周天碩，趙家圓,2，孟彩云，李艷青，李 鶴*，韓 齊,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省安心食品集團有限責(zé)任公司，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

發(fā)酵肉制品是指原料肉經(jīng)微生物發(fā)酵（主要是乳酸菌及酵母菌等）和酶共同作用下發(fā)生一系列物理、化學(xué)及生物變化，最終形成具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的一類肉制品[1]，具有高營養(yǎng)、高品質(zhì)、風(fēng)味獨特及貯存期長等優(yōu)點。肉制品發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性和降解，生成醇類、酸類、氨基酸、短肽、肽段等大量生物活性成分，有助于提高蛋白質(zhì)的吸收率，加快人體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用[2-3]。本文主要闡述發(fā)酵肉制品中的生物活性肽及其制備方法。

1 生物活性肽

生物活性肽是一類對人體有益或具有特定生理功能的肽類化合物[4]，分子質(zhì)量一般小于6 000 Da，由20 種天然氨基酸按照不同的排列方式組成，一般長度為2～30 個氨基酸[5]，易消化吸收，是對人機體具有積極影響的特定蛋白質(zhì)片段[6]，對人體的生理代謝活動具有多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化、降血壓、降血脂等[7-8]。

生物活性肽的功能活性取決于其結(jié)構(gòu)，如氨基酸的組成、N端和C端氨基酸的類型、肽鏈的長度、氨基酸的電荷特性、疏水和親水性及空間結(jié)構(gòu)等。例如，C端氨基酸的結(jié)構(gòu)可影響對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制活性，當(dāng)C端氨基酸為芳香族氨基酸時，其抑制活性最高。N端為疏水性氨基酸或堿性氨基酸時的抑制活性較高，脯氨酸除外。根據(jù)氨基酸序列的不同，這些肽可能在體內(nèi)發(fā)揮多種不同的活性作用，從而影響心血管、內(nèi)分泌、消化、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)等[9]。迄今為止，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗血栓、阿片類、礦物質(zhì)結(jié)合、抗氧化、抗高血壓及降膽固醇等功能的生物活性肽已在一系列食品中發(fā)現(xiàn)。

2 發(fā)酵肉制品中多肽的生物活性

2.1 抗氧化活性

肉類蛋白一直以來都被認(rèn)為是獲得抗氧化肽的良好來源，因為肉類蛋白中含有大量必需氨基酸，可滿足人體生長所需。大量研究表明，從肌肉蛋白源中得到的生物活性肽具有抗氧化活性。此外，還有大量研究發(fā)現(xiàn)大部分肉類副產(chǎn)物，如皮、骨頭、血液等也具有一定的生理活性。谷胱甘肽是一種含γ-酰胺鍵和巰基，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，具有抗氧化作用，廣泛分布于動植物中[10]。谷胱甘肽在未加工的肉中含量為50～200 mg/kg[11]。Chen Wei等[12]發(fā)現(xiàn)，磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶是肌肉組織中重要的抗氧化酶，對肉類品質(zhì)性狀和抗氧化離子機制起著重要作用。天然肌肽一般大量存在于動物的肌肉和腦組織中。Bellia等[13]研究證實，肌肽具有較好的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)在畜類肉源中以豬、牛、羊為代表的肌肉中含較高含量的肌肽。葉春等[14]以酸肉為原材料，提取酸肉中的活性肽并對其抗氧化能力進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取的活性肽對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有良好的清除能力，半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為247.96 μg/mL，是抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）的4.97 倍，對羥自由基也具有較好的清除能力，IC50為33.60 μg/mL，是BHT的1.52 倍。吳寶森等[15]從諾鄧火腿中分離得到具有抗氧化活性的肽，通過體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，分離得到的組分C3體外抗氧化活性最強，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力分別可以達(dá)到73.01%、51.21%和65.23%。通過研究發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸及氨基酸序列對肽的抗氧化活性起著至關(guān)重要的作用[16]。

