吳奇霄,余松柏,馬 龍,王紅梅,黃張君*,王松濤,3,沈才洪,3
(1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司,四川 瀘州 646000;2.瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州 646000;3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川 瀘州 646000)
白酒是中國的國酒,承載了重要的文化內(nèi)涵和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。白酒種類繁多,按照釀造工藝和酒體風(fēng)格的不同被行業(yè)內(nèi)分為了12種香型,濃、清、醬和米香型是白酒的4種基礎(chǔ)香型,由這4種香型衍生出了芝麻香、董香、豉香、特香、鳳香、兼香、老白干香、馥郁香型白酒[2]。白酒主要成分是乙醇和水,約占總質(zhì)量的98%,余下2%是各種微量成分,這些微量成分的種類和含量對白酒的品質(zhì)和風(fēng)格至關(guān)重要。迄今為止,白酒中有2 000余種微量成分被鑒定出,主要有酯類、酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、萜烯類、含氮類化合物等[3-4]。其中,酚類化合物在白酒中的含量盡管較低,但其是白酒重要的風(fēng)味組成成分,對白酒的品質(zhì)有著一定的影響。白酒中不揮發(fā)性酚類化合物主要是一些游離態(tài)酚酸類化合物,有香豆酸、阿魏酸、香草酸等[5],為白酒貢獻(xiàn)酸、苦、澀的復(fù)合口感,有助于提升白酒味道的層次感[6]。白酒中揮發(fā)性酚類化合物主要有苯酚、4-甲基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香蘭素等[7-8],這些成分賦予了白酒煙熏香、窖陳香、糧香等香氣特征[9-10]。此外,酚類化合物也是白酒中重要的健康因子,具有抗氧化、抗腫瘤、提升機(jī)體免疫力等功效[11-12]。
白酒中的揮發(fā)性酚類化合物主要使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)進(jìn)行測定。ZHAO D R等[13]使用液液萃取法結(jié)合GC-MS從古井貢酒中檢測到了香蘭素、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚等7種酚類化合物;史冬梅等[7]使用直接進(jìn)樣法結(jié)合GC-MS檢測了103種酒樣中的6種揮發(fā)性酚類化合物。此外,可以使用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測定白酒中揮發(fā)性酚類化合物,但需要有復(fù)雜的前處理過程,尋思穎等[14-15]利用酚類化合物的熒光特性,以β-環(huán)糊精作為手性拆分劑,用搭配熒光檢測器(fluorescence detector,F(xiàn)LD)的高效液相色譜(HPLC-FLD)建立了白酒中苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚等10種揮發(fā)性酚類化合物的測定方法。白酒中不揮發(fā)性酚類化合物的檢測方法主要有HPLC法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatographymass spectrometry,LC-MS)。吳子陽等[5]采用固相萃取結(jié)合HPLC測定了白酒中沒食子酸、香豆酸、丁香酸、原兒茶酸水合物和阿魏酸的含量,其前處理方法較為復(fù)雜;王銀輝等[16]將白酒樣品氮吹處理后,使用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析了酒樣中沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸等7種化合物的含量。為更好地分析多個樣品間的差異,近年來,主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析(cluster analysis,CA)、判別分析(discriminate analysis,DA)等多元統(tǒng)計(jì)方法已用來對白酒香型[17]、產(chǎn)地[18]和基酒年份[19]等信息進(jìn)行分類和判別,成為解析白酒特征重要的分析方法。
本研究建立了利用LC-MS和GC-MS分析白酒中7種不揮發(fā)性和7種揮發(fā)性酚類化合物的測定方法,分析了12種香型38個白酒樣中酚類化合物的含量,運(yùn)用聚類分析和主成分分析對不同香型白酒中酚類化合物種類及含量的差異進(jìn)行分析,為白酒風(fēng)味解析與品質(zhì)研究提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。
