果與使用國標(biāo)法獲得的實(shí)測值具有較好的一致性，本研究在模型建立和驗(yàn)證過程中使用的評價(jià)指標(biāo)如下：

校正集均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）和預(yù)測集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）：

交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）：

相關(guān)系數(shù)R：

式中：n表示樣品數(shù)；yi表示第i個(gè)樣品使用電位滴定法獲得的實(shí)測值；表示第i個(gè)樣品的近紅外預(yù)測值；表示樣品使用電位滴定法獲得的實(shí)測值的平均值。

RMSEC、RMSEP和RMSECV分別表示校正集、預(yù)測集樣品和內(nèi)部交叉驗(yàn)證時(shí)預(yù)測值和實(shí)測值偏離的大小，其值越小，表示所建模型的預(yù)測精度越大，且RMSEC、RMSEP和RMSECV之間的差異越小，模型的預(yù)測效果就越好。RMSEC、RMSEP和RMSECV的相關(guān)系數(shù)Rc、Rp、Rcv表示樣品參數(shù)指標(biāo)的實(shí)測值和近紅外預(yù)測值之間的相關(guān)程度，其值越接近于1，說明實(shí)測值與近紅外預(yù)測值之間的相關(guān)程度越好。理想狀態(tài)條件下，相關(guān)系數(shù)R的值為1，均方根誤差為0。

1.3.4 近紅外模型建立

將1.3.1酸度實(shí)測值數(shù)據(jù)庫與1.3.2近紅外光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行一一對應(yīng)，以RMSEC、RMSEP、RMSECV及其相關(guān)系數(shù)Rc、Rp、Rcv為評價(jià)指標(biāo)，通過剔除異常數(shù)據(jù)、選擇建模波段、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法、光程類型、數(shù)據(jù)格式、平滑類型等光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理等步驟，建立酸度定量模型，并采用交叉驗(yàn)證法對定量模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證。

1.3.5 近紅外模型的外部驗(yàn)證

獲得最佳定量模型后，按照1.3.1測定未參與建模的10批次樣品的酸度，得出樣品的酸度實(shí)測值，并按1.3.2采集其近紅外光譜信息，將光譜信息導(dǎo)入定量模型，得出樣品的酸度預(yù)測值，對比酸度實(shí)測值和預(yù)測值，參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》，要求兩種方法的相對誤差不超過10%。

2 結(jié)果與分析

2.1 近紅外模型的建立

2.1.1 剔除異常數(shù)據(jù)

采用主成分分析-馬氏距離方法剔去異常樣品，建立發(fā)酵乳酸度的預(yù)測模型，并與未剔除異常樣品建立的預(yù)測模型進(jìn)行比較。

由表1可知，建模時(shí)只采用主成分回歸法（Principal componentregression，PCR），光譜沒有進(jìn)行預(yù)處理，沒有進(jìn)行模型的優(yōu)化，采用主成分分析-馬氏距離法剔去異常樣品所建立的模型相關(guān)系數(shù)和校正集均方差均優(yōu)于未剔除光譜前。

表1 異常數(shù)據(jù)對模型的影響Table 1 Effect of abnormal data on model

采用主成分分析-馬氏距離方法剔除4批次異常數(shù)據(jù)，提高近紅外光譜定量分析的可靠性，以剩余的67批次樣品進(jìn)行建模。發(fā)酵乳樣品的近紅外光譜原始數(shù)據(jù)圖見圖1。發(fā)酵乳中的酸度值主要取決于代謝產(chǎn)物有機(jī)酸的含量，有機(jī)酸含有多個(gè)C-H、O-H基團(tuán)，基頻振動(dòng)400～4 000 cm-1的合頻和倍頻在近紅外光譜區(qū)4 000～12 800 cm-1有吸收，表明試驗(yàn)中對發(fā)酵乳樣品的近紅外光譜采集方法可行且有效。

圖1 發(fā)酵乳樣品的近紅外光譜原始數(shù)據(jù)圖Fig.1 Near infrared spectroscopy original data diagram of fermented milk samples