2.2 ACE抑制活性

ACE抑制肽是一種存在于蛋白質(zhì)中的生物活性肽，根據(jù)作用機理可將ACE抑制肽分為3 類[17]：1）底物型肽，是一種能被ACE水解成活性或非活性肽的肽段，只具有少量的抑制活性；2）真抑制型肽，是一種具有抑制能力的肽，不受其他因素的影響，即真正能夠抑制酶的反應(yīng)；3）藥物前抑制劑，這種肽是ACE或消化酶的底物，水解后釋放抑制劑，從而起到抑制作用。Arihara等[18]從家畜肌肉蛋白（豬骨骼肌蛋白的熱裂解酶）中提取并鑒定出2 種ACE抑制肽（肌肽A和肌肽B），2 種ACE抑制肽在肌球蛋白重鏈的一級結(jié)構(gòu)中存在。研究結(jié)果表明，肌肉蛋白經(jīng)酶解可產(chǎn)生ACE抑制活性。Dellafiora等[17]通過將成熟18、24 個月的帕爾馬干腌火腿體外消化，從中得到部分生物活性肽，經(jīng)檢測已確認(rèn)為ACE抑制肽。韓冬雪[19]從牛里脊肉中分離出具有ACE抑制活性的多肽，同時具有抗高血壓生物活性。李星云等[20]的研究表明，酶解法水解豬骨骼肌蛋白可產(chǎn)生ACE抑制肽，發(fā)酵豬肉制品中也可以產(chǎn)生具有ACE抑制活性和抗高血壓功效的肽。丁苗[21]從發(fā)酵20 d的酸肉中提取得到粗肽并分離純化，得到具有較高活性的ACE抑制劑，ACE抑制率為59.18%，肽含量為86.54%，同時發(fā)現(xiàn)酸肉ACE抑制肽具有很強的吸濕性和較強的pH值穩(wěn)定性，但高溫處理后，ACE抑制肽活性下降。

2.3 抗菌活性

抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)外源物質(zhì)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的具有生物活性的小分子多肽，由12～60 個氨基酸殘基構(gòu)成，大多數(shù)抗菌肽具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌等特點[22-23]，是一類普遍存在于生物體內(nèi)的小分子多肽，可從肌肉、肝臟及血液中分離出來[24]。天然生物抗菌肽具有抑菌效果好、不易產(chǎn)生耐藥性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點?？咕淖鳛樘烊槐ｕr劑對人體健康無害，是繼冷藏保鮮和氣調(diào)保鮮后的第3代保鮮技術(shù)。劉輝[25]利用抑耐冷菌乳酸菌抗菌肽對肉制品的保鮮進(jìn)行研究，從乳酸菌發(fā)酵液中分離純化得到2 種抗菌肽，均可以有效抑制熒光假單胞菌，并且抗菌肽活力越高，保鮮效果越好。清酒乳桿菌清酒亞種2a[26]是從巴西豬肉香腸中分離得到的一種具有抗菌功能的乳酸菌，其產(chǎn)生的抗菌肽（細(xì)菌素）能夠抑制重要食源性致病菌的生長，研究發(fā)現(xiàn)，將提取出的抗菌肽在室溫（30 ℃）和冷藏條件（7 ℃）下培養(yǎng)24 h后，能有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長，在冷藏條件下，病源性微生物經(jīng)抗菌肽處理5 d后失活。

2.4 神經(jīng)活性

目前，在發(fā)酵肉制品中對于神經(jīng)活性肽的研究還比較少。因為神經(jīng)活性肽，如阿片樣肽（內(nèi)啡肽和腦啡肽等）、舒緩激肽等一般存在于動物的胰腺及大腦中。Ianzer等[27]從動物大腦中分離出阿片樣肽類似物，通過實驗發(fā)現(xiàn)這類肽具有一定的神經(jīng)活性，還能夠加強血管舒緩激肽活性。因此猜測這是由于阿片樣肽序列存在于肌肉蛋白質(zhì)氨基酸序列上，所以肌肉中也可能產(chǎn)生阿片樣肽，目前有待研究。

3 發(fā)酵肉制品中生物活性肽的制備方法

目前關(guān)于生物活性肽的制備方法主要分為3 類[28]：提取法、合成法和降解法。提取法可分為化學(xué)提取和物理提取。合成法又可分為化學(xué)合成法和基因重組法。降解法分為酶解法和發(fā)酵法。發(fā)酵肉制品一般采用降解法來制備生物活性肽，即酶法混合微生物發(fā)酵法制備生物活性肽。一些研究嘗試?yán)没蛑亟M技術(shù)獲得特定表達(dá)的活性肽，但目前該方法尚在實驗中。