38個白酒樣品(濃香型6個、清香型4個、醬香型5個、米香型3個、老白干香型2個、兼香型3個、鳳香型2個、特香型4個、馥郁香型2個、豉香型3個、芝麻香型2個、董香型2個,分別對各酒樣進(jìn)行了編號):市售。
p-羥基苯甲酸、香豆酸、沒食子酸、阿魏酸、4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-甲基苯酚(純度均>99%):上海阿拉丁試劑公司;香草酸、丁香酸和兒茶酚(純度均>98%):上海麥克林生化科技有限公司公司;香蘭素、4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚(純度均>99%):上海源葉生物科技有限公司;苯酚和愈創(chuàng)木酚(純度均>99%):上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;無水乙醇、冰乙酸、甲醇和乙腈(均為色譜純):成都諾爾施科技有限責(zé)任公司。
LC-MS 2020液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC-MS 2030氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀:日本島津公司;DB-WAX氣相色譜柱(60 m×250 μm×0.25 μm)、Polaris C18-A液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm):美國安捷倫科技有限公司;PAL RTC多功能自動進(jìn)樣器:廣州智達(dá)實(shí)驗(yàn)室科技有限公司;N-1300D-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:日本東京理化器械株式會社;ML304T分析天平:瑞士梅特勒-托利多公司;Milli-Q Synergy超純水系統(tǒng):德國默克公司。
1.3.1 白酒中不揮發(fā)性酚類化合物的測定
樣品前處理:精確量取10 mL酒樣,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(水浴溫度55 ℃、真空壓力20 kPa)將酒樣蒸干,加入1 mL甲醇復(fù)溶,過0.22 μm有機(jī)濾膜,得到樣品溶液,待LC-MS進(jìn)樣分析。
LC-MS分析液相色譜條件:安捷倫Polaris C18-A液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm);流動相A為乙腈,流動相B為0.01%乙酸水溶液;梯度洗脫條件:0~17 min(84%A),17~30 min(84%→70% A),30~32 min(70%→84% A),30~34 min(84%A);流速0.6 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫為25 ℃。質(zhì)譜條件:電噴霧離子(electron spray ionization,ESI)源,負(fù)離子模式掃描;脫溶劑管(desolvation line,DL)溫度為250 ℃;加熱模塊溫度為200 ℃;氮?dú)忪F化氣流速為1.5 L/min。定性采用全掃描模式(Full Scan),質(zhì)量掃描范圍100~300 m/z,根據(jù)Scan模式篩選的定量離子,使用選擇離子監(jiān)測(selected ion monitoring,SIM)掃描模式對不揮發(fā)酚類化合物進(jìn)行定量分析。
1.3.2 白酒中揮發(fā)性酚類化合物的測定
樣品前處理:將1.5 mL酒樣過0.22 μm有機(jī)濾膜后置于棕色進(jìn)樣瓶中,待GC-MS進(jìn)樣分析。
氣相色譜條件:DB-WAX色譜柱(60m×250μm×0.25μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣;載氣為氦氣(He)(純度99.999%);流速1.00 mL/min;升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min,以6 ℃/min升溫至230 ℃,保持15 min。質(zhì)譜條件:電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量70 eV;離子源溫度為230 ℃,接口溫度為250 ℃;溶劑延遲10 min。定性采用全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍65~300m/z,掃描時(shí)間為0.2s。定量采用選擇離子監(jiān)測(SIM)掃描模式。
1.3.3 數(shù)據(jù)處理
樣品平行測3次,取平均值。使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,使用Origin 2021軟件繪制熱圖、聚類分析樹狀圖和主成分分析載荷與得分雙重圖。