2.1.2 建模波段選擇

酸度近紅外吸收波長與模型相關(guān)性關(guān)系圖見圖2。通過觀察發(fā)酵乳近紅外原始光譜曲線，可以發(fā)現(xiàn)相似的規(guī)律：光譜性狀具有相似性，但不同樣品由于組成、性狀存在差異，光譜圖稍有不同，其吸收峰位置的差異性不顯著。在近紅外定量分析中，波長優(yōu)化可以簡化模型，剔除不相關(guān)或者非線性變量，提高模型的預(yù)測能力和穩(wěn)定性。獲得近紅外波段光譜信息中的波段范圍為4 000～10 000 cm-1。根據(jù)相關(guān)光譜的相關(guān)性系數(shù)，定量分析波段確定為5 569～5 716 cm-1、5 724～6 403 cm-1、7 197～7 506 cm-1。

圖2 近紅外吸收波長與模型相關(guān)性關(guān)系圖Fig.2 Correlation diagram of near infrared absorption wavelength and model

2.1.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法選擇

近紅外光譜有其自身的缺點(diǎn)，如譜帶較寬，重疊嚴(yán)重，樣品中不同成分的迭加，都會(huì)造成分析過程中的干擾。借助合適的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，可以降低干擾，提高信噪比，有助于提升模型精度和穩(wěn)定性。在近紅外光譜技術(shù)分析中經(jīng)常采用的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法有逐步多元線性回歸法（stepwise multiple linear regression，SMLR）、偏最小二乘法（partial least squares，PLS）、主成分回歸法（principal component regression，PCR）等[21，24]。本試驗(yàn)在建模過程中，以RMSEC、RMSEP及其相關(guān)系數(shù)Rc、Rp為評價(jià)指標(biāo)，比較SMLR、PLS、PCR三種分析方法，結(jié)果見表2。由表2可知，PLS建模方法的RMSEC、RMSEP最小，Rc、Rp最接近1，故PLS為最佳處理方法。

表2 SMLR、PLS、PCR建模方法的RMSEC、RMSEP和Rc、RpTable 2 RMSEC,RMSEP,Rc and Rp of SMLR,PLS,and PCR modeling methods

2.1.4 光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

近紅外儀器的隨機(jī)噪聲和儀器偏差以及樣品背景、散射光等干擾都會(huì)導(dǎo)致光譜偏移或漂移。如果直接使用原始光譜建立模型，會(huì)影響模型的準(zhǔn)確度和精度。適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理能提高模型的預(yù)測性能。建立酸度定量模型時(shí)，預(yù)處理方法包括：（1）光程類型（Pathlength Type）：恒定光程（Constant）、多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate，SNV）等；（2）數(shù)據(jù)格式（Data Format）：原始光譜（Spectrum）、一階導(dǎo)數(shù)（first derivative，1stDer）、二階導(dǎo)數(shù)（second derivative，2ndDer）；（3）平滑類型（Smoothing）：不光滑（no smoothing，NS）、卷積平滑濾波（Savizky-Golay Filter數(shù)據(jù)點(diǎn)為7，3項(xiàng)式平滑濾波，S-G）、Norris導(dǎo)數(shù)平滑濾波（norris derivative filter，ND）等[25-28]。本試驗(yàn)以RMSEC、RMSEP及其相關(guān)系數(shù)Rc、Rp為評價(jià)指標(biāo)，對恒定光程、MSC、SNV、1stDer（S-G）、2nd（S-G）、1st+MSC（S-G）、2nd+MSC（S-G）、1st+SNV（S-G）、2nd+SNV（S-G）分析方法比較，結(jié)果如表3所示。由表3可知，2nd+MSC（S-G）、2nd+SNV（S-G）的RMSEC最小，Rc最接近1，但其RMSEP最大，Rp最小、1st+MSC（S-G）、1st+SNV（S-G）的RMSEC、RMSEP較小，同時(shí)其Rc、Rp較接近1，選擇1st+SNV（S-G）為最佳預(yù)處理方法。

表3 近紅外光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法的RMSEC、RMSEP和Rc、RpTable 3 RMSEC,RMSEP,Rc and Rp of near infrared spectral data preprocessing methods