3.1 酶解法

蛋白水解酶的分類方法有多種，根據(jù)蛋白酶活性部位的性質(zhì)可分為4 類[29]：絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。根據(jù)生理功能又可分為非限制性水解蛋白酶和限制性水解蛋白酶。根據(jù)國際酶學(xué)委員會分類，蛋白水解酶屬于3.4亞類，可分為肽段內(nèi)切酶和外肽酶[30]。

Koohmaraie[31]將蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)概括為4 種，分別為鈣激活中性蛋白酶水解、組織蛋白酶水解、蛋白酶體水解和半胱天冬酶水解。卜冬冬等[32]以薩拉米為原料進(jìn)行酶法水解，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶的酶解效果最佳，水解度為11.0%；木瓜蛋白酶的酶解效果次之，水解度為9.7%；復(fù)合酶的酶解效果優(yōu)于單個酶的酶解效果，水解度為12.9%。并且溫度對蛋白酶的活性具有較大影響，隨著酶解溫度的增加，水解度先升高后降低，這是因為當(dāng)溫度較高時，部分酶失活，導(dǎo)致水解不完全。

3.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶將底物蛋白水解成不同的生物活性肽。目前，常采用的微生物有側(cè)孢短芽孢桿菌、植物乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌等[33-36]，底物蛋白主要為豬肉的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白等[36]。Castellano等[36]對豬肉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵降解，結(jié)果表明，乳桿菌能夠降解肌肉蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有ACE抑制活性的活性肽，通過釋放ACE抑制肽，可產(chǎn)生降壓效果；清酒乳桿菌CRL1862和彎曲乳桿菌CRL705產(chǎn)生的生物活性肽均可用于開發(fā)生理功能食品。

3.3 酶解法-微生物發(fā)酵法復(fù)合

蛋白質(zhì)是肉制品的重要組成成分，其在加工和貯藏中發(fā)生的生物化學(xué)變化對肉制品品質(zhì)有關(guān)鍵性影響，酶法水解和微生物發(fā)酵法是發(fā)酵肉制品中制備生物活性肽的主要方法。利用蛋白酶制劑水解蛋白質(zhì)并分離純化得到生物活性肽，其產(chǎn)品安全性高、生產(chǎn)條件溫和、水解過程易控制、可定位生產(chǎn)特定的肽、成本低，同時還具有良好的溶解性、耐酸、耐熱及較高的速溶性等優(yōu)點[37]。利用微生物發(fā)酵降解蛋白得到的生物活性肽，具有菌體蛋白互相利用提供能量、合成小肽、修飾某些功能基團等優(yōu)點[38]。除此之外，微生物代謝是一個復(fù)雜的降解體系，可以合成多種復(fù)雜的初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物[39]，制備得到的生物活性肽水解度更高[40]。2 種降解方式共同作用，可彌補單一方法存在的不足。

發(fā)酵肉制品蛋白質(zhì)的降解是內(nèi)源蛋白酶和微生物共同作用的結(jié)果。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)酸導(dǎo)致內(nèi)源酸性蛋白酶活性增加，促使微生物胞外酶、蛋白酶等降解蛋白質(zhì)[41-42]，生成一些多肽、小肽、氨基酸、醛、有機酸和胺類等物質(zhì)，這些都是發(fā)酵肉制品特殊風(fēng)味和質(zhì)地形成的主要因素[43-44]。除此之外，陳倩等[45]在肉制品發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝產(chǎn)物可促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，植物乳桿菌能降解肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，清酒乳桿菌可分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸，賦予產(chǎn)品特有的鮮酸味[46]。

4 生物活性肽的純化方法

蛋白質(zhì)降解后的產(chǎn)物是多肽混合物，因此對混合物進(jìn)行分離提純至關(guān)重要。最常見的肽類純化方法有超濾、反相高效液相色譜、凝膠過濾層析及離子交換色譜等。