采用LC-MS和GC-MS的Scan模式對白酒中14種典型酚類化合物進(jìn)行定性分析,每種化合物篩選出3個定性離子,其中響應(yīng)值最高的離子作為定量離子,結(jié)果見表1。
表1 14種酚類化合物的定性及定量離子Table 1 Qualitative and quantitative ions of 14 phenols
由表1可知,不揮發(fā)性酚類化合物沒食子酸、p-羥基苯甲酸、原兒茶酸、丁香酸、香草酸、香豆酸和阿魏酸的定量離子分別是169、153、289、197、167、163和193;揮發(fā)性酚類化合物愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚和香蘭素的定量離子分別是109、138、94、137、107、107和151,其中4-甲基苯酚定性離子為107、108、77,4-乙基苯酚定性離子為107、122、77。將使用SIM對14種酚類化合物進(jìn)行定量分析。
采用外標(biāo)法對酚類化合物進(jìn)行定量分析,結(jié)果見表2。由表2可知,14種酚類化合物線性相關(guān)系數(shù)(R2)均≥0.997,線性關(guān)系良好,檢出限為0.62~6.42 μg/L,定量限為1.44~12.25 μg/L,日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均≤4.11%,日間精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤8.98%,加標(biāo)回收率為86.50%~104.35%,說明該方法的精密度和準(zhǔn)確度較高,能夠滿足白酒中酚類化合物分析的要求。
表2 14種酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢出限、定量限、精密度及加標(biāo)回收率Table 2 Standard curve regression equation,linear range,limits of detection,limits of quantification,precision and recoveries of 14 phenols
38個白酒樣品中酚類化合物含量的測定結(jié)果見表3。
由表3可知,這些酒樣中酚類化合物的總含量為131.75~1 856.83 μg/L,總含量最高和最低的酒樣分別是馥郁香型白酒Fuyu-2和豉香型白酒Chi-2。總體而言,白酒中揮發(fā)性酚類化合物含量和種類顯著多于不揮發(fā)性酚類化合物。4種基礎(chǔ)香型白酒中,濃香型白酒的這14種酚類化合物的總含量相對較高,然后依次是醬、米和清香型白酒。衍生香型白酒中,特、鳳、馥郁和芝麻香型白酒中總酚含量較高。不同香型白酒中酚類化合物差異主要是由于白酒生產(chǎn)釀酒原料和釀造工藝不同[6]。
不揮發(fā)性酚類化合物是白酒中的滋味物質(zhì)和健康成分,在不同香型白酒中均有檢出。香草酸在所有酒樣中均有檢出,含量范圍為0.64~18.42 μg/L;有29個酒樣含阿魏酸,含量范圍為1.59~186.56 μg/L;在13個酒樣中檢測到了香豆酸,含量范圍為0.59~9.61 μg/L;沒食子酸和丁香酸分別只在5個酒樣中檢出,含量范圍分別為0.21~1.13 μg/L和0.70~2.95 μg/L;p-羥基苯甲酸和原兒茶酸分別在4個酒樣中檢出,含量分別為0.30~0.86 μg/L和0.34~1.35 μg/L,首次在醬、兼、鳳香型成品白酒中檢出了p-羥基苯甲酸,此前的研究僅從芝麻和老白干香型的原酒中檢測出了p-羥基苯甲酸[20]。醬香型白酒的香豆酸、香草酸和阿魏酸的含量高于其他香型白酒,這結(jié)果與吳子陽等[5]的研究結(jié)果一致。白酒的不揮發(fā)性酚類化合物是釀酒原糧中的酚類物質(zhì)經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化或酶解結(jié)合態(tài)酚類的酯鍵而形成的,其在提升白酒風(fēng)味層次感的同時(shí)還具有抗氧化的作用[21-22]。
揮發(fā)性酚類化合物是白酒風(fēng)味成分的重要組成部分,會影響白酒的品質(zhì)[23]。4種基礎(chǔ)香型白酒中,愈創(chuàng)木酚和4-甲基愈創(chuàng)木酚在醬、清、米香型白酒中均檢測到,濃香型白酒僅在Strong-3中檢測到少量的愈創(chuàng)木酚。愈創(chuàng)木酚具有水果香、花香等氣味特征,其含量范圍為17.04~98.94 μg/L,含量最高的酒樣是醬香型白酒Soysauce-2。4-甲基愈創(chuàng)木酚呈現(xiàn)煙熏風(fēng)味,其含量范圍為19.96~258.13 μg/L,清香型白酒Light-3的含量最高。38個酒樣均含有苯酚,含量為11.80~397.94 μg/L,其中濃香型白酒Strong-6的含量最高,老白干香型白酒Laobaigan-2的含量最低,苯酚可為白酒貢獻(xiàn)酚味[24]。4-乙基愈創(chuàng)木酚主要在醬、清、米、老白干、兼和鳳香型白酒中檢出,其中老白干香型白酒Laobaigan-2含量最高為191.76 μg/L。