2.1.5 采用交叉驗(yàn)證法對定量模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證

本試驗(yàn)以樣品的85%作為校正集（calibration）樣品，15%作為驗(yàn)證集（validation）樣品進(jìn)行交叉驗(yàn)證，即以57批次作為校正集樣品，另外的10批次作為驗(yàn)證集樣品，進(jìn)行多變量建立酸度的定量模型，校正集樣品的酸度范圍為55.7～135.0°T，驗(yàn)證集樣品的酸度范圍為58.2～111.3°T。酸度預(yù)測值和實(shí)測值的相關(guān)性關(guān)系見圖3。由圖3可知，Rc和Rp均高于0.9，RMSEC與RMSEP的值很接近，說明模型相關(guān)性好，精確度高。

圖3 發(fā)酵乳中酸度定量模型的預(yù)測值和實(shí)測值的相關(guān)性關(guān)系Fig.3 Correlation between the predicted and measured values of quantitative model of acidity in fermented milk

模型的預(yù)測值和實(shí)測值的相對誤差見圖4。由圖4可知，發(fā)酵乳中酸度定量模型中預(yù)測值和實(shí)測值的相對誤差均＜9%，參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》，符合相對誤差不超過10%的要求。

圖4 發(fā)酵乳中酸度定量模型的預(yù)測值和實(shí)測值的相對誤差Fig.4 Relative error of the predicted and measured values of quantitative model of acidity in fermented milk

十字交叉驗(yàn)證圖（Cross validation）見圖5。由圖5可知，RMSEP和RMSECV數(shù)值相近，說明校正集樣品與驗(yàn)證集樣品都具有代表性，樣品信息提取充分，模型信息擬合充分，模型預(yù)測性好。

圖5 發(fā)酵乳中酸度定量模型的十字交叉驗(yàn)證圖Fig.5 Cross validation diagram of quantitative model of acidity in fermented milk

2.2 近紅外模型的外部驗(yàn)證

為進(jìn)一步考察定量模型的準(zhǔn)確性，利用外部樣品對已獲得的最佳定量模型進(jìn)行了外部驗(yàn)證。

對未參與建模的10批次含活乳酸菌發(fā)酵乳樣品，按照1.3.2電位滴定法測定樣品中酸度實(shí)測值，按1.3.3采集其近紅外光譜信息，將光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入定量模型，得出樣品的酸度預(yù)測值，同時(shí)將酸度實(shí)測值和預(yù)測值對比，分析其誤差是否在允許范圍內(nèi)，要求二者的相對誤差不超過10%，具體結(jié)果見表5。由表5可知，酸度的實(shí)測值和預(yù)測值二者的相對誤差為1.91%～6.76%，10組數(shù)據(jù)的相對誤差都在10%以內(nèi)，均在允許范圍內(nèi)，說明模型具有良好的預(yù)測性能。

表5 發(fā)酵乳酸度的實(shí)測值和預(yù)測值比較Table 5 Comparison of measured and predicted values of acidity in fermented milk

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵乳中酸度實(shí)測值和對應(yīng)采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)建立快速定量模型后，經(jīng)過剔除異常數(shù)據(jù)、光譜波段優(yōu)化、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法優(yōu)選、光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理等步驟建立的酸度定量模型。優(yōu)化后模型的定量光譜區(qū)間段為5569～5716cm-1、5724～6403cm-1、7197～7506cm-1，化學(xué)計(jì)量學(xué)方法采用PLS，光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法為1st+SNV（S-G），其RMSEC、RMSEP、RMSECV分別為3.27、4.39、4.84，相關(guān)系數(shù)Rc、Rp、Rcv分別為0.946 2、0.922 5、0.877 8。經(jīng)外部驗(yàn)證后，該模型酸度預(yù)測值和電位滴定法實(shí)測值的最大相對誤差為6.76%，不超過10%，滿足要求。該定量模型具有快速、高效、準(zhǔn)確、成本低、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，能滿足發(fā)酵乳產(chǎn)品在線質(zhì)量檢驗(yàn)的高效性和及時(shí)性要求。