超濾是一種膜分離技術(shù)，通過壓力作用使混合肽按照分子質(zhì)量通過一定孔徑的薄膜，小分子肽通過薄膜[47]，而大分子肽遺留在薄膜上，從而分離出所需要分子質(zhì)量的肽。超濾方法簡單、成本低、常溫下即可操作，但如混合物中雜質(zhì)過多會導(dǎo)致超濾薄膜堵塞，需要經(jīng)常清洗，且不適用于分離分子質(zhì)量大小相近的混合肽。反相高效液相色譜常用于多肽類和其他代謝產(chǎn)物的特性分析中，它是利用極性介質(zhì)作為固定相進(jìn)行離子交換的一種方法，不同規(guī)格色譜適應(yīng)不同肽類，且柱容量較大，分離效果強，但分離過程中色譜柱容易被堵塞，因此會導(dǎo)致分離結(jié)果出現(xiàn)誤差[48-49]。凝膠過濾層析法是根據(jù)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行的一種分離方法，多用于分離純化水溶性大分子物質(zhì)，不需要有機溶劑，具有較好的分離效果和較高的回收率[50]。離子交換色譜是利用溶質(zhì)分子攜帶不同性質(zhì)的電荷和不同的電荷量從而實現(xiàn)分離的一種色譜技術(shù)[51]，它具有可控性、多選擇性、可濃縮性、高載量和高回收率，通過相反電荷之間的相互作用實現(xiàn)離子交換，因此可通過調(diào)節(jié)pH值來控制選擇性。

都榮強等[52]采用膜超濾法分離由胰蛋白酶、風(fēng)味酶、混合酶酶解肌肉蛋白所得酶解液，發(fā)現(xiàn)酶解液中各組分的呈味強度均隨肽分子質(zhì)量的減小而增強，當(dāng)肽分子質(zhì)量小于3 kDa時，味鮮醇厚，特別是小于1 kDa的肽鮮味最強；同時利用Sephadex G-15凝膠色譜分離，通過高效凝膠液相色譜、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析，確定從胰蛋白酶酶解液中分離得到的鮮味肽組分。

Kang等[53]采用反相高效液相色譜法對牛肉酶解物進(jìn)行分離純化，得到多種風(fēng)味肽。胡亞亞[54]采用凝膠層析法對火腿粗肽液進(jìn)行簡單分離，并對各組分清除自由基的能力進(jìn)行測定。結(jié)果表明，當(dāng)火腿粗肽液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，超氧陰離子自由基清除率為49%，DPPH自由基清除率為38%。戴璐瑤等[55]利用反相高效液相色譜紫外檢測與離子交換色譜電導(dǎo)檢測2 種方法對牛肉中肌肽進(jìn)行一致程度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反相高效液相色譜法與離子交換色譜方法均能較好地對樣品中的肌肽進(jìn)行定性和定量分析。郭鑫杰[56]、姚婷婷[57]等均通過離子交換層析法對抗菌肽進(jìn)行純化，從而得到高純度的抗菌肽。

5 結(jié) 語

肉及肉制品中的蛋白質(zhì)含有多種有利于人體健康的生物活性肽，其功能特性包括抗氧化、降血壓、降血脂、抗血栓、抑菌、神經(jīng)調(diào)節(jié)等多方面。由于其具有多種優(yōu)勢而受到越來越多國內(nèi)外研究人員的關(guān)注，國外研究人員對生物活性肽在醫(yī)療方面的應(yīng)用給予極高的肯定，特別是對過敏反應(yīng)，因為其可能保留部分前體蛋白過敏活性，并且生物活性肽還具備成為治療非傳染性疾?。ㄈ绺哐獕汉兔庖咝约膊。┑臐撛谒幬颷58]。

我國對生物活性肽的研究，尤其是肉制品中生物活性肽的研究相對較少，因此肉源生物活性肽的發(fā)展還有很大空間。且現(xiàn)階段多數(shù)國內(nèi)研究都僅限于活性肽功能特性的體外評估，不足以評估其消化后在人體中的活性。在作為功能性成分使用之前，有必要對其在體內(nèi)的療效、劑量反應(yīng)和安全性進(jìn)行評估。所以，在未來，我國研究人員應(yīng)加強生物活性肽在應(yīng)用方面的研究，深入研究以益生菌為發(fā)酵劑發(fā)酵的肉制品中可能產(chǎn)生的生物活性肽。