濃、醬、兼、鳳、特、馥郁、董香型等25個酒樣中檢測到了4-甲基苯酚,是白酒中含量相對較高的酚類成分,其中馥郁香型白酒Fuyu-2中4-甲基苯酚含量最高為1 371.46 μg/L。4-甲基苯酚是白酒中窖泥味的主要來源,在低濃度有助于呈現(xiàn)窖香,但在濃度較高時(shí)具有泥臭味[25]。有32個酒樣中都含有4-乙基苯酚,其含量范圍為1.97~220.16 μg/L,含量最高的酒樣是濃香型白酒Strong-1,而在濃香型白酒Strong-4和Strong-5中未檢出。4-乙基苯酚的閾值為618 μg/L[24],當(dāng)4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚的總含量低于400 μg/L時(shí)可為白酒貢獻(xiàn)革香與煙熏香[12]。與其他6種揮發(fā)性酚類化合物相比較,香蘭素的含量較低,其含量最高的酒樣是米香型白酒Rice-2為62.86 μg/L。香蘭素會為白酒貢獻(xiàn)奶油香、花香、蜜香風(fēng)味[7]。白酒中的揮發(fā)性酚類化合物具有抗氧化和清除自由基等作用[11-12],這些揮發(fā)性成分主要在發(fā)酵中后期生成,其中梭狀芽孢桿菌、甲烷桿菌是產(chǎn)生苯酚、4-甲基苯酚和4-乙基苯酚的主要菌種[10]。
2.3.1 聚類分析
為了更好地分析不同香型白酒酚類化合物的差異,選擇了在各樣品中檢出頻率和含量相對較高的3種不揮發(fā)性酚類和7種揮發(fā)性酚類化合物進(jìn)行分析。對這些酚類化合物的質(zhì)量濃度取對數(shù)后,繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖1。熱圖色塊的顏色從藍(lán)到紅表示酒樣中酚類化合物的含量由低到高,且顏色越藍(lán)表示含量越少,顏色越紅表示含量越多。由圖1可知,38個白酒樣品中酚類化合物的含量有差異,酒樣中苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量相對較高,香草酸和香豆酸的含量較少。根據(jù)酚類化合物在不同酒樣中含量的差異,可以通過聚類分析對酒樣進(jìn)行歸類。由圖1可知,4種基礎(chǔ)香型白酒中,由于清香型和米香型白酒酚類化合物含量比較接近,被進(jìn)一步歸為了一類,可與濃香型和醬香型白酒較好區(qū)分。鳳香型和老白干香型白酒被歸為一類的原因是這兩種香型白酒中苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量分布相近。兼香型和醬香型白酒被可被歸為一類,可能是由于它們的釀造過程中都使用了高溫大曲和堆積發(fā)酵工藝[17],導(dǎo)致其酚類化合物的含量分布較為相同。豉、馥郁、特、濃、董和芝麻香型被歸為一類,這些香型白酒中的4-甲基苯酚含量較高,而其余酚類化合物種類和含量差異較小。同時(shí),有例外的情況是米香型白酒Rice-3、醬香型白酒Soysauce-4和濃香型白酒Strong-2,在與其對應(yīng)香型的聚類分析中呈現(xiàn)離散現(xiàn)象,說明廠家、生產(chǎn)環(huán)境、工藝特征的不同會導(dǎo)致同一香型白酒間存在一定的差異。
圖1 不同香型白酒酚類化合物的聚類分析熱圖Fig.1 Heat map of cluster analysis of phenols in different flavor types of Baijiu
2.3.2 主成分分析
主成分分析是能夠?qū)⒍鄠€數(shù)據(jù)信息濃縮,并保留數(shù)據(jù)大量信息的分析方法[26],38個酒樣中酚類化合物含量主成分載荷矩陣結(jié)果見表4。
表4 不同香型白酒中酚類化合物主成分載荷矩陣Table 4 Principal component loading matrix of phenols in different flavor types of Baijiu
由表4可知,3個主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.33%,說明前3個主成分基本包含了白酒種酚類化合物組成的大部分信息,可用于分類與綜合貢獻(xiàn)評價(jià)。在前3個主成分中,PC1的貢獻(xiàn)率為35.88%,主要綜合了4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚的信息;PC2的貢獻(xiàn)率為22.48%,其中貢獻(xiàn)最大的是香豆酸,對應(yīng)的特征值為0.52;PC3的貢獻(xiàn)率為13.97%,其中貢獻(xiàn)最大的4-乙基苯酚,對應(yīng)的特征值為0.64。
以3個主成分PC1、PC2和PC3及其方差貢獻(xiàn)率建立綜合得分模型PC綜合,其中PC綜合是因變量,PC1、PC2和PC3是自變量,它們的線性組合方程是:PC綜合=35.88% PC1+22.48%PC2+13.97%PC3。12種香型白酒的各主成分得分值和綜合得分值見表5。
表5 12種香型白酒主成分得分值和綜合得分值Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of 12 flavor types of Baijiu
由表5可知,在PC1中得分絕對值最高的是老白干型白酒Laobaigan-2,為3.93;PC2中醬香型白酒Soysauce-5的得分絕對值最高,為3.58;PC3中得分絕對值最高的是濃香型白酒Strong-1,為2.29。綜合得分絕對值越高代表酚類化合物對該酒樣分類的綜合貢獻(xiàn)越大,清、米、老白干、特、馥郁和董香型白酒以及醬香型、濃香型中部分酒樣的綜合得分絕對值相對較高,說明這些香型白酒通過酚類化合物含量的差異能實(shí)現(xiàn)很好的分類,而兼、鳳、豉和芝麻香型白酒的綜合得分絕對值相對較低,分類效果相對較差。
以PC1的載荷值為x軸,PC2為y軸作圖得到主成分載荷和得分雙重圖,見圖2。
圖2 12種香型白酒酚類化合物的主成分載荷和得分雙重圖Fig.2 Principal component loading and score dual plots of phenols in 12 flavor types of Baijiu
由圖2可知,PC1中4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯酚和4-甲基苯酚的載荷系數(shù)絕對值較高,PC2中香草酸、香豆酸、香蘭素和愈創(chuàng)木酚的載荷系數(shù)絕對值較高。同一香型白酒的不同酒樣分布相對集中,4種基礎(chǔ)香型白酒可實(shí)現(xiàn)初步歸類,與聚類分析結(jié)果是一致的。米香型白酒有2個酒樣在第1象限,還有1個米香型酒樣分布在第4象限,離清香型白酒分布較近,影響其分布的主要成分是4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚。醬香型白酒分布在第1和第2象限,與其他香型白酒的距離較遠(yuǎn),影響其分布的特征酚類化合物是香草酸、香豆酸、香蘭素和愈創(chuàng)木酚。特香型和兼香型白酒主要分布在第2象限,其中兼香型在y軸方向處于醬香型和濃香型白酒中間,影響這2種香型白酒分布的特征酚類化合物是苯酚。濃、董、芝麻、馥郁和豉香型白酒主要分布在第3象限,4-甲基苯酚是影響它們分布的特征酚類化合物。鳳香型和老白干香型白酒分布在第4象限,距離清香型白酒的分布相對較近,4-乙基苯酚是影響其分布的特征酚類化合物。通過主成分分析可以找到影響不同香型白酒分布的特征酚類化合物,進(jìn)而解析不同香型白酒間的相似性和差異性。
運(yùn)用LC-MS和GC-MS建立7種不揮發(fā)性和7種揮發(fā)性酚類化合物的檢測方法,在檢測范圍內(nèi)各酚類化合物的線性相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.997,檢出限為0.62~6.42 μg/L,定量限為1.44~12.25 μg/L,日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD≤4.11%,日間精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD≤8.98%,加標(biāo)回收率范圍為86.50%~104.35%,可用于白酒中酚類化合物的分析。對12種香型38個白酒樣品的分析結(jié)果表明,白酒中揮發(fā)性酚類化合物的種類和含量較不揮發(fā)性酚類化合物多,不同香型白酒的酚類化合物組成和含量有較為明顯的差異,濃香型及其相關(guān)衍生香型白酒的總酚含量相對較高,其中馥郁香型白酒Fuyu-2的總酚含量最高為1 856.83 μg/L。阿魏酸較其他不揮發(fā)性酚類化合物在白酒中的含量更高,范圍為1.59~186.56 μg/L,且首次在醬、兼、鳳香型成品白酒中檢測到p-羥基苯甲酸。4-甲基苯酚是白酒中含量相對較高的揮發(fā)性酚類化合物,香蘭素的含量相對較低。多元統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明,根據(jù)酚類化合物在不同酒樣中含量的差異,可以實(shí)現(xiàn)不同香型白酒的初步歸類,由于清香型和米香型白酒酚類化合物的含量比較接近,影響它們分布的特征酚類化合物是4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚,在進(jìn)一步分類中被歸為一類。濃香型和醬香型白酒的區(qū)分度較好,影響醬香型分布的特征酚類化合物是香草酸、香豆酸、香蘭素和愈創(chuàng)木酚。濃、董、特、芝麻、馥郁和豉香型在進(jìn)一步分類時(shí)被歸為一類,影響它們分布的特征酚類化合物是4-甲基苯酚。白酒中酚類化合物準(zhǔn)確的定量分析可為白酒風(fēng)味和健康的研究提供數(shù)據(jù)支持,再進(jìn)一步結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可以找到區(qū)分不同香型白酒特征酚類化合物,為白酒品質(zhì)研究提供理論依據(jù)。